四季青水提液對(duì)慢性變應(yīng)性接觸性皮炎大鼠AIM2/Caspase-1炎癥小體的影響

杜 偉，黃文濤，羅金萍，占敏霞，羅先欽，何白英，張 莉

1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2. 重慶南郊醫(yī)院，重慶 400055

慢性變應(yīng)性接觸性皮炎為皮膚科常見(jiàn)病、多發(fā)病，是因長(zhǎng)期反復(fù)接觸某一弱刺激性、低濃度致敏物質(zhì)引起的皮膚炎癥．在接觸部位呈現(xiàn)紅斑、水腫等炎性表現(xiàn)，病理可觀察到炎細(xì)胞浸潤(rùn)，因此認(rèn)為炎細(xì)胞的募集在變應(yīng)性接觸性皮炎的發(fā)病與進(jìn)展中占主導(dǎo)地位．臨床實(shí)踐中，抗炎是治療變應(yīng)性接觸性皮炎的有效方法之一．中藥四季青在一些研究中被證實(shí)具有良好的抗炎作用[1-2]，亦被配伍用于接觸性皮炎的治療[3]，《中國(guó)藥典》(2015版)提示無(wú)毒性，因此四季青成為治療慢性變應(yīng)性接觸性皮炎的待試藥物．

皮膚是保護(hù)體內(nèi)器官免受外界環(huán)境有害物質(zhì)刺激的重要生理屏障，當(dāng)受到外界因素刺激時(shí)，能分泌多種炎癥因子以積極參與局部甚至全身炎癥反應(yīng)．長(zhǎng)期反復(fù)接觸2，4-二硝基氟苯(DNFB)可引起表皮損傷，肉眼可見(jiàn)紅斑、水腫等炎性損傷的體征，多種細(xì)胞因子異常表達(dá)共同影響其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[4]，如白細(xì)胞介素18(IL-18)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等．也有研究指出，黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)的高表達(dá)是慢性接觸性皮炎反復(fù)發(fā)作的機(jī)制之一[5]．AIM2/半胱氨酸蛋白酶(Caspase-1)組成炎癥小體，分泌炎性因子IL-1β，IL-18．故本課題擬基于四季青的抗炎作用和AIM2炎癥小體信號(hào)通路的特征，觀察四季青水提液對(duì)DNFB誘導(dǎo)大鼠慢性變應(yīng)性接觸性皮炎的治療作用及作用機(jī)制．

1 材 料

1.1 受試藥物

四季青飲片購(gòu)自重慶市中藥研究院門(mén)診部．稱(chēng)取2 kg四季青飲片，加入純化水10 000 mL，浸泡30 min后加熱至100 ℃回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，收集濾液9 200 mL，殘?jiān)尤? 000 mL純化水，采用同樣方法，收集第2次濾液8 700 mL，合并2次濾液共計(jì)約17 900 mL，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 390 mL，得生藥約1.44 g/mL(以長(zhǎng)梗冬青苷計(jì)不低于10.41 mg/g)，分裝后-20 ℃冷凍保存．

1.2 試劑與儀器

DNFB，東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)； 丙酮，重慶川東化工有限公司生產(chǎn)； 大鼠IL-1β，IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于Shanghai Jinjin Chemistry Technology Co.，Ltd； AIM2，Caspase-1一抗及羊抗兔二抗均購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； ST360酶標(biāo)儀，上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司； Mass2000圖象處理系統(tǒng)，四川大學(xué)圖象處理國(guó)家研究所； 熒光定量PCR儀，BIOER公司．

1.3 動(dòng) 物

SD大鼠，SPF級(jí)，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(渝)2017-0003．在溫度為20～26 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%的飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)，使用許可證號(hào)為SYXK(渝)2017-0004．實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求．

2 方 法

2.1 制備模型

SD大鼠(雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g)檢疫及適應(yīng)性飼養(yǎng)后，參照文獻(xiàn)[6]脫毛、DNFB致敏，2周后DNFB激發(fā)，每周激發(fā)1次，共4次，大鼠背部可見(jiàn)明顯紅斑、水腫、結(jié)痂、抓痕、鱗屑，即得到慢性變應(yīng)性接觸性皮炎模型．另8只大鼠(正常大鼠)不作處理．

2.2 分組及藥物干預(yù)

選取造模成功大鼠32只，隨機(jī)區(qū)組法分為4組(每組8只)，即模型對(duì)照組，四季青水提液高、中、低劑量組(每公斤含生藥14.4 g，7.2 g，3.6 g)； 取正常大鼠8只設(shè)為正常對(duì)照組．各組灌胃給予相應(yīng)受試藥物(正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等體積純化水)，給藥體積10 mL/kg，每日1次，給藥周期14 d．

2.3 指標(biāo)觀察及測(cè)定

各組動(dòng)物于首次給藥前、治療7 d后、末次給藥后24 h(觀察終點(diǎn))，肉眼觀察皮損情況，采用EASI評(píng)分方法[7]評(píng)分，考察癥狀包括紅斑、水腫、結(jié)痂，以癥狀總積分來(lái)判斷組間差異，尼莫地平法[8]計(jì)算各組總有效率； 造模前、首次給藥前、治療第7 d后、末次給藥后24 h，顳叢靜脈采集血液0.5 mL，3 000 r/min離心，取上清，ELISA檢測(cè)IL-18，IL-1β水平； 安樂(lè)處死大鼠后，迅速剪取造模局部皮膚，取0.2 g實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)皮損中AIM2，Caspase-1相對(duì)表達(dá)量，剩余造模局部皮膚組織以中性甲醛固定，HE染色，定性觀察組織病理改變，并對(duì)炎細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析．

AIM2，Caspase-1相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)方法： 使用Trizol總RNA提取試劑盒獲得皮損組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA．AIM2引物序列： 上游5’-AAAGCCCAAAACTAAGGTG-3’，下游5’-TCTGCCATACTTATACCCTC-3’； Caspase-1引物序列： 上游5’-TAAATGGATTGCTGGATGAAC-3’，下游5’-TCGTGCCTTTTCCATAACAGT-3’； β-actin引物序列： 上游 5’-CCCATCTATGAGGGTYACGC-3’，下游 5’-TTAATGTCACGCACGATITC-3’．采用DBI三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，行熒光定量PCR，根據(jù)公式 2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量．

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 皮損評(píng)分結(jié)果

皮損癥狀積分結(jié)果及皮損療效總有效率見(jiàn)表1，觀察終點(diǎn)皮損局部情況見(jiàn)圖1．模型對(duì)照組治療7 d后、末次給藥后24 h與首次給藥前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．與模型對(duì)照組比較，在治療7 d后高劑量組皮損積分明顯降低，末次給藥后24 h中、高劑量組皮損積分均明顯降低； 至觀察終點(diǎn)，與模型對(duì)照組比較，中、高劑量組總有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

表1 皮損積分結(jié)果及總有效率

圖1 觀察終點(diǎn)大鼠皮損局部情況

3.2 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖2及圖3．定性觀察： 正常對(duì)照組動(dòng)物皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理變化； 模型對(duì)照組、低劑量組動(dòng)物造模局部表皮真皮纖維組織增生和肉芽組織形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)累及皮下組織； 中、高劑量組動(dòng)物造模局部表皮真皮纖維組織增生修復(fù)良好．定量分析： 與模型對(duì)照組比較，低、中、高劑量組炎細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

圖2 四季青水提液對(duì)大鼠表皮病理變化的影響(HE×40倍)

與模型對(duì)照組比較，*表示p≤0.05，**表示p≤0.01， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖3 四季青水提液對(duì)大鼠皮膚炎細(xì)胞數(shù)的影響

3.3 對(duì)血清IL-18，IL-1β水平的影響

結(jié)果見(jiàn)表2和表3．造模前，模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與正常對(duì)照組比較，各組血清IL-18，IL-1β水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．首次給藥前，模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與正常對(duì)照組比較，各組別血清IL-18，IL-1β水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．治療7 d后，低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型對(duì)照組比較，高劑量組血清IL-18，IL-1β水平均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．末次給藥后24 h，低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型對(duì)照組比較，中、高劑量組血清IL-18水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 高劑量組血清IL-1β水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

表2 各組大鼠血清IL-18水平 pg·mL-1

表3 各組大鼠血清IL-1β水平 pg·mL-1

3.4 對(duì)大鼠皮損AIM2，Caspase-1相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)果見(jiàn)表4．模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組AIM2，Caspase-1均過(guò)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．與模型對(duì)照組比較，通過(guò)四季青水提液干預(yù)后，高劑量組AIM2表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

表4 各組大鼠皮損AIM2，Caspase-1相對(duì)表達(dá)量

4 討論與結(jié)論

減少或避免致敏物質(zhì)的接觸是根治慢性變應(yīng)性接觸性皮炎的有效方法，這一方法操作起來(lái)并不現(xiàn)實(shí)，因一些過(guò)敏物質(zhì)逐漸被發(fā)現(xiàn)而“隱性”存在于多種物品中，如紋身可致慢性變應(yīng)性接觸性皮炎(色素降解產(chǎn)物致敏)[9]、牙醫(yī)接觸牙科材料致接觸性皮炎(樹(shù)脂改性玻璃離聚物致敏)[10]，因此藥物的篩選仍有意義．模型SD大鼠灌胃給予待篩藥物四季青水提液，在治療結(jié)束后可見(jiàn)中、高劑量組皮損積分較模型對(duì)照組顯著降低、總有效率較模型對(duì)照組顯著增加、炎細(xì)胞數(shù)較模型對(duì)照組明顯減少，表明四季青水提液對(duì)DNFB誘導(dǎo)慢性變應(yīng)性接觸性皮炎大鼠炎性皮損有良好的改善作用．

炎癥小體是炎癥研究中的一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，其家族成員眾多，AIM2是其中的一員．AIM2可存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，其N(xiāo)端含有熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)，在C端為核苷酸/寡糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是HIN200家族的成員[11]．AIM2能夠特異性地識(shí)別細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中變異或異位的DNA分子，包括受損的DNA分子以及由于細(xì)胞核核破裂而泄露在胞漿當(dāng)中的DNA片段[12]．皮膚中的AIM2通過(guò)其PYD結(jié)構(gòu)識(shí)別結(jié)合細(xì)胞漿DNA而激活，釋放炎癥因子．基因敲除和基因沉默AIM2后，發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生明顯減少，這表明AIM2對(duì)于炎癥因子的產(chǎn)生或釋放發(fā)揮重要作用[13]．在接觸性皮炎患者皮損中可檢測(cè)出AIM2表達(dá)的升高[14]，提示AIM2炎癥小體在慢性變應(yīng)性接觸性皮炎中發(fā)揮了促炎作用．本研究模型對(duì)照組AIM2表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模擬了慢性變應(yīng)性接觸性皮炎AIM2異常的疾病過(guò)程．通過(guò)四季青水提液的干預(yù)，高劑量組較模型對(duì)照組AIM2表達(dá)顯著降低，表明四季青水提液對(duì)慢性變應(yīng)性接觸性皮炎大鼠AIM2有抑制作用．

Caspase-1屬Caspase家族成員，是炎癥小體活化的必備“元件”．Caspase-1既被認(rèn)為是IL-1β的轉(zhuǎn)化酶，也被認(rèn)為其對(duì)IL-18的成熟分泌起關(guān)鍵作用，因此炎癥小體活化的最終結(jié)果是IL-18和IL-1β的剪切成熟[15]．IL-18，IL-1β同屬I(mǎi)L-1家族，IL-1細(xì)胞因子被認(rèn)為是協(xié)調(diào)急性和慢性炎性疾病的第一個(gè)細(xì)胞因子家族[16]．IL-18參與Th1細(xì)胞活化，但也涉及產(chǎn)生Th2的γδT細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化[17]．IL-1β促進(jìn)白細(xì)胞的浸潤(rùn)、促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖分化等[17]．炎癥因子在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[18]，IL-18，IL-1β共同促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，抑制這些炎性因子可減緩炎癥損傷．經(jīng)四季青水提液干預(yù)后，高劑量組較模型對(duì)照組IL-18，IL-1β水平明顯下調(diào)，表明四季青水提液對(duì)慢性變應(yīng)性接觸性皮炎大鼠IL-18，IL-1β過(guò)表達(dá)有抑制作用．

綜上，本研究表明，四季青水提液對(duì)慢性變應(yīng)性接觸性皮炎大鼠有治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制AIM2/Caspase-1炎癥小體信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的．