田口法優(yōu)化石榴皮中3種活性成分的提取工藝

李佳璇，趙姍姍，盛尊來,

1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院（哈爾濱 150030）；2. 黑龍江省重點實驗室，動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制實驗室（哈爾濱 150030）

石榴（Punica granatumL.）是石榴科植物石榴的果實，原產(chǎn)于波斯一帶，開辟“絲綢之路”的張騫出使西域時將石榴種子帶回中國并種植，現(xiàn)在主產(chǎn)于江蘇、湖南、湖北、山東等地[1-3]。中國是石榴的第一生產(chǎn)和消費國，石榴果實、果皮、根、花均可入藥[4]。

石榴皮是石榴的干燥果皮，含有許多生物活性成分，如多酚類、黃酮類、有機酸、生物堿類等[5-9]。石榴皮是中國傳統(tǒng)中藥，有澀腸止瀉、止血驅(qū)蟲的功效，用于治療燒傷燙傷，痢疾，中耳炎、牛皮癬及甲狀腺癌、肝癌等多種癌癥[10-16]。

田口法是日本著名質(zhì)量管理學(xué)家田口玄一博士提出的一種質(zhì)量工程的方法。田口法充分利用系統(tǒng)中存在的非線性效應(yīng)，選擇合適的正交設(shè)計表安排試驗，通過S/N分析和方差分析對測試結(jié)果進行分析，通過田口正交試驗確定影響因素的重要性和各因素的最佳水平并加以組合，利用誤差模擬干擾因素，設(shè)計更加科學(xué)，提高效率，降低費用[17-19]。單因素試驗基礎(chǔ)上，使用田口法優(yōu)化安石榴林、安石榴苷、鞣花酸的提取工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)，有助于石榴皮的進一步開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

石榴皮是（哈藥集團世一堂制藥廠）；安石榴林、安石榴苷和鞣花酸對照品（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所；乙醇（廣州友聯(lián)化工試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；超純水由Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)（自制，Millipore，Bedford，MA，USA）；娃哈哈礦泉水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（上海沃特世科技有限公司）；Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex分析儀器有限公司）；KAT-8循環(huán)水多用真空泵（無錫中恒儀器廠）；TGL-16G高速臺式離心機（上海利鑫堅離心機有限公司）；DH6000A電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；BT224S分析天平（深圳明科科技有限公司）。

1.3 色譜條件

高效液相色譜儀器采用2998 PDA檢測器，流動相由0.1%甲酸（A）和甲醇（B）組成，梯度洗脫分離程序：0 min（5% B）×8 min（16.3% B）×17 min（20.5% B）×47 min（62.8% B）。流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長377 nm。

通過比較其保留時間和標準溶液中相應(yīng)峰的保留時間確定石榴皮中的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸（見圖1）。表1列出這些標準曲線的相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

圖1 高效液相色譜圖

表1 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的標準曲線回歸方程和線性范圍

1.4 安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取

將石榴皮（5.00 g）研磨成粉末后過篩，乙醇回流提取。過濾使藥渣與提取液分離，提取液以3 000 r/min離心10 min，用高效液相色譜法測定其含量。

1.5 田口法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗條件下，初步確定乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）和粒徑（E）的適宜范圍。在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計五因素三水平L27(35)的田口法試驗，因素水平表如表2所示。整個設(shè)計包括27次試驗點，隨機進行。信噪比S/N計算如式（1）。

式中：n為每個試驗的測量次數(shù)；S/N為信噪比；y為提取率。

表2 田口設(shè)計的因素和水平

1.6 統(tǒng)計分析

用Minitab 17軟件分析田口法的信噪比和方差分析結(jié)果。用圖基法檢驗各因素的顯著性（p＜0.05）。

2 結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察溫度40 ℃、時間1 h、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時，不同濃度的乙醇（0，20%，40%，60%，80%和100%）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2A所示，乙醇體積分數(shù)從0升高到20%時，提取率呈線性下降，而乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增加時，提取率保持不變。

這是因為安石榴林、安石榴苷和鞣花酸中含有大量苯基、羥基，易溶于極性溶劑。3種成分在乙醇體積分數(shù)0%時達到最大值。根據(jù)這一結(jié)果，選擇0～20%乙醇體積分數(shù)進一步優(yōu)化。

2.1.2 提取溫度對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察乙醇體積分數(shù)0%、時間1 h、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時，不同的提取溫度（30，40，50，60，70和80 ℃）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2B所示，隨著提取溫度升高，安石榴林，安石榴苷和鞣花酸產(chǎn)量先升高后下降，安石榴苷產(chǎn)量在70 ℃達到最大值，而安石榴林和鞣花酸產(chǎn)量在40 ℃達到最大值。由于石榴皮中安石榴苷含量遠遠高于安石榴林和鞣花酸，因此，將提取溫度設(shè)定在70 ℃并進行下面的田口試驗。

2.1.3 提取時間對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察乙醇體積分數(shù)0、提取溫度70 ℃、液料比20∶1 mL/g、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時，不同的提取時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2C所示，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率都在提取時間2.0 h時達到最大值，并隨著提取時間繼續(xù)延長而降低。據(jù)推斷，在這種情況下，3種成分已充分溶解和吸收，可用于臨床。

這是因為提取時間2.0 h時，3種酚酸溶解飽和，溶解速率處于平衡狀態(tài)，但隨著提取時間繼續(xù)增加，酚酸類物質(zhì)可能發(fā)生縮合、降解、氧化或其他化學(xué)反應(yīng)，影響目標化合物產(chǎn)率。因此，在1.5～2.0 h范圍內(nèi)確定提取時間，用田口法進一步優(yōu)化。

2.1.4 液料比對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察乙醇體積分數(shù)0%、提取時間2 h、提取溫度70 ℃、粒徑0.25 mm、提取次數(shù)1次時，不同液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2D所示，隨著液料比從10∶1 mL/g增加到40∶1 mL/g，3種化合物提取率均有所提高，而液料比從40∶1 mL/g增加到60∶1 mL/g，提取率不再繼續(xù)增加。

這是因為隨著溶劑體積增加，物料與溶劑的接觸面積增大，濃度增加梯度變大，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移的動力增大，有利于3種酚酸的溶解。酚酸浸出達到飽和點時，產(chǎn)量不再增加，直到達到一定值時，產(chǎn)量40 mL/g時達到最高水平。與此結(jié)果相對應(yīng)，田口法采用液料比30～50 mL/g進一步優(yōu)化。

2.1.5 粒徑對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察乙醇體積分數(shù)0%、提取時間2 h、提取溫度70 ℃、液料比40∶1 mL/g、提取次數(shù)1次時，不同粒徑對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2E所示，粒徑（0.09～2 mm）對提取效果明顯，提取率隨粒徑減小而升高，在0.125 mm時提取率達到最大值。

這可能是因為當粒徑較小時，目標化合物能更好地從石榴皮粉中分離出來。試驗結(jié)果與前期研究一致，表明最佳粒徑為0.09～0.15 mm，并采用田口法進一步優(yōu)化。

2.1.6 提取次數(shù)對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響

試驗考察在最佳提取條件下（乙醇體積分數(shù)0%、提取時間2 h、提取溫度70 ℃、液料比40∶1 mL/g，粒徑0.125 mm）時，不同提取次數(shù)（1，2，3和4次）對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的影響。

結(jié)果如圖2F所示，提取次數(shù)從1次增加到2次時，提取率明顯提高。但3次提取后，提取率變化不明顯。

圖2 不同提取因素對3種酚酸產(chǎn)率的影響

這是因為隨著提取次數(shù)增加，溶液體積明顯增大，會影響后續(xù)的集中度，造成功率損耗，增加許多不必要的成本。因此，選擇提取2次用于田口法優(yōu)化。

2.2 田口法進一步優(yōu)化乙醇回流提取工藝

基于單因素試驗結(jié)果，利用統(tǒng)計分析軟件Minitab 17，將5個因素——乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）和粒徑（E），以及3水平——安石榴林（Y1）、安石榴苷（Y2）和鞣花酸（Y3），采用L27(35)田口法中心組合試驗設(shè)計進行研究。田口法試驗設(shè)計和安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的提取率如表3所示。

為探究各個變量對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率的顯著影響，對田口法的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析[20]。p值決定工藝因素是否具有統(tǒng)計學(xué)意義[21]。設(shè)顯著性p＜0.05，如表4所示，對比F值，乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）和粒徑（E）是對安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率影響最大的3個變量。3個因素對提取率的影響依次為B＞A＞E，R2和調(diào)整后的R2值均接近1，說明提取率模型成立。

為使用信噪比S/N分析這些數(shù)據(jù)，確定最佳提取條件如圖3所示。使用Minitab 17軟件不能簡單地統(tǒng)計優(yōu)化每個組分的最大產(chǎn)量。對3個水平的結(jié)果進行綜合比較分析：1）乙醇體積分數(shù)。安石榴林和安石榴苷的提取率在水平3達到最大，鞣花酸的提取率在水平1和水平3基本相同，因此最佳乙醇體積分數(shù)是水平3。2）提取溫度。最大產(chǎn)量安石榴林和鞣花酸的最大提取率均在水平3，但安石榴苷的最大提取率為水平2，由于3種成分中安石榴苷的含量最高，因此最佳提取溫度是水平2。3）提取時間。鞣花酸的最大提取率在水平2，安石榴林和安石榴苷的提取率在水平2和水平3基本相同，因此最佳提取時間在水平2。4）液料比。安石榴林、安石榴苷和鞣花酸在水平3的提取率最高，因此最佳液料比為水平3。5）粒徑為水平2，安石榴苷和鞣花酸的最高提取率為水平2，最佳液料比為水平2。6）粒子直徑。安石榴苷和鞣花酸在水平2的提取率最高，因此最佳粒子直徑是水平2。

綜上所述，最佳提取條件為A3B2C2D3E2（乙醇體積分數(shù)20%、提取溫度70 ℃、提取時間2 h，液料比50∶1 mL/g、粒徑0.125 mm、提取次數(shù)2次）。在此條件下，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的預(yù)測提取率分別為17.94，497.44和7.26 mg/g。在最優(yōu)化條件下，進行3次驗證性試驗。結(jié)果見表5，3次試驗平均提取率分別為安石榴林17.89±0.27 mg/g，安石榴苷498.66±2.13 mg/g和鞣花酸7.30±0.05 mg/g，與預(yù)測值基本一致，說明工藝優(yōu)化合理可行。

表3 田口試驗設(shè)計及相應(yīng)的安石榴林、安石榴苷和鞣花酸提取率

表4 方差分析（ANOVA）

表5 優(yōu)化條件下的驗證性試驗

圖3 不同水平田口試驗設(shè)計對3種酚酸提取率的影響信噪比均數(shù)分析圖

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用田口法得到提取石榴皮中安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)20%、提取溫度70 ℃、提取時間2 h、液料比50∶1 mL/g、粒徑0.125 mm，提取次數(shù)2次。結(jié)果表明，采用田口法建立的提取優(yōu)工藝模型合理，方法可行，可用于批量生產(chǎn)。