牛蒡茶加工工藝優(yōu)化及其總黃酮體外抗氧化活性

董玉瑋，莊聰林，盛雪云，潘鋮，苗敬芝，李偉

1. 徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（徐州 221018）；2. 徐州康匯百年食品有限公司（徐州 221700）

牛蒡（Arctium lappaL.）俗稱惡實(shí)、大力子、東洋參，為桔梗目、菊科、牛蒡?qū)俣晟荼局参颷1]。牛蒡根是牛蒡的主要食用區(qū)域，根中含有黃酮、菊糖、蛋白質(zhì)、維生素等多種對人體有益的物質(zhì)[2]，具有抗癌[3]、降血糖血脂[4]、保護(hù)肝臟[5]及抗氧化[6]等功效。牛蒡根由于纖維素含量高[7]，采用常規(guī)烹飪加工，口感粗糙、苦澀。牛蒡茶是以天然牛蒡根為原料，經(jīng)加熱烘烤制成，既很好地保留了牛蒡根的營養(yǎng)保健作用，又極大地改善了口感，攜帶方便，因此備受消費(fèi)者歡迎。

現(xiàn)階段牛蒡茶加工工藝主要有熱風(fēng)烘干[8]、微波干燥[9]、高溫烘烤[10]，原理是高溫下使原料快速失水，達(dá)到提升品質(zhì)、易于保存的目的。受加工工藝的影響，部分活性物質(zhì)的含量會發(fā)生變化。如克亞·加帕爾等[11]采用烘烤工藝，增加了枸杞總酚含量，增強(qiáng)了其抗氧化活性。黃酮類化合物是牛蒡茶中的重要活性物質(zhì)，易受溫度、空氣氧化等因素影響而失活，如果加工工藝條件選擇不當(dāng)，會破壞黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)[12]。

研究以新鮮牛蒡根為原料，探討牛蒡茶加工工藝中預(yù)熱時間、加熱溫度和時間因素對黃酮類化合物含量的影響。研究為牛蒡資源有效開發(fā)提供了合理的數(shù)據(jù)，為牛蒡茶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了具體的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛蒡，徐州康匯百年食品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品純度91.7%，上海哈靈生物科技有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BGZ-76電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘箱，上海博迅有限公司；FSD-101A電動粉碎機(jī)，上海博訊有限公司；牛蒡切片機(jī)，常州國華電器有限公司；TU-1810APC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Thermo公司；ICP-OES電感耦合等離子體-發(fā)射光譜，美國Thermo公司；ETHOS A微波消解儀，意大利 Milestone公司；1260液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡茶成茶工藝試驗(yàn)分析

選擇質(zhì)量好、粗細(xì)均勻的牛蒡，洗凈泥土后去皮，牛蒡切片厚度2 mm，切片浸泡在含有0.1%檸檬酸和0.02%二氧化氯的護(hù)色液中10 min，瀝干水分后，備用。含水率采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》的方法，按式（1）計算。

式中：mt為t時物料質(zhì)量，g；ms為絕干物料質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計

考察預(yù)熱時間、加熱時間、加熱溫度對牛蒡茶黃酮含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.2.1 預(yù)熱時間的選擇

牛蒡切片于40 ℃烘箱中分別加熱2.0，3.0，3.5，4.0和4.5 h，取出，將溫度升高至70 ℃加熱3.5 h，取出測定黃酮含量和含水率。冷卻后，粉碎。

1.3.2.2 加熱溫度的選擇

牛蒡切片于40 ℃烘箱中加熱4 h，取出，將溫度分別提升至60，65，70，75和80 ℃加熱3.5 h，取出測定黃酮含量和含水率。冷卻后，粉碎。

1.3.2.3 加熱時間的選擇

牛蒡切片于40 ℃烘箱中加熱4 h，取出，將溫度提升至70 ℃，分別加熱2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 h，取出測定黃酮含量和含水率。冷卻后，粉碎。

1.3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以預(yù)熱時間（X1）、加熱溫度（X2）、加熱時間（X3）3個因素為自變量，以黃酮含量為響應(yīng)值，采用Design Expert 10.0軟件設(shè)計試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平

1.3.4 總黃酮的提取

取1 g粉碎的牛蒡茶，按料液比1∶60（g/mL）加入70%乙醇，70 ℃水浴90 min。濾液為總黃酮提取液。

1.3.5 總黃酮的檢測

取總黃酮提取液1 mL加入25 mL比色管中，用30%乙醇溶液稀釋到10 mL，加入5%亞硝酸鈉0.7 mL，混勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.7 mL，混勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉5 mL，用30%乙醇定容到25 mL，混勻靜置15 min，于510 nm處測吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總黃酮含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=11.435X+0.021 3，R2=0.998 4。

1.3.6 復(fù)水比測定

牛蒡茶稱重后在40倍80 ℃蒸餾水中復(fù)水40 min，取出后用濾紙吸干表面水分，按式（2）計算復(fù)水比。

式中：mr為樣品復(fù)水后質(zhì)量，g；mg為復(fù)水前質(zhì)量，g。

1.3.7 理化指標(biāo)檢測

1.3.7.1 單糖及氨基酸組分檢測

HPLC檢測氨基酸參考鄧代信等[13]的方法，HPLC檢測單糖組分參考陳樹俊等[14]的方法。

1.3.7.2 總蛋白、總脂肪、總膳食纖維檢測

參照GB 5009.5—2016測定總蛋白質(zhì)含量，參照GB 5009.6—2016測定總脂肪含量，參照GB 5009.88—2014測定總膳食纖維含量。

1.3.7.3 礦物質(zhì)元素檢測

面對日新月異的城市交通，《齊魯周刊》以手繪的形式，制作一期特殊的專題，問好濟(jì)南：我們描述的是一座生活之城，因此必須在地圖上看到這座看不到的城市。我們從南外環(huán)高架橋的兩端看到長清和章丘的大學(xué)城，我們從西外環(huán)高架橋北端的黃河大橋看到新舊動能轉(zhuǎn)換綜合試驗(yàn)區(qū)中濟(jì)南的“黃河時代”，我們從北園高架橋的兩側(cè)看到一個城市的商業(yè)史，我們從工業(yè)北路高架的東端看到濟(jì)南東站，看到飛機(jī)場，這是濟(jì)南與世界溝通的重要媒介……

采用電感耦合等離子體-發(fā)射光譜法測定Na元素含量。Mg、Fe、Ca、Zn等元素含量采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜法[15]。

1.3.8 黃酮抗氧化活性測定

1.3.8.1 清除DPPH·能力的測定

參考Wu等[16]的方法測定，空白對照樣用無水乙醇代替樣品，陰性對照樣用無水乙醇代替DPPH，VC作為陽性對照，采用式（3）計算DPPH·清除率。

式中：A1為樣品吸光度，A0為空白樣吸光度，A2為陰性對照樣吸光度。

1.3.8.2 清除ABTS+·能力的測定

參考He等[17]的方法測定，配制ABTS+工作液，空白對照用蒸餾水代替樣品，陰性對照用蒸餾水代替ABTS+，VC作為陽性對照，采用式（4）計算ABTS+·清除率。

式中：A1為樣品的吸光度，A0為空白樣吸光度，A2為陰性對照樣吸光度。

采用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 分析與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 預(yù)熱時間的選擇

由圖1可知，在預(yù)熱2.5～4.5 h范圍內(nèi)，黃酮含量先增加后減少，4 h時含量達(dá)到最高，為1.20 mg/g；含水率逐漸降低，預(yù)熱4～5 h時，已降低至30%以下。

圖1 預(yù)熱時間對牛蒡茶黃酮含量、含水率的影響

2.1.2 加熱溫度的選擇

由圖2可知，黃酮含量在加熱溫度60～80 ℃范圍內(nèi)先增加后減少，75 ℃時達(dá)到最高，為1.82 mg/g；含水率逐漸降低，加熱70～80 ℃時，已降低至8%以下。

圖2 加熱溫度對牛蒡茶黃酮含量、含水率的影響

2.1.3 加熱時間的選擇

由圖3可知，黃酮含量在加熱2.5～4.5 h范圍內(nèi)先增加后減少，4 h時含量達(dá)到最高，為1.63 mg/g；含水率逐漸降低，加熱3.5～4.5 h時，已降低至8%以下。

圖3 加熱時間對牛蒡茶黃酮含量、含水率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果（見表2）

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.3 回歸模型的建立和檢驗(yàn)

對3個單因素進(jìn)行回歸擬合，得出黃酮含量（Y）回歸方程：

經(jīng)響應(yīng)面軟件分析，模型p＜0.01，擬合程度較好，決定系數(shù)R2=0.996 8，失擬項(xiàng)p＞0.05，不顯著，說明該方程與實(shí)際情況相符，具有可靠性。預(yù)熱時間、加熱溫度、加熱時間的p值都小于0.01，對黃酮含量有極顯著影響。預(yù)熱時間和加熱時間兩兩交互作用對黃酮含量的影響不顯著，預(yù)熱時間和加熱溫度、加熱時間和加熱溫度兩兩交互作用對黃酮含量影響顯著。

2.4 兩因素間的交互效應(yīng)分析

由圖4可知，交互作用大小為預(yù)熱時間與加熱溫度＞加熱溫度與加熱時間＞預(yù)熱時間與加熱時間。

表3 回歸模型方差分析

圖4 響應(yīng)面分析圖和等高線圖

2.5 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

回歸模型確定的最佳制備工藝為預(yù)熱4.055 h、加熱74.661 ℃、加熱3.959 h，預(yù)測黃酮含量最高為1.825 mg/g。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，按實(shí)際調(diào)整為預(yù)熱4 h、加熱溫度75 ℃、加熱時間4 h，提取的牛蒡黃酮平均含量為2.01 mg/g，和預(yù)期結(jié)果基本相符，回歸模型的預(yù)測性能較好，可用于優(yōu)化牛蒡茶制作工藝。

2.6 理化指標(biāo)

最佳工藝下制備的牛蒡茶，含水率7.90%，復(fù)水比4.85 g/g，說明牛蒡茶接近新鮮狀態(tài)，品質(zhì)好。其他理化指標(biāo)測定結(jié)果見圖5。

從圖5可知，牛蒡茶中Na、Ca、Mg、Fe、Zn等礦物質(zhì)元素含量，Cys、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Ala、Pro等氨基酸含量，總蛋白、脂肪、膳食纖維、黃酮、多糖含量均高于原料牛蒡根；Asp和Glu 2種呈鮮味氨基酸含量占21.13%，說明制備的牛蒡茶營養(yǎng)價值高，口感鮮美。

圖5 牛蒡茶和牛蒡根中理化指標(biāo)測定結(jié)果

2.7 體外抗氧化活性分析

2.7.1 清除DPPH·的能力

由圖6可知，當(dāng)牛蒡茶黃酮質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，清除率已經(jīng)達(dá)到70.07%，在1～5 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系，說明牛蒡茶黃酮對DPPH·具有較好的清除能力，但是相對于VC較弱。牛蒡茶黃酮和VC的IC50分別為2.16和0.017 mg/mL。

2.7.2 清除ABTS+·的能力。

由圖7可知，當(dāng)牛蒡茶黃酮質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，清除率已經(jīng)達(dá)到63.27%，在1～5 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系，說明牛蒡茶黃酮對ABTS+·具有較好的清除能力，但是相對于VC較弱。牛蒡茶黃酮和VC的IC50分別為2.61和0.257 mg/mL。

圖6 牛蒡茶黃酮和VC對DPPH·的清除效果

圖7 牛蒡茶黃酮和VC對ABTS+·的清除效果

3 討論與結(jié)論

研究表明，長時間加熱或高溫容易破壞黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其失去功能[18]。通過在預(yù)熱和加熱階段，以較低溫度、較短時間作用牛蒡，鈍化了酶的活性，減少了對黃酮結(jié)構(gòu)破壞，保證了牛蒡茶的質(zhì)量品質(zhì)。少部分黃酮類物質(zhì)經(jīng)酶促氧化后，可能生成色素物質(zhì)，從而形成牛蒡茶湯色金黃的品質(zhì)特征。

Tian等[19]發(fā)現(xiàn)，牛蒡提取物能夠減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的產(chǎn)生，本研究獲得的牛蒡茶黃酮對DPPH·和ABTS+·都有較好的清除作用，說明其具有一定的還原能力。

牛蒡茶最佳制備工藝為預(yù)熱4 h、加熱溫度75 ℃、加熱時間4 h，黃酮平均含量為2.01 mg/g。最佳工藝下獲得的牛蒡茶含水率為7.90%，復(fù)水比4.85 g/g?？偟鞍住⒅?、膳食纖維、黃酮、多糖含量均高于牛蒡根；黃酮具有較好的體外清除DPPH·和ABTS+·的能力。