黃棒菜超氧化物歧化酶 (SOD) 分離純化的技術(shù)

徐璐，趙秩顥，鄭彩霞

北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（北京 102442）

黃棒菜（Rheum palmatumL. var.）是蓼科、酸模屬的多年生草本植物，為掌葉大黃（Rheum palmatumL.）的改良品種，由北京天力宏泰科技發(fā)展有限公司培育并投入市場(chǎng)。黃棒菜耐寒耐旱、耐鹽堿、耐瘠薄，適宜種植區(qū)域廣泛；速生高產(chǎn)，生長(zhǎng)最快時(shí)每晝夜可達(dá)7～10 cm，一次播種可穩(wěn)定高產(chǎn)20年；營(yíng)養(yǎng)成分豐富，每100 g植物粉含有蛋白質(zhì)25 g、纖維素29 g、葉綠素821 mg、維生素E 888 mg，作為牧區(qū)飼草推廣使用；超氧化物歧化酶（SOD）含量高，每克酶活力達(dá)14.17 U，具有作為SOD提取原料的巨大潛力[1]。

SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的核編碼酸性金屬酶[2-3]，可分為3種類型：Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD[3-4]。作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[5-6]，SOD可催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，清除體內(nèi)活性氧（ROS），抑制腫瘤、癌癥等疾病誘發(fā)[7-8]。在食品、化妝品、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中SOD應(yīng)用廣泛[9-10]。中國(guó)多以動(dòng)物血液生產(chǎn)SOD，其成本高、安全性差，且存在致熱因子、病毒等污染物殘留的風(fēng)險(xiǎn)[2,11]，因此尋找生產(chǎn)SOD的植物來(lái)源具有重要意義。由于黃棒菜安全性高、成本低且SOD含量豐富，試驗(yàn)以其為材料，研究提取SOD的最佳條件并建立SOD分離純化的技術(shù)體系，為黃棒菜進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃棒菜（Rheum palmatumL. var.）-80 ℃貯存干葉及新鮮葉莖、葉片（北京天力宏泰科技發(fā)展有限公司）。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮、磷酸、乙醇、鹽酸、甘油、溴酚藍(lán)、冰醋酸（北京化工廠）；乙二胺四乙酸二鈉、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、TEMED（北京拜爾迪生物公司）；牛血清白蛋白（Ⅴ）（北京紅星生化技術(shù)公司）；TCA（山東西亞化學(xué)股份有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250（上?；瘜W(xué)試劑公司）；L-甲硫氨基酸（上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材公司）；β-巰基乙醇（杭州弗德生物科技有限公司）；NBT（BAIGEN）；核黃素（SBH-bio）；APS、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Amresco）；考馬斯亮藍(lán)R-250（Biomol）；SDS（MYM）；葡聚糖凝膠G-75（Solarbio）。試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

CT15RT型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、HimacCF15R型高速微型離心機(jī)（Hitachi）；ME-T型分析天平（Mettler Toledo）；85-2A型數(shù)顯測(cè)速恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造公司）；UV-2000紫外分光光度計(jì)（Unico）；Cryo CubeF570型超低溫冰箱（Eppendorf）；555BR型蛋白凝膠電泳套件（Bio-rad）；PB-10型酸度計(jì)（Sartorius）；Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)（Millipore）。

1.3 黃棒菜SOD提取流程

1.4 粗酶液的提取

采用L9(34)正交試驗(yàn)，考察料液比（1∶3，1∶4和1∶5 g/mL）、浸提溫度（-20，0和4 ℃）、浸提pH（7.0，7.5和8.0）對(duì)黃棒菜SOD酶活力的影響。稱取一定量-80 ℃貯存的黃棒菜干葉，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8），冰上研磨勻漿，不同溫度下浸提6 h后，離心10 min（4 ℃，6 000 r/min），取上清液制成粗酶液。

1.5 SOD的分離純化

1.5.1 熱變性對(duì)黃棒菜SOD酶活力的影響

將粗酶液置水浴鍋內(nèi)，分別固定熱變性時(shí)間20 min、熱變形溫度50 ℃，考察不同熱變形溫度（40，50，60和70 ℃）、熱變性時(shí)間（15，20，25和30 min）對(duì)黃棒菜SOD酶活力的影響。熱變性后，4 ℃冰浴30 min，離心10 min（4 ℃，6 000 r/min），收集上清液。

1.5.2 丙酮沉淀對(duì)黃棒菜SOD酶活力的影響

向酶液中加入1.0，1.5和2.0倍酶液體積的丙酮，混勻，置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)抽去丙酮（真空度0.08 MPa、-52 ℃），用PBS緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）將凍干沉淀溶解，離心10 min（4 ℃，6 000 r/min），收集上清液。

1.5.3 葡聚糖凝膠柱層析與凍干粉制備

參照衛(wèi)秀英等[12]方法預(yù)處理葡聚糖凝膠G-75并裝柱，用PBS緩沖液（0.05 mmol/L，pH 7.8）洗脫，流速約0.4 mL/min，收集波峰處的洗脫液。量取適量洗脫液，制成凍干粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 SOD酶活力與蛋白質(zhì)的測(cè)定

1.6.1 SOD酶活力的測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法[13]測(cè)定SOD酶活力。量取待測(cè)酶液0.01 mL加入測(cè)活體系，25 ℃，4 000 lx光下反應(yīng)20 min，在560 nm下測(cè)定吸光度（空白組調(diào)零，對(duì)照組以水代替酶液），酶液的SOD酶活力按式（1）計(jì)算。

式中：U為酶液總活力，U/mg；A560nm為對(duì)照組吸光度；A’560nm為測(cè)定組吸光度；V為體系總體積，mL。

1.6.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[14]并參照裴顯慶[15]做法，以1 mg/mL牛血清白蛋白（V）溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。量取待測(cè)酶液100 μL與考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL混勻，靜置2 min后測(cè)定595 nm下的吸光度，酶液蛋白含量按式（2）計(jì)算。

蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=A595nm×V/（Vt×k）（2）式中：A595nm為酶液吸光度；V為體系總體積，mL；Vt為酶液加入體積，mL；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

圖1 蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6.3 SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)

參照彭繼千[16]做法，量取沸水浴后的酶液25 μL和0.1%溴酚藍(lán)染液5 μL混勻，制成上樣液。選擇3%濃縮膠和10%分離膠，設(shè)置電流30 mA，電壓分別為150和180 V。電泳后凝膠固定50 min、染色40 min并充分脫色。

1.7 葉莖和葉片SOD的活性及蛋白含量比較

在正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，取新鮮黃棒菜葉莖和葉片，分別用液氮研磨勻漿，以最佳條件處理，收集各步所得酶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶液最佳提取條件的確定

表1～表4結(jié)果表明，影響黃棒菜SOD酶活力的主次因素為料液比＞浸提溫度＞浸提pH＞隨機(jī)誤差，其中料液比的影響極顯著；影響黃棒菜蛋白含量的主次因素為料液比＞隨機(jī)誤差＞浸提溫度＞浸提pH，其中料液比、浸提溫度、浸提pH影響均不顯著，D組極差顯示隨機(jī)誤差較大。由于浸提溫度（B組）對(duì)黃棒菜SOD活力無(wú)顯著影響，且考慮到控制試驗(yàn)條件的難度，因此選擇最佳浸提條件為A1B2C1，即料液比1∶3（g/mL），浸提溫度0 ℃，浸提pH 7.0。

表1 每毫升SOD酶活力的正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 每毫升SOD酶活力的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

表3 每克鮮重蛋白含量的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 每克鮮重蛋白含量的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

2.2 SOD最佳純化條件的確定

2.2.1 熱變性溫度的影響

表5結(jié)果表明，0～50 ℃，隨著熱變性溫度升高，酶液SOD比活力提高，酶活收率、蛋白去除率降低；50～70 ℃，隨溫度升高，SOD逐漸失活，比活力下降。其中，50 ℃下比活力最高（57.59 U/mg），40 ℃下酶活收率最高（95.84%）。從50 ℃開(kāi)始，蛋白去除率變化平緩，雜蛋白基本沉降完全。為便于后續(xù)SOD的分離，因此選擇50 ℃為最佳熱變性溫度。

表5 溫度的影響

2.2.2 熱變性時(shí)間的影響

表6結(jié)果表明，0～25 min，隨著熱變性時(shí)間延長(zhǎng)，酶液SOD比活力提高，酶活收率、蛋白去除率降低；20和25 min時(shí)，比活力最高，分別為57.92和57.59 U/mg；25～30 min，隨時(shí)間延長(zhǎng)，SOD失活增加，比活力下降。由于20 min的酶活收率顯著高于25 min 8.78%，且長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理不利于SOD保存，因此選擇20 min為最佳熱處理時(shí)間。

表6 熱變性時(shí)間的影響

2.2.3 丙酮處理的影響

表7結(jié)果表明，隨丙酮加入量增加，酶液SOD比活力、酶活收率、蛋白去除率均提高。從丙酮加入量1.5倍開(kāi)始，酶活收率變化平緩，雜蛋白基本沉降完全。由于丙酮具毒性，且加入量過(guò)高時(shí)會(huì)改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，易導(dǎo)致目的蛋白聚集沉降[7]，因此選擇最佳丙酮加入量1.5倍。

表7 丙酮用量的影響

2.2.4 葡聚糖凝膠層析結(jié)果

圖2所示，葉莖和葉片的洗脫峰均為單峰，雜蛋白基本去除。波峰處葉莖吸光度較大，蛋白含量較高。A中曲線于峰后出現(xiàn)平緩期（吸光度約0.31），此現(xiàn)象在其他植物SOD的提取試驗(yàn)[10]中亦出現(xiàn)，推測(cè)是由于普通的分離提純操作難以分離相對(duì)分子質(zhì)量高度相似的不同SOD亞基[17]，植物材料含多種SOD亞基時(shí)，可能出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

圖2 葡聚糖凝膠G-75柱層析吸光曲線

2.3 SOD活性分析與蛋白鑒定

圖3 所示，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約67 kDa，與事實(shí)相符。泳道4出現(xiàn)多個(gè)條帶，表明植物材料的蛋白種類豐富，且浸提條件的提取效果良好。泳道7、8顯示黃棒菜SOD相對(duì)分子質(zhì)量約80 kDa，據(jù)文獻(xiàn)鑒定為Mn-SOD。

圖3 SDS聚丙烯酰胺凝膠

2.4 葉莖和葉片SOD活性的測(cè)定與分析

表8和表9結(jié)果表明，經(jīng)最佳條件處理，新鮮的黃棒菜葉莖、葉片SOD比活力分別可達(dá)7 662.23和4 897.39 U/mg，純化倍數(shù)分別為17.55和23.08。各步中葉莖SOD比活力均高于葉片，丙酮處理后，葉莖SOD酶活回收率較高，認(rèn)為葉莖更適于提取SOD。表8顯示，層析后，葉莖SOD總活力損失較多，原因是在測(cè)定葉莖蛋白時(shí)只使用主要波峰段的洗脫液，為保證純化效果，所以舍棄異常區(qū)段的洗脫液。

表8 葉莖的SOD

表9 葉片的SOD

3 討論與結(jié)論

3.1 黃棒菜作為SOD生產(chǎn)原料的優(yōu)勢(shì)

黃棒菜價(jià)格低廉，產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)，適于大規(guī)模種植，其SOD和蛋白質(zhì)含量相比其他植物較高[1]。最佳條件下黃棒菜SOD的浸提效果良好；利用SOD熱穩(wěn)定性[2]，熱變性與丙酮沉淀可有效去除雜蛋白，且對(duì)SOD破壞??；丙酮凍干后，葉莖、葉片組織SOD的酶活收率分別為82.62%和71.24%；經(jīng)層析純化，葉莖和葉片SOD比活力（葉莖7 662.23 U/mg）、葉片（4 897.39 U/mg）均高于其他植物，如玉米胚（3 079.41 U/mg）[2]、野生獼猴桃（1 520 U/mg）[9]、綠豆芽（2 797.2 U/mg）[18]等；廢棄的植物殘?jiān)嗫勺黠暳系仍倮?。黃棒菜具有作為SOD生產(chǎn)原料的突出優(yōu)勢(shì)。

3.2 植物SOD的制備方法及應(yīng)用前景

生產(chǎn)SOD主要有4種途徑[8]：動(dòng)物血液提取法、植物提取、微生物發(fā)酵法和基因工程法。其中，動(dòng)物提取的SOD存在交叉感染和過(guò)敏反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)，不適于用在人類醫(yī)療、保健等；微生物法受發(fā)酵溫度和pH影響大，產(chǎn)量難以控制；基因工程法成本高，且對(duì)技術(shù)與設(shè)備要求嚴(yán)格。相比之下，植物提取SOD具有綠色安全、成本低、取材便利、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，且多種提純方法可供使用：制備粗酶液可采用磷酸緩沖液提取法、Tris-HCl法和熱變性法等；純化可采用分步鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析等，此外新技術(shù)如超聲波輔助萃取、樹(shù)脂吸附、雙水相萃取等也被用于植物SOD提取。針對(duì)試驗(yàn)的不足，如步驟較多、使用丙酮的負(fù)面影響等，日后學(xué)者可借助新技術(shù)來(lái)解決此類問(wèn)題。SOD是眾多藥物、食品、化妝品生產(chǎn)中的重要原料，而中國(guó)仍主要以動(dòng)物血液生產(chǎn)SOD，產(chǎn)量低且應(yīng)用領(lǐng)域有限，致使市場(chǎng)上SOD已供不應(yīng)求。因此優(yōu)化植物SOD的提取工藝，實(shí)現(xiàn)植物資源的更大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有現(xiàn)實(shí)意義。

3.3 結(jié)論

黃棒菜SOD的最佳提取條件：料液比1∶3，浸提溫度0 ℃，pH 7.0，50 ℃熱變性20 min，1.5倍酶液體積的丙酮。經(jīng)層析純化，葉莖、葉片SOD比活力可達(dá)7 662.23和4 897.39 U/mg；經(jīng)分析，認(rèn)為葉莖更適于提取SOD；層析圖譜顯示，最佳條件下雜蛋白去除效果良好；經(jīng)電泳檢測(cè)，黃棒菜SOD相對(duì)分子質(zhì)量約80 kDa，初步鑒定為Mn-SOD。試驗(yàn)優(yōu)化黃棒菜SOD的提取工藝，為其進(jìn)一步的資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。