蒲公英與葵花籽仁提取綠原酸的協(xié)同抗氧化作用

王文華，郭麗，劉爽

1. 上海震旦職業(yè)學院（上海 201908）；2. 綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand-Mazz）是菊科多年生植物[1]，富含綠原酸、咖啡酸、生物堿、多糖等多種功能成分[2]，是良好的藥食兩用佳品。大量研究表明，蒲公英提取物具有抑菌[3-4]、抗炎[5]、止血[6-7]、護肝[8-9]、抗癌[10-12]、抗氧化[13-17]等作用。

葵花籽中綠原酸主要分布在葵花籽仁的糊粉層中或細胞的蛋白質顆粒內。去油后的葵花籽粕中綠原酸含量高于其他油料作物，達到2.8%左右[18]。研究發(fā)現(xiàn)，葵花籽中綠原酸是其主要的抗氧化活性物質[19-20]。

試驗以蒲公英和葵花籽為原料，以其中的活性物質綠原酸為主要研究對象，研究不同溫度（5，25，37和45 ℃）和不同pH（2.0，4.0，6.0，7.0和8.0）條件下蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化活性。在此基礎上探究蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液復配的抗氧化活性，為開發(fā)天然、高效的新型復合抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英、葵花籽：市售。

試劑：綠原酸標準品（純度≥98%），Summus公司；ABTS（純度≥98%，2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽），北京酷爾化學科技有限公司。

1.2 試驗儀器與設備

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW135高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計，杭州齊威儀器有限公司；DL-6000B低速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DZ-1BC真空干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；752紫外-可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗內容

1.3.1 綠原酸的提取

將蒲公英表面灰塵清洗后，置恒溫干燥箱中40 ℃干燥至恒質量，經萬能粉碎機粉碎后過孔徑0.250 mm篩，密封保存，備用。用分析天平稱取4.000 0 g蒲公英干燥粉末于三角瓶中，加入80 mL體積分數(shù)60%乙醇溶液，采用超聲波輔助提取蒲公英中綠原酸。提取條件：超聲功率80 W，超聲處理110 min，提取溫度60 ℃，用濾布過濾后備用。

將葵花籽去皮后置恒溫干燥箱中60 ℃干燥至恒質量，經萬能粉碎機粉碎后過孔徑0.250 mm篩，根據(jù)GB 5009.6—2016中索氏抽提法除去葵花籽仁中脂肪，再經真空干燥后備用。稱取4.000 0 g的脫脂干燥葵花籽仁粉末于三角瓶中，加入80 mL體積分數(shù)50%乙醇溶液，采用乙醇浸提法提取葵花籽仁中綠原酸，提取pH 6.0，提取溫度50 ℃，提取時間2 h，于3 000 r/min下離心20 min，取上清液備用。

1.3.2 綠原酸提取液抗氧化研究

研究不同溫度（5，25，37和45 ℃）和pH（2.0，4.0，6.0，7.0和 8.0）條件下蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化活性。通過蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的抗氧化動力學實驗研究，根據(jù)2種樣品綠原酸提取液單獨作用時的 IC50值，將蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液進行復配，比例分別為1∶9，2∶ 8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1，利用ABTS自由基清除法對兩者協(xié)同抗氧化能力進行研究。

1.4 測定方法

1.4.1 綠原酸含量的測定

1.4.1.1 標準曲線的制作

用分析天平準確稱取5.3 mg綠原酸標準品，用60%乙醇定容于100 mL容量瓶中備用，質量濃度為0.053 mg/mL。分別吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0和12.0 mL于25 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，用紫外分光光度計于325 nm波長下測定吸光度，做平行試驗，并以綠原酸標準溶液的濃度為橫坐標，所測得的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.1.2 樣品測定

準確吸取1.0 mL蒲公英提取液，用60%乙醇定容至10 mL容量瓶中，即為蒲公英綠原酸待測液；從葵花籽仁提取液中準確吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，在pH 6.0的條件下，用50%乙醇定容即為葵花籽綠原酸待測液，在325 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算待測液中綠原酸含量。

1.4.2 綠原酸抗氧化活性測定

ABTS自由基清除能力測定：參照Re等[21]的方法，并稍作修改。分別用超純水配制25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和25 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，將兩者混合后置于避光處16～24 h制備ABTS反應液，采用不同pH的緩沖溶液對ABTS反應液進行稀釋，使其在波長734 nm下測得的吸光度為0.70±0.02；用移液器準確吸取30 μL的樣品提取液和3 mL 稀釋后的ABTS反應液于避光離心管中，分別置于5，25，37和45 ℃下反應5 min，以不同pH緩沖液作為空白對照，并于波長734 nm下測定吸光度。

ABTS自由基清除率按式（1）計算。

式中：I為ABTS自由基清除率，%；A0為空白對照反應后的吸光度，AS為蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液分別反應后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 蒲公英、葵花籽仁中綠原酸含量

以綠原酸濃度為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，得出綠原酸標準曲線方程：y=37.09x+0.031，R2=0.994。綠原酸標準品在0～0.024 mg/mL的濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系，見圖1。

圖1 綠原酸標準曲線

通過標準曲線方程計算得出蒲公英提取液中綠原酸含量為4.5%，葵花籽仁提取液中綠原酸含量為1.2%。吳婉瑾等[22]通過乙醇回流法測得不同生態(tài)型蒲公英中綠原酸含量范圍在2.21%～7.03%，與試驗結果相一致；胡鮮寶等[23]利用乙醇提取法提取葵花粕中綠原酸，提取率為2.57%，可見脫脂程度不同對綠原酸含量有所影響。

2.2 蒲公英綠原酸提取液對ABTS自由基的清除能力

ABTS是目前常用來評價抗氧化劑清除自由基能力的重要方法之一。ABTS在氧化劑的作用下會氧化變?yōu)榫G色，而多酚類物質因能提供氫離子，將綠色的ABTS還原為無色，在734 nm波長下，通過測定ABTS溶液的吸光度即可計算出樣品中綠原酸的抗氧化能力。

蒲公英綠原酸提取液在pH為2～8時，提取液對ABTS自由基的清除率隨著pH增大，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，見圖2。

圖2 不同條件下蒲公英提取液綠原酸對ABTS自由基的清除能力

當綠原酸提取液的pH為6.0時，其對ABTS自由基清除能力最大，這主要是由于綠原酸的第一解離常數(shù)pKa1為0.36，在提取液pH低于解離常數(shù)時，綠原酸被質子化不能進行解離來猝滅ABTS自由基；當提取液pH高于第一解離常數(shù)時，促使綠原酸分子酚羥基的電離效率進一步放大，使其抗氧化能力增加。當綠原酸提取液pH為2.0時，其對ABTS自由基清除能力最差，綠原酸分子在pH 2.0時的溶解度很低，強酸環(huán)境限制了綠原酸分子結構的水合解離，導致其抗氧化能力較低[24]。綠原酸提取液pH為4.0，7.0和8.0時，其對ABTS自由基清除能力差異不明顯。

蒲公英綠原酸提取液在濃度為0.225～2.025 mg/mL范圍時，綠原酸提取液對ABTS自由基清除率隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢，見圖3。

在相同濃度下，反應溫度為45 ℃時，蒲公英綠原酸提取液對ABTS自由基清除作用均高于5，25和37 ℃。當提取液綠原酸濃度為2.025 mg/mL、反應溫度為45 ℃時，提取液綠原酸對ABTS自由基清除作用最強，清除率為91.78%，而反應溫度為5 ℃時，提取液綠原酸對ABTS自由基清除能力最弱，為90.58%。

圖3 pH 6.0不同溫度下蒲公英提取液綠原酸對ABTS自由基的清除能力

葵花籽仁綠原酸提取液在pH為2～8時，提取液對ABTS自由基的清除率隨著pH的增大，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，見圖4。

圖4 不同條件下葵花籽仁綠原酸對ABTS自由基的清除能力

當綠原酸提取液的pH為6.0時，其對ABTS自由基清除能力最好，可能是綠原酸分子在pH 6.0的條件下其內部的酚羥基結構電離度更高，更有利于終止ABTS自由基的連鎖反應。當綠原酸提取液pH為2.0時，其對ABTS自由基清除能力最差，可能在強酸體系下綠原酸的溶解性會受到一定程度的干擾，使部分綠原酸質子化帶正電，而造成綠原酸抗氧化活性的顯著降低[24]。綠原酸提取液pH為4.0，7.0和8.0時，其對ABTS自由基清除能力差異不明顯。

葵花籽仁綠原酸提取液濃度在0.054～2.7 mg/mL范圍時，其對ABTS自由基清除能力隨著溫度的升高，呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，見圖5。

在相同濃度下，反應溫度為45 ℃時，葵花籽仁綠原酸提取液對ABTS自由基清除作用最好，均高于5，25和37 ℃時提取液對ABTS自由基的清除率。當提取液綠原酸濃度為2.7 mg/mL，反應溫度為45 ℃時，提取液綠原酸對ABTS自由基清除能力最強，清除率達到90.51%。提高溫度后綠原酸分子的解離度增加，促使綠原酸分子和自由基之間的碰撞概率增大[24]。

圖5 pH 6.0不同溫度下葵花籽仁綠原酸對ABTS自由基的清除能力

2.3 ABTS自由基的清除能力回歸方程

IC50表示達到半數(shù)抑制率或者半數(shù)清除自由基活性時的物質濃度，常用來表示物質的抗氧化活性，物質的IC50越小，表明物質的抗氧化活性越強，反之亦然。

確定在pH 6.0條件下，蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液對ABTS自由基清除能力最佳，分析不同溫度下、不同濃度綠原酸提取液的抗氧化活性。不同反應溫度下，葵花籽仁綠原酸提取液的IC50值均顯著高于蒲公英綠原酸提取液的IC50值。隨著反應溫度的升高，IC50值均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，見表1。

表1 pH 6.0時不同反應溫度下綠原酸ABTS自由基清除能力回歸方程

在溫度為45 ℃時蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液的IC50值分別為0.071 933和0.938 96，是5 ℃時IC50值的48%和41%，可見溫度升高顯著提升了綠原酸的抗氧化活性。反應溫度升高會提升反應發(fā)生的速度，但不改變達到平衡時的抗氧化活性，可能提高溫度后綠原酸在體系中的分散度和電離電勢增大[24]。

2.4 綠原酸復配體系對ABTS自由基清除能力研究

協(xié)同抗氧化作用的發(fā)生不僅與抗氧化劑分子本身的抗氧化特性有關，還與規(guī)整有序的分子排列體系有關，有序性縮短了分子之間的接觸距離和電子以及氫原子的傳遞路徑，從而促進協(xié)同抗氧化現(xiàn)象發(fā)生。

為研究蒲公英綠原酸與葵花籽仁綠原酸對清除ABTS自由基的協(xié)同效應，將2種樣品中綠原酸提取液用pH 6.0緩沖液稀釋至最適濃度后，按比例（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1）混合，測定樣品組合清除ABTS自由基的能力，判定協(xié)同關系。

復配液對ABTS自由基的清除能力均大于蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液單獨對ABTS自由基的清除能力，蒲公英綠原酸提取液對ABTS自由基的清除能力相對于葵花籽仁綠原酸提取液較弱，見圖6。隨蒲公英綠原酸提取液濃度的增加，復配液對ABTS自由基的清除率呈緩慢遞增的趨勢，當蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液體積比為7∶3時，在所有的比例組合中顯示出較強的協(xié)同抗氧化作用，反應溫度大于37 ℃時，復配液的協(xié)同抗氧化能力保持較高水平。

圖6 不同復配比例對ABTS自由基的清除能力

3 結論

試驗是在不同溫度和不同pH條件下，以蒲公英和葵花籽仁綠原酸為原料，研究蒲公英和葵花籽仁綠原酸單獨作用時對ABTS自由基的清除能力，并分析復配體系的抗氧化能力。得到主要結論如下：

1) 反應體系的pH和溫度對蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液對ABTS自由基清除能力具有顯著性影響，兩種樣品液在pH 6.0和45 ℃條件下抗氧化活性最佳，分別為91.78%和90.51%。

2) 在復配體系中，當蒲公英和葵花籽仁綠原酸提取液體積比為7∶3時ABTS自由基清除能力最強，為91.74%。蒲公英和葵花籽仁綠原酸具有協(xié)同抗氧化能力。