蛋黃果營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定及其多糖提取工藝

蔣邊，李衛(wèi)錦，李東娜，謝艷梅，霍平慧

嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（湛江 524048）

蛋黃果又名獅頭果、桃欖、仙桃等，屬山欖科蛋黃果屬多年生植物。因其水分含量少，肉質(zhì)為粉狀，味道及口感都與雞蛋黃相似，故稱之為蛋黃果。蛋黃果原產(chǎn)地為古巴和北美洲熱帶，主要分布于中南美洲、印度、緬甸、越南、柬埔寨、泰國(guó)和中國(guó)南部。蛋黃果現(xiàn)已在我國(guó)海南、廣東、廣西、云南等地栽種[1-2]。蛋黃果果肉營(yíng)養(yǎng)成分齊全，富含碳水化合物和膳食纖維，含有少量的蛋白質(zhì)和脂肪，同時(shí)還含有多種維生素和礦物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的熱帶水果資源[3-4]。蛋黃果種子富含淀粉、粗蛋白、粗脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分，氨基酸組成豐富且配比合理，其中還含多酚、多糖、黃酮等活性物質(zhì)[5]。目前，鮮見(jiàn)關(guān)于蛋黃果果肉氨基酸組成及其含量研究的報(bào)道。

植物多糖是一類天然大分子活性物質(zhì)，廣泛存在于植物體中，主要由醛基和酮基通過(guò)糖苷鍵連接的高分子聚合物[6-7]?，F(xiàn)有大量的相關(guān)研究表明，多糖具有抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、抗菌消炎[10]、降低血糖[11]、提高人體免疫力[12]等重要生物活性。因此，多糖在醫(yī)藥保健品、化妝品、食品等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。植物多糖的提取方法有水提法、酸提法、超聲波提取法、微波提取法等[13]，水提法提取多糖具有操作簡(jiǎn)單、成本低、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[14]，目前已被廣泛應(yīng)用于提取和生產(chǎn)植物多糖。蛋黃果果肉多糖含量較高[15]，蛋黃果的葉子、種子和樹(shù)皮均有抗炎作用[16]，其種子、果肉和果皮提取物的抗氧化活性也很高[17-18]。

此次試驗(yàn)測(cè)定及分析蛋黃果果肉蛋白質(zhì)、粗脂肪、總糖、還原糖、多糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)和活性物質(zhì)的含量，并采用響應(yīng)面優(yōu)化水提法提取蛋黃果多糖的工藝，以期為蛋黃果的加工利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋黃果（市售）；使用化學(xué)試劑均為分析純。

AX224ZH/E型電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；SHZ-D型循環(huán)水（多用真空泵鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；Velocity 14R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司）；YRE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；UV-3000P型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；WZZ-2B型自動(dòng)旋光儀（上海申光儀器儀表有限公司）；SGM.M10/10H型箱式電阻爐（洛陽(yáng)西格馬爐業(yè)股份有限公司）；K9860型自動(dòng)定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；BCD-251WDGW型冰箱（青島海爾股份有限公司）；L-8900型日立氨基酸分析儀（日立高新技術(shù)公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋黃果樣品前處理

新鮮蛋黃果去皮、去核、切碎，置于55 ℃下烘干，打粉，再過(guò)孔徑0.425 mm篩，保存于干燥器中。

1.2.2 蛋黃果營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

采用常壓干燥法測(cè)定水分含量[19]；采用直接灰化法測(cè)定粗灰分含量[20]；采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[21]；采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量[22]；采用旋光法測(cè)定淀粉含量[23]；采用3, 5-二硝基水楊酸比色法測(cè)總糖和還原糖含量[24]；采用氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸成分及其含量[25]。

1.2.3 蛋黃果多糖提取得率的測(cè)定

稱取一定量樣品，按一定液料比添加蒸餾水并混勻，在設(shè)定的溫度下提取一定時(shí)間，按3 000 r/min離心10 min，棄沉淀取上清液，濃縮樣液，加入一定體積95%乙醇，放置4 ℃冰箱24 h，按3 500 r/min離心25 min，棄上清取沉淀，加入適量超純水復(fù)溶，后加入10%三氯乙酸除去蛋白質(zhì)，再按3 500 r/min離心25 min，取上清液，用蒸餾水定容至200 mL，再取1 mL定容至10 mL得稀釋的樣品溶液。采用苯酚硫酸法測(cè)定蛋黃果中多糖的含量[26]，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，各取1 mL蛋黃果多糖樣液進(jìn)行測(cè)定，再按式（1）計(jì)算蛋黃果中的多糖提取得率。

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得的試樣測(cè)定液中多糖含量，μg/mL；V為樣液的總體積，mL；K為稀釋倍數(shù)；m為蛋黃果樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 蛋黃果多糖提取試驗(yàn)單因素設(shè)計(jì)

固定其他因素條件，以醇沉乙醇體積倍數(shù)（1，3，5，7和9倍）、提取時(shí)間（1.5，2，2.5，3和3.5 h）、液料比（30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1和80∶1 mL/g）和提取溫度（50，60，70，80，90和100 ℃）為單因素，考察各因素對(duì)蛋黃果多糖提取得率的影響，確定其最佳因素水平。

1.2.5 蛋黃果多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化蛋黃果多糖提取工藝研究。以醇沉乙醇體積倍數(shù)、提取時(shí)間、液料比、提取溫度作為4個(gè)考察因素，并確定4個(gè)因素的3個(gè)水平，以多糖提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心組合設(shè)計(jì)。因素及其水平如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的因素和水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析的軟件為Design-Expert 8.05b；試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋黃果的營(yíng)養(yǎng)成分及其分析

由表2可知，蛋黃果中蛋白質(zhì)含量為5.07%，粗脂肪含量為3.82%，這兩者含量較低；總糖和還原糖含量比較高，表明蛋黃果是一種碳水化合物含量較高的水果。蛋黃果總氨基酸含量為22.37 mg/g，必需氨基酸與總氨基酸含量比值（EAA/TAA）為38.89%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）為63.64%，必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量非常接近于FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[27]。此外，蛋黃果含多種礦物元素，鉀、鈉、鎂、鈣尤為豐富，且含有鐵、鋅、錳、鎳等人體必需微量元素[28]。

表2 蛋黃果的營(yíng)養(yǎng)成分含量（以干基計(jì)）

2.2 蛋黃果多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 醇沉乙醇體積倍數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響結(jié)果與分析

如圖1所示，多糖提取得率先隨醇沉乙醇體積倍數(shù)的增加而增加，在醇沉乙醇體積倍數(shù)為3倍時(shí)達(dá)到最大值，之后隨醇沉乙醇體積倍數(shù)的增加而減少，主要是因?yàn)榧尤胍掖伎山档退芤旱慕殡姵?shù)，使多糖脫水沉淀；但乙醇體積的增加同時(shí)也使體系總?cè)芤毫吭黾?，稀釋了體系中目標(biāo)物濃度，不利于多糖沉淀[29]。

圖1 醇沉乙醇體積倍數(shù)對(duì)多糖提取得率影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響結(jié)果與分析

如圖2所示，多糖提取得率隨提取時(shí)間先增加后減少，在2 h時(shí)多糖提取得率最大，此時(shí)多糖提取得率平均為3.88%。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，蛋黃果多糖提取得率先隨提取時(shí)間的增加而升高，原因可能是提取時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的溶解程度越充分，故多糖提取率升高；在2 h后多糖提取得率隨時(shí)間的增加而減少，原因可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖降解及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)產(chǎn)生[30]，導(dǎo)致多糖提取得率降低。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響

2.2.3 液料比對(duì)多糖提取得率的影響結(jié)果與分析

如圖3所示，多糖提取得率隨液料比的增加而增加，當(dāng)液料比為60∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取得率最高，之后液料比增加，多糖提取得率呈下降的趨勢(shì)。分析其原因可能是蛋黃果多糖主要存在于由纖維組成的細(xì)胞骨架中，液料比的增加可使更多的多糖擴(kuò)散到骨架內(nèi)部并溶解，所以多糖提取得率先隨液料比的增大而增加。而當(dāng)液料比達(dá)到最高點(diǎn)60∶1（mL/g）后，繼續(xù)增加液料比，多糖提取得率反而有所降低[31]，而且液料比過(guò)高導(dǎo)致后續(xù)醇沉等工藝難度加大，提取成本增加。因此蛋黃果多糖提取的最佳液料比為60∶1（mL/g）。

2.2.4 提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響結(jié)果與分析

如圖4所示，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，蛋黃果多糖提取得率先隨溫度的升高而增加而后降低，在90 ℃時(shí)達(dá)到最大值。蛋黃果多糖提取得率在90 ℃之前隨著提取溫度的提高而增加，分析原因是溫度的提高增加多糖的溶出速度；而在90 ℃之后則隨提取溫度的提高而降低，其原因可能是提取溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致蛋黃果多糖分子降解或破壞，所以其多糖提取得率反而下降，在90 ℃時(shí)多糖提取得率達(dá)到最大值，因此蛋黃果多糖提取最優(yōu)溫度為90 ℃[32]。

圖3 液料比對(duì)多糖提取得率的影響

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛋黃果多糖提取工藝條件結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，4個(gè)因素經(jīng)過(guò)擬合得到蛋黃果多糖提取得率（Y）回歸方程：Y=+4.68-0.40X1+ 0.17X2+0.18X3+0.30X4-0.065X1X2+0.30X1X3-0.087X1X4-0.30X2X3+0.007 5X2X4+0.12X3X4-0.46X12-0.41X22-0.40X32-0.76X42。表4中回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，失擬項(xiàng)p=0.057 0＞0.05，不顯著，表明該方程不失擬，說(shuō)明這個(gè)模型合理且適合擬合試驗(yàn)，p＜0.000 1，方程模型達(dá)到極顯著，說(shuō)明能較好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。

由表4分析可知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，影響蛋黃果多糖提取得率的因素按主次順序?yàn)榇汲烈掖俭w積＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。模型中的一次項(xiàng)X1、X4，平方項(xiàng)X12、X22、X32和X42對(duì)多糖提取得率影響極顯著（p＜0.01）；一次項(xiàng)X2、X3對(duì)多糖提取得率影響顯著（0.01＜p＜0.05）。由交互項(xiàng)p值可知，X1X3和X2X3交互作用顯著（0.01＜p＜0.05），其他變量的影響均不顯著（p＞0.05）。

由圖5（a）可知，當(dāng)醇沉乙醇體積不變時(shí)，隨著料液比的增加，多糖提取得率先增大后降低；當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著醇沉乙醇體積的增加，多糖提取得率先增加后降低，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合。分析圖5（b），同樣與單因素試驗(yàn)結(jié)果相吻合。醇沉乙醇體積和料液比、提取時(shí)間和液料比的等高線圖均為橢圓，說(shuō)明兩兩的均有交互作用，與方差分析結(jié)果吻合[33]。

表3 Box-Behnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 多糖提取得率方差分析結(jié)果

圖5 影響多糖提取得率的因素之間的交互作用

2.3.2 響應(yīng)面最優(yōu)條件優(yōu)化、預(yù)測(cè)和驗(yàn)證通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到蛋黃果多糖提取的最優(yōu)工藝條件：醇沉乙醇體積1.88倍、提取時(shí)間2.11 h、液料比60.20∶1（mL/g）、提取溫度90.51 ℃。此時(shí)，蛋黃果多糖提取得率預(yù)測(cè)值為4.82%。為檢驗(yàn)RSM的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為醇沉乙醇體積2倍、提取時(shí)間2 h、液料比60∶1（mL/g）、提取溫度90 ℃，實(shí)際測(cè)得的蛋黃果多糖提取得率為4.88%。理論預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值相接近，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)蛋黃果多糖提取得率。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)對(duì)蛋黃果營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)蛋黃果多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。相對(duì)于其他水果，蛋黃果的粗脂肪、蛋白質(zhì)、總糖和還原糖含量較高；其氨基酸含量豐富且成分均衡，必需氨基酸與總氨基酸含量比值、必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值達(dá)到聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)多糖提取工藝試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出影響多糖提取得率因素的主次排序：醇沉乙醇體積＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。蛋黃果多糖的最優(yōu)提取條件為醇沉乙醇體積2倍、提取時(shí)間2 h、液料比60∶1（mL/g）、提取溫度90 ℃，此時(shí)，多糖提取得率為4.88%。

蛋黃果含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，具有抗氧化等生物活性[15]和消炎、化痰、活血強(qiáng)身、提神醒腦、減壓減脂等藥用利用價(jià)值[3,34]，具備廣闊的加工利用前景。目前對(duì)蛋黃果的研究多集中在蛋黃果果樹(shù)的栽培育種研究上，對(duì)蛋黃果活性物質(zhì)的提取和開(kāi)發(fā)利用的研究比較少，此次試驗(yàn)所得蛋黃果多糖提取工藝簡(jiǎn)單、成本低、可重復(fù)性強(qiáng)，對(duì)于蛋黃果多糖的提取、生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要的參考意義，為蛋黃果的深入開(kāi)發(fā)與利用提供了可行途徑。