雙酶酶解制備黑小麥麩皮抗氧化肽

趙妍，路清宇

河南工業(yè)大學糧油食品學院（鄭州 450001）

黑小麥麩皮是一種優(yōu)質的蛋白資源[1]，將黑小麥麩皮蛋白進行酶解得到具有抗氧化能力的活性肽，是一種開發(fā)麥麩蛋白的有效途徑。試驗采用黑小麥提取麩皮蛋白，通過雙酶分步酶解制得抗氧化肽，使用單因素試驗和正交法優(yōu)化提取工藝，為黑小麥麩皮抗氧化肽的理論研究及其相關產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥（農(nóng)大876），泰安綠得農(nóng)業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、風味蛋白酶（30 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索萊寶生物科技有限公司；總抗氧化能力測試盒、總蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-18MS高速冷凍離心機，上海盧湘儀器有限公司；Phs-3c酸度計，上海大普儀有限公司；LGJ-10C型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠；TV-1819型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑小麥麩皮蛋白的提取

黑小麥潤麥磨粉得到麩皮，粉碎后過孔徑0.250 mm篩，加蒸餾水調節(jié)至料液比為1∶15（g/mL）后，調節(jié)pH到9，55 ℃振蕩60 min，離心（3 600 r/min）30 min取上清液，殘渣重復上述步驟。將2次上清液混勻，調節(jié)pH至4.8，離心（3 600 r/min）30 min，取沉淀冷凍干燥。

1.3.2 黑小麥麩皮蛋白的酶解

黑小麥麩皮蛋白加蒸餾水至濃度2%，調節(jié)pH，37 ℃攪拌15 min，加入酶進行酶解，控制時間和溫度，結束后將其置于92 ℃滅酶10 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液測水解度、肽得率及總抗氧化活性。用最優(yōu)條件將第一步酶解進行至滅酶后，加入第二步酶進行酶解，重復上述操作測定3種指標，上清液冷凍干燥。

1.3.3 水解度（DH）測定

采用茚三酮比色法[2]。酶解液8 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液，加入0.5 mL pH 8.04磷酸鹽緩沖液及0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴反應15 min，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，搖勻靜置15 min，波長570 nm處比色，以空白試劑為參比，按式（1）進行計算。

式中：A為查表得蛋白質的毫克數(shù)；m為稱樣質量，g；V1為水解液的總體積，mL；V2為稀釋液的體積，mL。

1.3.4 總抗氧化活性（Trolox value）測定

根據(jù)總抗氧化活性試劑盒（ABTS快速法）測定[3]。依次加入10 μL樣品、20 μL過氧化物酶應用液及170 μL ABTS工作液于96孔板，室溫條件下反應6 min，使用酶標儀在波長405 nm處讀取各孔OD值。以蒸餾水為空白對照，Trolox為標準品，按式（2）進行計算。

式中：總抗氧化活性，μmol/g；cTrolox為樣品相當于Trolox的濃度，將OD值代入Trolox標準曲線得出，mmol/mL；m為黑小麥麩皮蛋白的質量，g；V為反應液的總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 肽得率的測定

根據(jù)總蛋白定量測試盒（BCA法）測定[4]。依次加入20 μL樣品、雙蒸水、563 μg/mL標樣、250 μL工作液，混勻后37 ℃孵育30 min，加入750 μL終止劑應用液，再次混勻，靜置5 min后用雙蒸水調零。波長562 nm、光徑0.5 cm處測定其吸光度。

式中：ODs為測定OD值；ODb為標準OD值；OD0為空白OD值；標樣濃度為563 μmol/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 單因素試驗

采用5種蛋白酶酶解，條件設定為表1，根據(jù)水解度、總抗氧化活性及肽得率，篩選出兩步酶解所用的蛋白酶進行單因素試驗及正交優(yōu)化試驗。

改變溫度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（7，8，9，10和11）、時間（0.5，1，1.5，2，2.5和3 h）及酶添加量（6 000，10 000，14 000，18 000和22 000 U/g）中的1個因素，測定3種指標，選出第1種酶酶解時各因素最適宜的水平。采用第1種酶的最佳酶解參數(shù)進行酶解并滅酶后，加入第2種蛋白酶繼續(xù)酶解，同樣改變溫度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（4，5，6，7和8）、時間（0.5，1，1.5，2和2.5 h）及酶添加量（2 000，6 000，10 000，14 000和18 000 U/g）中的1個因素，測定3種指標，選出各因素最適宜的水平。

表1 不同蛋白酶的水解條件

1.3.7 正交優(yōu)化試驗

參照單因素試驗結果，以pH、溫度、時間及酶添加量為自變量，水解度、總抗氧化活性以及肽得率為因變量，設計四因素三水平試驗，各因素水平見表2和表3。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，分析時采用平均值計算。使用SPSS 20.0進行單因素及其方差分析，使用正交設計助手Ⅱ v3.1軟件進行正交分析，使用Origin 8.5軟件進行作圖。

表2 第一步正交試驗設計水平編碼表

表3 第二步正交試驗設計水平編碼表

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由圖1可知，經(jīng)堿性蛋白酶酶解，肽得率和總抗氧化活性均明顯高于其余3種酶，水解度僅次于風味酶，因此選堿性蛋白酶為第一步水解用酶。經(jīng)風味酶酶解，水解度最高，總抗氧化活性僅次于堿性蛋白酶，所以選風味酶為第二步水解用酶。

圖1 酶種類對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2 堿性蛋白酶單因素試驗結果

2.2.1 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖2可知，溫度較低時，3種指標均隨溫度升高而升高；而溫度超過50 ℃，則3種指標均呈下降趨勢。這是因為蛋白酶有自身的有效溫度及最適溫度，在有效溫度范圍內才具有酶解催化作用；在最適溫度下，其酶活性最強，催化酶解效果最佳[5]。溫度過高或過低時，酶活性不佳，不利于多肽的生成，使得水解度與肽得率降低，影響抗氧化活性，因此將50 ℃定為堿性蛋白酶酶解的最佳溫度。

2.2.2 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖3可知，酶添加量較少時，3種指標均逐漸升高；酶添加量從18 000 U/g升高到22 000 U/g時，3種指標基本保持穩(wěn)定。這是因為底物濃度不變時，酶添加量決定了酶解后多肽的生成量，當足夠的酶與底物反應后，多肽的生成量最高[6]，此時底物可能已經(jīng)被酶解完全，因此選擇18 000 U/g作為酶解的最適添加量。

圖2 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖3 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2.3 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖4可知，當酶解時間較短時，3種指標均逐漸升高，酶解時間高于2 h后，3種指標均保持穩(wěn)定。這是因為酶解時間較短時，底物中酶解位點充足，反應速度快，水解度等相關指標增加較快[5]；酶解時間延長后，底物中酶解位點變少，反應速度變慢，3種指標均逐漸達到了最大值；此后一些多肽又被進一步酶解，降低了酶解產(chǎn)物的總抗氧化活性[7]。因此酶解最佳時間為2 h。

圖4 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2.4 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖5可知，當pH較低時，3種指標均逐漸增加，pH超過9后3個指標均呈下降趨勢。這是因為pH會影響氨基酸殘基的解離狀態(tài)，改變酶的空間結構，從而影響酶解進程[8]。當pH處于蛋白酶最適pH范圍內時，酶的催化反應速度最快，效果最佳；而pH過高或過低易造成酶變性失活[5]。因此選擇pH 9作為最適pH。

2.3 堿性蛋白酶正交試驗結果

由表4～表7可知，3種不同條件分別對3種指標具有不同的顯著與極顯著影響。由表4可知，堿性蛋白酶酶解黑小麥麩皮蛋白的最優(yōu)組合為A2B2C2D2，即pH 9，時間2 h，溫度50 ℃，酶添加量18 000 U/g。選擇該條件進行黑小麥麩皮蛋白的第一步酶解。

圖5 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

表4 正交試驗直觀分析表

表5 水解度方差分析表

表6 肽得率方差分析表

表7 總抗氧化活性方差分析表

2.4 風味蛋白酶單因素試驗結果

圖6 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖7 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖6和圖7可知，當溫度和pH較低時，3個指標均有一定的升高；處于50 ℃以及pH 6時，3個指標均到達最高值；而溫度和pH繼續(xù)升高，這3個指標均出現(xiàn)下降的趨勢，因此將50 ℃和pH 6分別定為風味蛋白酶酶解的最佳溫度和最適pH。

由圖8和圖9可知，當酶添加量較少及時間較短時，3個指標均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；當酶添加量從10 000 U/g升高到18 000 U/g，時間從1.5 h到2.5 h，3個指標均保持穩(wěn)定，變化幅度較小。因此分別選擇10 000 U/g和1.5 h作為風味蛋白酶的最適添加量和最佳酶解時間。

圖8 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖9 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.5 風味蛋白酶正交試驗結果

由表8～表11可知，不同條件分別對3種指標具有不同的顯著與極顯著影響。由表8可知，風味蛋白酶酶解黑小麥麩皮蛋白的最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即pH 6，時間2 h，溫度50 ℃，酶添加量10 000 U/g，選擇該條件進行黑小麥麩皮蛋白的第二步酶解。

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接表8

試驗號 A pH B溫度 C時間 D加酶量 水解度/% 肽得率/% 總抗氧化活性/(μmol·g-1) k2 20.04 20.26 18.83 18.90 k3 17.65 17.91 19.09 18.46 R 2.39 2.95 1.53 0.78水解度 B＞A＞C＞D k1 41.21 39.75 40.45 40.85 k2 46.34 47.32 43.20 43.82 k3 40.06 40.54 43.95 42.93 R 6.29 7.57 3.50 2.97肽得率 B＞A＞C＞D k1 6.98 6.89 6.89 6.98 k2 7.63 7.63 7.33 7.31 k3 7.00 7.09 7.40 7.32 R 0.65 0.74 0.51 0.34總抗氧化活性 B＞A＞C＞D

表9 水解度方差分析表

表10 肽得率方差分析表

表11 總抗氧化活性方差分析表

3 結論

試驗采用堿性蛋白酶和風味酶對黑小麥麩皮蛋白進行分步酶解。根據(jù)各自單因素試驗進行正交優(yōu)化，最佳工藝條件為第一步使用堿性蛋白酶酶解，pH 9，酶活添加量18 000 U/g，時間2 h，溫度50 ℃；此時水解度為11.46%，肽得率為38.33%，總抗氧化活性為6.65 μmol/g。第二步使用風味酶酶解，pH 6，溫度50 ℃，時間2 h，酶活添加量10 000 U/g；此時水解度為22.74%，肽得率為52.36%，總抗氧化活性為8.47 μmol/g。