雙生子兒童體型相關(guān)指標(biāo)的遺傳度及與DRD 3基因單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性分析

其麗木格, 鄂 勇, 烏云達(dá)來(lái), 李玉玲

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022;2.內(nèi)蒙古莫力達(dá)瓦達(dá)斡爾族自治旗人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 莫力達(dá)瓦旗 162850)

體型是人體骨骼、肌肉、體脂、身材等的綜合反應(yīng),對(duì)青少年的生理機(jī)能、運(yùn)動(dòng)素質(zhì)、心理情感、社會(huì)適應(yīng)性發(fā)展及職業(yè)選擇意向都有一定影響[1-2]。圍度、身高及體重等測(cè)量指標(biāo),可從不同角度反映骨骼、脂肪的發(fā)育狀況,而由各原始測(cè)量指標(biāo)衍生的許多指數(shù)還可以綜合反映身體各部位的比例和體型發(fā)育狀況[2]。身高、體重作為我國(guó)學(xué)生最基礎(chǔ)的指標(biāo)在相關(guān)研究中一直廣受重視,由其衍生的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)主要反映體型的胖瘦程度,間接反映營(yíng)養(yǎng)狀況,是目前國(guó)際上最廣泛的一種評(píng)價(jià)肥胖的方法[3]。腰臀比(waist-hip ratio,WHR)是腰圍與臀圍的比值,可反映體內(nèi)多余脂肪的分布特征。研究提示：腰圍、WHR能很好地評(píng)價(jià)中心性肥胖[2]。近年來(lái),隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變,肥胖已成為主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此,與之相關(guān)的BMI、WHR在肥胖篩查中有著重要意義。

賈娜等[4]對(duì)66對(duì)7～16歲雙生子研究發(fā)現(xiàn),身高、體重的遺傳度分別為0.84、0.77,提示身高、體重主要受遺傳因素影響。Lise等[5]對(duì)加拿大、瑞典、丹麥和澳大利亞地區(qū)的3～19歲雙生子研究發(fā)現(xiàn),身高(0.40～0.95)、體重(0.48～0.94)和BMI(0.45～0.91)等指標(biāo)的遺傳度受遺傳與環(huán)境的共同影響。張棟等[6]利用MX軟件對(duì)11～19歲雙生子的腰圍和腰臀比遺傳度的研究發(fā)現(xiàn),青島市青少年雙生子腰圍遺傳度為0.08,WHR遺傳度為0.53,提示腰圍主要受環(huán)境因素的影響,腰臀比則與遺傳、環(huán)境因素相關(guān)。D?ring等[7]研究發(fā)現(xiàn),兒童腰圍發(fā)育以及肥胖程度與家長(zhǎng)的飲食習(xí)慣密切相關(guān),超重或肥胖的兒童成年后肥胖的風(fēng)險(xiǎn)更大,提示對(duì)兒童早期的環(huán)境干預(yù)是預(yù)防成年期肥胖的關(guān)鍵。因此,深入了解兒童體型相關(guān)指標(biāo)的發(fā)育及其影響因素,對(duì)體型發(fā)育以及肥胖預(yù)防都具有重要意義。

目前,關(guān)于體型與肥胖相關(guān)基因的研究也日益受到重視。多巴胺是主要的兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì),控制著運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、攝食、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種功能[8-9]。根據(jù)多巴胺受體基因結(jié)構(gòu)及藥理性將其分為D1類(lèi)和D2類(lèi)受體兩個(gè)大家族：D1類(lèi)家族包括D1和D5受體亞型,D2樣家族包括D2、D 3和D4受體亞型。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于多巴胺D2受體基因(dopamine D2 receptor,DRD2)和多巴胺D4受體基因(dopamine D4 receptor,DRD4)與體型指標(biāo)相關(guān)的研究較多,而多巴胺D 3受體基因(dopamine D 3 receptor,DRD3)的相關(guān)研究則相對(duì)較少。DRD3位于3q13.3,主要存在于伏隔核和紋狀體[10],其序列變異可能引起受體結(jié)構(gòu)或表達(dá)的細(xì)微改變,從而導(dǎo)致不同的表型。研究發(fā)現(xiàn),DRD3基因的變異可能會(huì)引起多巴胺敏感性改變,進(jìn)而導(dǎo)致與進(jìn)食相關(guān)的愉悅感降低[11]。Berridge[12]研究發(fā)現(xiàn),投射到腹側(cè)紋狀體伏隔核的中腦多巴胺神經(jīng)元與食物和藥物獎(jiǎng)勵(lì)密切相關(guān),有可能影響所消耗的能量。此外,也有研究表明DRD3與藥物及酒精成癮有關(guān)[13]。一項(xiàng)研究表明,三種DRD3基因型可以預(yù)測(cè)注意缺陷多動(dòng)障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)癥狀,而ADHD與肥胖率和暴飲暴食癥狀密切相關(guān)[14]。Avena等[15]研究發(fā)現(xiàn),一些肥胖人群對(duì)糖的渴望類(lèi)似于藥物成癮,而DRD3被認(rèn)為在心理刺激的獎(jiǎng)勵(lì)作用中起著直接作用,因此這一類(lèi)人的攝食量比普通人更大,從而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪堆積,一定程度上導(dǎo)致肥胖。目前關(guān)于多巴胺與身心發(fā)育有關(guān)的研究受到廣泛的關(guān)注[16-17],但在國(guó)內(nèi)外研究中還未發(fā)現(xiàn)DRD3基因多態(tài)性與體型相關(guān)指標(biāo)的研究,有些機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本文擬以雙生子兒童為研究對(duì)象,在分析各指標(biāo)遺傳度基礎(chǔ)上,以DRD3基因SNP為遺傳標(biāo)記,初步探討遺傳因素對(duì)兒童體型相關(guān)指標(biāo)的影響,提供分子生物學(xué)資料,為今后深入分析其影響因素奠定基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

在父母及學(xué)生知情同意情況下,以學(xué)校為單位,在呼和浩特市和包頭市募集160對(duì)4～12歲雙生子。每對(duì)雙生子均共同生活,就讀于同一所學(xué)校,身體健康。其中同卵雙生子(monozygotic,MZ)68對(duì),男34對(duì),女34對(duì); 異卵雙生子(dizygotic,DZ)92對(duì),均為同性別雙生子,其中男44對(duì),女48對(duì)。為了解不同發(fā)育期對(duì)各體型相關(guān)指標(biāo)的遺傳效應(yīng)的影響,本文在分析遺傳度時(shí)將4～12歲雙生子兒童分為學(xué)齡前期(4～6歲)和學(xué)齡期(7～12歲)兩個(gè)年齡組。

1.2 研究方法

1.2.1 體型相關(guān)測(cè)量指標(biāo) 依據(jù)《人體測(cè)量方法》[3]測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo),測(cè)量前統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),并保證每對(duì)雙生子的測(cè)量在同一時(shí)間段內(nèi)完成,包括身高、體重、腰圍、臀圍4項(xiàng)體型指標(biāo)。根據(jù)體格原始測(cè)量指標(biāo)計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和腰臀比指數(shù)(WHR),公式分別為IBM=(M/H2)×104和RWH=(W/C)×100。其中,M為體重(kg),H為身高(cm),W為腰圍(cm),C為臀圍(cm)。

1.2.2 全基因組DNA提取 使用一次性口腔拭子刮取雙生子口腔上皮細(xì)胞,利用TIANamp Swab DNA Kit(TIANGEN BIOTECH,Beijing,China)試劑盒提取全基因組DNA。

1.2.3 卵型鑒定 利用Amp FISTR Sino filerPlus試劑盒(PE Applied Biosystems Inc,Perkin Elmer,Foster City,CA,USA)對(duì)16個(gè)STR位點(diǎn)(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D 3S1358、D12S391、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、D6S1043、D5S818、D18S51、FGA、性別鑒定Amelogenin)的一致性進(jìn)行鑒定。

1.2.4DRD3基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè) 采用SNaPshot技術(shù)測(cè)定4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型。利用Pre-mier 3.0 設(shè)計(jì)SNP位點(diǎn)的上下游引物; 應(yīng)用PTC-100PCR儀對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增; 采用SNaPshot SNP分型技術(shù)進(jìn)行SNP分型; 在1個(gè)含有測(cè)序酶、4種熒光標(biāo)記的ddNTP、在鄰近SNP位點(diǎn)5’端的不同長(zhǎng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中,引物延伸一個(gè)堿基即終止,經(jīng)3730xl型測(cè)序儀測(cè)序,根據(jù)峰的顏色可知摻入堿基的種類(lèi),從而確定樣本的基因型,根據(jù)峰的移動(dòng)位置可確定該延伸引物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用Epidata 3.0錄入數(shù)據(jù),雙核查邏輯檢錯(cuò)。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理; 兩類(lèi)雙生子各指標(biāo)性別間差異性由獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)完成。對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),對(duì)不符合正態(tài)分布的體重、腰圍、臀圍、WHR、BMI進(jìn)行對(duì)數(shù)(lgx)轉(zhuǎn)換。根據(jù)最大似然法原理,采用MX軟件擬合最佳結(jié)構(gòu)方程模型,估算遺傳度。用GEE模型分析DRD3基因單核苷酸多態(tài)性與雙生子兒童體型指標(biāo)的相關(guān)性。使用Haploview 4.2進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)檢驗(yàn)。同卵雙生子、同性別異卵雙生子對(duì)內(nèi)方差和對(duì)間方差齊性檢驗(yàn)用F檢驗(yàn),組內(nèi)相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)用Z檢驗(yàn)。相關(guān)公式如下:

2 結(jié)果

2.1 各指標(biāo)對(duì)內(nèi)方差、對(duì)間方差及組內(nèi)相關(guān)系數(shù)比較

矯正年齡后,同性別雙生子各指標(biāo)對(duì)內(nèi)方差、對(duì)間方差以及組內(nèi)相關(guān)系數(shù)比較發(fā)現(xiàn),男、女各指標(biāo)的對(duì)內(nèi)方差均為MZ>DZ,男、女各指標(biāo)均存在顯著差異(P<0.05),如表1所示。男、女各指標(biāo)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)均為rMZ<2rDZ,提示結(jié)構(gòu)方程模型分析時(shí)可擬合ACE模型[2]。

表1 4～12歲男、女生雙生子兒童各指標(biāo)對(duì)內(nèi)、對(duì)間方差及組內(nèi)相關(guān)系數(shù)比較

2.2 不同發(fā)育期雙生子兒童體格指標(biāo)遺傳度分析

運(yùn)用MX軟件進(jìn)行模型擬合,結(jié)果如表2所示。4～12歲男、女兩類(lèi)雙生子各指標(biāo)最佳模型均為ACE模型,擬合優(yōu)度(P>0.05)均較好,表明學(xué)齡雙生子兒童體型相關(guān)指標(biāo)受遺傳與環(huán)境的共同影響。其中,身高、學(xué)齡前期BMI、學(xué)齡前期腰圍、學(xué)齡期臀圍、學(xué)齡期WHR擬合的最佳模型為模型VI,男、女遺傳度相等,但男性共同環(huán)境效應(yīng)為女性的k倍(cm=kcf); 體重、學(xué)齡期腰圍、學(xué)齡前期WHR最佳模型為模型IV,男、女共同環(huán)境效應(yīng)相等(cf=cm); 學(xué)齡期BMI、學(xué)齡前臀圍的最佳模型為模型II,不存在男孩特異的加性遺傳方差(a’m=0)。

結(jié)果顯示(表2),女生除臀圍(學(xué)齡前0.22,學(xué)齡期0.72)外,其余各指標(biāo)遺傳度均為學(xué)齡前期高于學(xué)齡期; 男生各指標(biāo)遺傳度均為學(xué)齡前期高于學(xué)齡期。學(xué)齡前期男生臀圍(0.86)、WHR(0.71)遺傳度分別高于女生學(xué)齡前期臀圍(0.22)、WHR(0.51),學(xué)齡期男生體重(0.70)、腰圍(0.54)等指標(biāo)遺傳度高于女生學(xué)齡期體重(0.47)、腰圍(0.27); 其余指標(biāo)在同發(fā)育階段遺傳度男女相等。

表2 兩個(gè)發(fā)育期體格指標(biāo)及衍生指標(biāo)的最佳模型

2.3 DRD 3基因SNP與雙生子兒童體型指標(biāo)相關(guān)性分析

采用廣義估計(jì)方程模型分析DRD3基因SNP與體型相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。為避免樣本流失,將一對(duì)雙生子設(shè)為重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù),其中主體變量為編號(hào),主體內(nèi)變量為出生順序,選擇Unstructured工作相關(guān)矩陣,分別以雙生子體格指標(biāo)為因變量,以基因型為自變量,選擇Linear分析方法進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示,DRD3基因4個(gè)SNP與BMI無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。體重分別與rs167771、rs226082存在相關(guān)(P<0.05),rs167771攜帶G等位基因個(gè)體的體重值高于AA基因型的個(gè)體,rs226082攜帶C等位基因個(gè)體的體重值高于TT基因型的個(gè)體; 身高與rs324029存在相關(guān)(P<0.05),rs324029攜帶G等位基因個(gè)體的身高值低于AA基因型的個(gè)體; 腰圍與rs167771存在相關(guān)(P<0.05),rs167771攜帶GG基因型個(gè)體的腰圍值低于攜帶A等位基因的個(gè)體; 臀圍與rs226082存在相關(guān)(P<0.05),CT基因型個(gè)體的臀圍值高于CC基因型和TT基因型等純合子個(gè)體; WHR分別與rs324029、rs167771、rs226082存在相關(guān)(P<0.05),rs324029的AA基因型個(gè)體WHR值高于攜帶G等位基因的個(gè)體,rs167771攜帶A等位基因個(gè)體的WHR值高于GG基因型的個(gè)體,rs226082的CC基因型個(gè)體的WHR值低于攜帶T等位基因的個(gè)體。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)rs2134655與六個(gè)指標(biāo)均無(wú)相關(guān)關(guān)系。

2.4 DRD 3基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)連鎖不平衡分析

根據(jù)DRD3基因多態(tài)性4個(gè)SNP位點(diǎn)的位置分布情況,使用Haploview分析軟件計(jì)算等位基因的連鎖不平衡系數(shù)D′、r2,檢驗(yàn)基因的連鎖強(qiáng)度。當(dāng)D′和r2的取值為0時(shí),表示位點(diǎn)間連鎖達(dá)到完全平衡; 當(dāng)D′和r2的值越接近于1,表示越趨于連鎖不平衡; 當(dāng)D′和r2的值等于1時(shí),表示位點(diǎn)間連鎖完全不平衡。連鎖不平衡系數(shù)D′以描述LD水平,相關(guān)程度系數(shù)(r2)值以反映兩位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的顯著性水平,根據(jù)文獻(xiàn)分別將其定為r2>0.8且D′>0.7進(jìn)行連鎖不平衡分析[18-19]。

表3 DRD 3基因多態(tài)性與雙生子兒童體型相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

續(xù)表3 DRD 3基因多態(tài)性與雙生子兒童體型相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖1 4～12歲雙生子兒童DRD 3受體基因SNPs不平衡圖

結(jié)果顯示(圖1),rs2134655與rs167771之間為(D′=1.0,r2=0.045),rs167771與rs226082之間為(D′=0.097,r2=0.001),rs226082與rs324029之間為(D′=0.578,r2=0.286),rs2134655與rs226082之間為(D′=0.436,r2=0.022),rs2134655與rs324029之間為(D′=0.741,r2=0.061),rs167771與rs324029之間為(D′=0.146,r2=0.009),表明本研究中4個(gè)SNP間連鎖強(qiáng)度較弱。

3 討論

雙生子研究是闡明遺傳與環(huán)境因素對(duì)人類(lèi)表型相對(duì)效應(yīng)的最佳方法,用MX軟件擬合最佳模型估算遺傳度,能更加充分利用雙生子資料,使結(jié)果更加精確[2]。有研究發(fā)現(xiàn),體格指標(biāo)的遺傳效應(yīng)存在一定的性別、年齡或發(fā)育期及族群差異[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),男、女生體重、腰圍、臀圍、WHR等指標(biāo)的遺傳度存在一定性別差異,且男生的遺傳度多數(shù)高于女生,女生更易受環(huán)境因素的影響; 除女生臀圍外,其余各指標(biāo)男女遺傳度均為學(xué)齡前期高于學(xué)齡期,提示兒童不同發(fā)育期體型相關(guān)指標(biāo)受遺傳與環(huán)境因素影響程度不同。

李小燕等[22]采用Holzinger的改良遺傳度計(jì)算法(h2)對(duì)合肥市60對(duì)4～14歲兒童的研究發(fā)現(xiàn),身高遺傳度0.71,體重遺傳度0.54,與本次研究中學(xué)齡期兒童身高遺傳度一致,而體重遺傳度與本研究中女生遺傳度較接近,而與男生差異較大。張棟等[23]利用MX軟件對(duì)青島11～19歲雙生子兒童少年遺傳度計(jì)算發(fā)現(xiàn),BMI遺傳度男女均為0.75,略高于本研究中學(xué)齡期兒童的BMI遺傳度,造成該結(jié)果可能與本研究分性別計(jì)算遺傳度有關(guān)。欒天抒等[24]采用MX軟件對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和包頭市3～6歲雙生子兒童的研究發(fā)現(xiàn),腰圍遺傳度(男生0.77、女生0.72)略低于本文學(xué)齡前兒童的研究結(jié)果,臀圍遺傳度(男生0.49、女生0.62)與本研究略有差異,這可能與樣本構(gòu)成有關(guān),本研究中不包含異性別異卵雙生子。Lee等[25]對(duì)青島、麗水成年雙生子的研究發(fā)現(xiàn),腰圍的遺傳度(0.75)和WHR的遺傳度(0.61)與本研究結(jié)果均有不同,可能與兩個(gè)樣本的年齡構(gòu)成不同有關(guān)。金佰明等[26]采用Holzinger改良遺傳度計(jì)算法對(duì)齊齊哈爾市25周歲及以上雙生子的研究發(fā)現(xiàn),WHR遺傳度為0.42,與本研究中學(xué)齡期兒童WHR的遺傳度一致。季成葉[27]指出,遺傳度只是一個(gè)描述性統(tǒng)計(jì)量,不同群體有不同遺傳度,同一群體在不同生長(zhǎng)發(fā)育期遺傳度也不同,遺傳度還受種族、族群、地區(qū)影響?？傮w而言,本研究中多數(shù)體型相關(guān)指標(biāo)的遺傳度與國(guó)內(nèi)外同年齡段的相關(guān)研究結(jié)果接近,但與成年人的研究結(jié)果差異較大,提示年齡或發(fā)育期可能是影響遺傳度的因素之一。

本研究初步發(fā)現(xiàn),體重分別與rs167771、rs226082存在相關(guān),身高與rs324029存在相關(guān),腰圍與rs167771存在相關(guān),臀圍與rs226082存在相關(guān),WHR分別與rs324029、rs167771、rs226082存在相關(guān); 而B(niǎo)MI與本研究探討的DRD3基因各SNP均無(wú)相關(guān)性。多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要神經(jīng)遞質(zhì),可以通過(guò)中腦邊緣獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制調(diào)節(jié)食物攝取量。DRD3在伏隔核與紋狀體內(nèi)大量表達(dá),這個(gè)區(qū)域與獎(jiǎng)勵(lì)、成癮與行為密切相關(guān),有研究表明DRD3與暴飲暴食癥有關(guān)聯(lián)。這一類(lèi)人對(duì)食物有著沖動(dòng)行為[28],一些肥胖人群特別是暴食癥患者,可能會(huì)對(duì)影響健康的美味食物產(chǎn)生不健康的依賴(lài),從而產(chǎn)生食物成癮[14]。有研究表明,某些人感覺(jué)尋求的改變與DRD3基因rs167771的變異有關(guān)[29]。關(guān)于DRD3基因與食物攝入的報(bào)道較多,但與體型相關(guān)指標(biāo)直接相關(guān)的研究尚未發(fā)現(xiàn)。

本研究以學(xué)齡前及學(xué)齡雙生子為研究對(duì)象,報(bào)道了4～12歲兒童體型相關(guān)指標(biāo)的遺傳度,初步探討了DRD3基因4個(gè)SNP對(duì)各指標(biāo)的影響,研究結(jié)果對(duì)于深入了解雙生子兒童體型發(fā)育特點(diǎn),以及遺傳與環(huán)境因素的相對(duì)效應(yīng)具有一定的理論意義,也可為兒童制定肥胖預(yù)防措施、改善兒童飲食行為等研究提供一定科學(xué)依據(jù)。