獼猴桃籽油微膠囊在Caco-2單細(xì)胞層的吸收特性

徐姍姍 ，馬永慶，王憬，谷瑞增，劉文穎*

1. 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（寧波 315832）；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

獼猴桃是獼猴桃科多年生藤本植物果實(shí)的總稱(chēng)，是一類(lèi)形態(tài)特別、風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的特色水果。作為獼猴桃加工的副產(chǎn)品，獼猴桃籽含油量在23.50%～28.85%之間，獼猴桃籽油中α-亞麻酸含量高達(dá)63.99%[1-2]。α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，只能通過(guò)飲食攝取。作為一種多元不飽和脂肪酸，α-亞麻酸極易受空氣中的光、氧、水分等環(huán)境因素影響發(fā)生氧化變質(zhì)。油脂經(jīng)過(guò)微膠囊化，可使其免受外界因素影響，能有效解決油脂貯存問(wèn)題[3-4]。

玉米肽是從天然食品玉米中提取的玉米蛋白，經(jīng)適度水解而獲得的小分子肽物質(zhì)。其天然安全，易被人體吸收，并具有抗氧化、降血壓等特殊的生理功能[5-6]。目前，國(guó)內(nèi)外采用食源性肽作為包埋壁材的研究還較為鮮見(jiàn)。以玉米肽作為壁材，既可發(fā)揮其抗氧化活性保護(hù)芯材的作用，本身也可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易于被機(jī)體吸收。

此次試驗(yàn)以玉米肽為壁材，以獼猴桃籽油為芯材，制備獼猴桃籽油微膠囊，并首次對(duì)其在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特性進(jìn)行研究，以期為玉米肽的應(yīng)用開(kāi)拓新的思路，為亞麻酸產(chǎn)業(yè)和獼猴桃產(chǎn)業(yè)的深入開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

獼猴桃籽油（吉安市青原區(qū)綠源天然香料油提煉廠，經(jīng)超臨界CO2萃取制得）；玉米黃粉（北京中食海氏生物技術(shù)有限公司）；石油醚、甲醇、三氯甲烷、NaOH（北京化工廠，分析純）；吐溫-20（天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所）；MEM（Minimum Essential Medium）培養(yǎng)基（美國(guó)Life Technologies公司）；FBS（超濾胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素鏈霉素溶液（雙抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DMSO（二甲基亞砜，分析純，西隴化工股份有限公司）；MTT（四甲基偶氮唑鹽，美國(guó)Sigma公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JB-1A磁力攪拌器（上海精科儀器有限公司）；YC-1000噴霧制粒包衣機(jī)（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；LG10-2.4A離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；T25 Digital高速分散機(jī)（上海珂淮儀器有限公司）；Cell Zscope全自動(dòng)跨膜電阻測(cè)量?jī)x（英國(guó)Nano Analysis公司）；Thermo Hera Cell 240i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；AccuriC6流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 玉米肽的制備

臨床中房顫與血栓栓塞性事件密切相關(guān)，血栓栓塞也是非瓣膜性房顫患者發(fā)生殘疾與死亡的重要原因之一，故血栓栓塞也是治療房顫的重要目標(biāo)。

將玉米黃粉溶解于蒸餾水中（質(zhì)量濃度8%），經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，用NaOH調(diào)整pH至8.5，放入50 ℃水浴鍋中。以每克原料3 000單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h，再調(diào)節(jié)pH至7.0，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。然后于100 ℃滅酶15 min。再用離心機(jī)以5 000g離心10 min，取上清液。用截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000 U的超濾膜超濾，得到相對(duì)分子質(zhì)量＜1 000 U的濾過(guò)液，進(jìn)行噴霧干燥，最終得到玉米肽干粉。

1.2.2 獼猴桃籽油微膠囊的制備

采用噴霧干燥法[7]。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的玉米肽粉溶解于蒸餾水中，加入獼猴桃籽油（芯材壁材比為1∶2）和0.5%的吐溫-20，固形物濃度為15%。在60 ℃恒溫水浴鍋中以500 r/min攪拌20 min，然后用高速分散機(jī)以6 000 r/min剪切乳化，形成穩(wěn)定的乳狀液。最后于160 ℃進(jìn)行噴霧干燥，得到獼猴桃籽油微膠囊。

1.2.3 獼猴桃籽油微膠囊包埋率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g獼猴桃籽油微膠囊于加塞三角瓶中，加入15 mL石油醚，振蕩3 min，用離心機(jī)以6 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，合并上清液，濃縮后置于干燥的表面皿中，石油醚揮干后，用減重法得到獼猴桃籽油微膠囊表面油含量（m1）。

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g獼猴桃籽油微膠囊于加塞三角瓶中，加入7.5 mL甲醇，超聲振蕩5 min后，加入17.5 mL三氯甲烷，超聲振蕩5 min，過(guò)濾后用三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）將溶液混合，倒入已恒質(zhì)量的燒杯中，蒸干溶劑，冷卻5 h，用減重法得到獼猴桃籽油微膠囊總油含量（m2）。微膠囊包埋率按式（1）計(jì)算。

1.2.4 獼猴桃籽油微膠囊的感官評(píng)價(jià)

1.2.5 獼猴桃籽油微膠囊的理化性質(zhì)

水分含量的測(cè)定，參照GB 5009.3—2016[8]測(cè)定水分含量；參考文獻(xiàn)[9]的方法測(cè)定堆密度；參照GB 5413.29—2010[10]測(cè)定溶解度。

1.2.6 MTT法

將細(xì)胞復(fù)蘇并在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳2～3代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，用胰酶裂解液對(duì)其消化，制得單細(xì)胞懸液，并用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至所需濃度1×105cell/mL，并接種于96孔板上，每孔加100 μL細(xì)胞液。培養(yǎng)24 h后，即細(xì)胞單層貼壁后，棄掉板內(nèi)培養(yǎng)基。加入8個(gè)濃度的試驗(yàn)樣品，每孔100 μL，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基將樣品稀釋至所需濃度，空白對(duì)照也采用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。倒掉孔中培養(yǎng)液，在每孔中加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 h后，去掉孔內(nèi)上清液，向加有細(xì)胞液的孔中加入100 μL DMSO，平行適度振蕩96孔板，使胞內(nèi)的紫色結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490 nm進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞增殖率按式（2）計(jì)算。

1.2.7 Caco-2單細(xì)胞層的建立

將Caco-2細(xì)胞用含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞接近80%融合時(shí)，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋為1×105cell/mL，接種于6孔Transwell板的上側(cè)，下側(cè)加入2.5 mL完全培養(yǎng)基，每隔1 d換液1次，直到細(xì)胞分化成單層細(xì)胞。通過(guò)跨膜電阻儀檢測(cè)細(xì)胞完整性，當(dāng)跨膜電阻達(dá)到400 Ω/cm2時(shí)，細(xì)胞可用于轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

1.2.8 獼猴桃籽油微膠囊在Caco-2細(xì)胞中的吸收

Caco-2細(xì)胞在Transwell板上形成緊密完整的細(xì)胞單層后，用PBS沖洗板中各孔室的細(xì)胞3次，然后在每個(gè)孔室中加入1 mL的PBS，并放入37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，吸棄細(xì)胞膜表面的附著物、培養(yǎng)基質(zhì)和PBS緩沖液。用PBS將獼猴桃籽油微膠囊稀釋至高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（100，200和400 μg/mL），用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。樣品液從AP側(cè)至BL側(cè)的過(guò)膜試驗(yàn)操作：在AP側(cè)加入250 μL樣品液，BL側(cè)加600 μL的PBS，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后分別在BL側(cè)中收集500 μL過(guò)膜液，每組3個(gè)復(fù)孔。采用氣相色譜檢測(cè)2 h后下方濾液中的樣品濃度，計(jì)算微膠囊的表觀滲透系數(shù)Papp和生物利用率，按式（3）和（4）計(jì)算。

式中：dQ/dt為單位時(shí)間樣品轉(zhuǎn)運(yùn)量，μg/s；A為轉(zhuǎn)運(yùn)膜面積，此時(shí)A為1.12 cm2；C0為樣品的初始濃度，μg/L。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)做3次，采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 獼猴桃籽油微膠囊的感官評(píng)價(jià)和理化性質(zhì)

試驗(yàn)所得的獼猴桃籽油微膠囊為淡黃色粉末狀固體，無(wú)結(jié)塊、雜質(zhì)，有香氣。包埋率為93.96%，水分含量為3.28%，水分含量較低，較為干燥，易于保存。堆密度為0.22 g/cm3，這表明微膠囊產(chǎn)品間空隙大，流動(dòng)性好。溶解度在95%以上，溶解性和復(fù)溶性能良好。

2.2 微膠囊對(duì)細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法測(cè)定不同濃度獼猴桃籽油微膠囊產(chǎn)品對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。在10，20，40，80，100，200，400和800 μg/mL 8個(gè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖率均大于80%，可認(rèn)為微膠囊產(chǎn)品對(duì)Caco-2細(xì)胞均沒(méi)有顯著的毒害作用（p＜0.01）[11]，其中微膠囊溶液質(zhì)量濃度為10和20 μg/mL時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增殖有一定抑制作用，但無(wú)顯著性差異；隨著樣品濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用呈線性關(guān)系；當(dāng)作用質(zhì)量濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)124%。綜合考慮產(chǎn)品的細(xì)胞毒理學(xué)，最終采用100，200和400 μg/mL的質(zhì)量濃度作為Caco-2細(xì)胞吸收試驗(yàn)的作用濃度。

圖1 微膠囊對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

2.3 Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果分析

如圖2所示，經(jīng)過(guò)1 d培養(yǎng)，細(xì)胞為不規(guī)則的扁形，呈片狀分布；培養(yǎng)至20 d時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)均勻，形態(tài)完整，無(wú)白泡，細(xì)胞之間連接緊密，呈“鋪路石”狀，具有明顯上皮細(xì)胞特征。但細(xì)胞是否形成了致密單層膜，還需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 Caco-2細(xì)胞在Transwell板上培養(yǎng)單層膜形態(tài)圖

2.4 Caco-2細(xì)胞模型TEER值測(cè)定

如圖3所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Caco-2細(xì)胞單層的TEER值逐漸變大。初始的1周增長(zhǎng)平緩，隨后增加變快，當(dāng)培養(yǎng)到13～14 d時(shí)，TEER值接近300 Ω·cm2，說(shuō)明Caco-2細(xì)胞已分化完全，可以用于小腸吸收試驗(yàn)。此次試驗(yàn)中，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)21 d后用于試驗(yàn)，TEER值＞400 Ω·cm2?；谏鲜鲋笜?biāo)結(jié)果，此次試驗(yàn)建立的Caco-2細(xì)胞模型在細(xì)胞形態(tài)學(xué)和跨膜電阻值方面均符合要求，與小腸上皮細(xì)胞相似，可以利用此模型進(jìn)行吸收試驗(yàn)。

2.5 微膠囊在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收

基于MTT試驗(yàn)結(jié)果，選擇100，200和400 μg/mL的微膠囊溶液濃度進(jìn)行吸收試驗(yàn)。向AP側(cè)小室加入樣品液，與分化的細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)，收集BL側(cè)透過(guò)細(xì)胞單層的濾液，進(jìn)行氣相色譜分析，根據(jù)峰面積得出濾液濃度，計(jì)算生物利用度。

在2 h觀察利用Caco-2單層細(xì)胞模擬小腸吸收模型對(duì)微膠囊的吸收情況，分析0 h和細(xì)胞吸收后（2 h）氣相色譜圖的變化，計(jì)算產(chǎn)品的Papp和生物利用率。由圖4可知：獼猴桃籽油微膠囊的生物利用率與濃度呈負(fù)相關(guān)，在高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度下生物利用率均高于25%。當(dāng)微膠囊質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，生物利用率達(dá)到最高，為41.70%±1.65%，此濃度下從AP側(cè)到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù)為2.8×10-7cm·s-1，在1×10-7～1×10-6cm·s-1之間，說(shuō)明微膠囊的吸收水平較好。獼猴桃籽油中主要成分亞油酸和α-亞麻酸屬于長(zhǎng)鏈脂肪酸，需要與細(xì)胞中的脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)（FABP）結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酯化[12]，再經(jīng)淋巴入血，需要一定的吸收時(shí)間。

圖3 Caco-2細(xì)胞跨膜電阻值隨時(shí)間變化

圖4 微膠囊的生物利用率（p＜0.05）

3 結(jié)論

以玉米肽為壁材，以獼猴桃籽油為芯材，采用噴霧干燥法，制備獼猴桃籽油微膠囊。采用MTT法，考察獼猴桃籽油微膠囊對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖的影響，以確定吸收試驗(yàn)選用的樣品濃度。當(dāng)微膠囊質(zhì)量濃度較低時(shí)，其對(duì)Caco-2細(xì)胞有較低的抑制作用。隨著質(zhì)量濃度的上升，100～400 μg/mL的樣品對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且呈線性相關(guān)。建立Caco-2單層細(xì)胞模型，模擬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行體外吸收研究。經(jīng)過(guò)21 d的培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)接近上皮細(xì)胞，TEER值大于400 Ω·cm2，表明Caco-2細(xì)胞分化形成了完整致密的單層結(jié)構(gòu)。加入100，200和400 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品液，采用氣相色譜，測(cè)定微膠囊產(chǎn)品通過(guò)細(xì)胞單層的濃度，計(jì)算其表觀滲透系數(shù)Papp和生物利用率。結(jié)果顯示，在高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度下微膠囊的生物利用率均高于25%。當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，微膠囊的生物利用率達(dá)到最高，為41.70%±1.65%，從AP側(cè)到BL側(cè)的Papp系數(shù)在1×10-7～1×10-6cm·s-1之間，說(shuō)明微膠囊的吸收水平較好。此次試驗(yàn)為玉米肽的應(yīng)用開(kāi)拓了新的思路，為亞麻酸產(chǎn)業(yè)和獼猴桃產(chǎn)業(yè)的深入開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。