拉曼檢測(cè)系統(tǒng)中微量試樣自動(dòng)混勻控制裝置設(shè)計(jì)與試驗(yàn)

閆 帥 李永玉 彭彥昆 韓東海 劉亞超

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

拉曼散射是一種分子散射光譜，可以反映分子機(jī)構(gòu)的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，具有特異性“指紋式”分子識(shí)別能力[1]。當(dāng)分析物分子在增強(qiáng)基底金銀等粗糙金屬表面吸附時(shí)，入射激光沖擊金屬粗糙表面產(chǎn)生的局部表面等離子體共振可以顯著提高分子的拉曼散射效應(yīng)，從而獲得高靈敏度的表面增強(qiáng)拉曼光譜[2-3]。解析表面增強(qiáng)拉曼光譜可以實(shí)現(xiàn)體系中目標(biāo)物的定性和定量分析，目前在生物、化學(xué)、食品安全檢測(cè)等諸多領(lǐng)域已有研究和應(yīng)用[4-10]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜具有高度的敏感性、強(qiáng)大的特異性分子識(shí)別能力和不受水環(huán)境干擾的特點(diǎn)，只需微量液態(tài)樣品即可實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)[11-13]。在拉曼光譜檢測(cè)過(guò)程中，拉曼散射受到分析物在底物表面吸附效果的影響，若無(wú)法保證有效均勻的表面吸附，則難以保證表面增強(qiáng)拉曼光譜的重復(fù)性和穩(wěn)定性[14]。表面增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度由金屬表面的局部電場(chǎng)強(qiáng)度、增強(qiáng)區(qū)內(nèi)分析物的數(shù)量以及激光功率、光斑大小等因素決定[15]，表面增強(qiáng)劑與樣品混合的時(shí)間和均勻性差異極易造成表面增強(qiáng)“熱點(diǎn)”的分布不均，直接影響拉曼光譜檢測(cè)穩(wěn)定性。另外，激光光源到樣品表面的微小距離變化將導(dǎo)致樣品表面激光功率以及激光斑點(diǎn)大小的差異[16]，對(duì)拉曼光譜穩(wěn)定性影響也較大。目前，表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)中增強(qiáng)劑和液態(tài)樣品的混合吸附過(guò)程一般均人為操作，受主觀因素的影響，難以保證樣品和增強(qiáng)金屬粒子混合吸附程度的均一性和操作過(guò)程時(shí)間的一致性。自動(dòng)控制表面增強(qiáng)劑和微量液態(tài)樣品的混勻吸附過(guò)程、提高表面增強(qiáng)拉曼光譜穩(wěn)定性對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜定量分析具有重要意義。

本文以提高表面增強(qiáng)拉曼光譜重復(fù)性為目的，為保證分析物和增強(qiáng)金屬納米顆?；旌衔降木恍?，基于實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置，設(shè)計(jì)微量液態(tài)樣品和表面增強(qiáng)劑自動(dòng)混勻控制裝置，開(kāi)發(fā)基于NI LabVIEW的上位機(jī)軟件，實(shí)現(xiàn)微量液態(tài)樣品和表面增強(qiáng)劑自動(dòng)混勻進(jìn)樣、吸附時(shí)間及光譜采集自動(dòng)控制等功能。以市售蜂蜜中硝基呋喃妥因、磺胺甲氧噠嗪兩種獸藥殘留為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性，以期為液態(tài)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜快速定量檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 自動(dòng)混勻控制拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 系統(tǒng)組成及檢測(cè)原理

表面增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)的穩(wěn)定性與重復(fù)性受試樣與表面增強(qiáng)劑混勻吸附均一性影響，控制微流體的混合過(guò)程對(duì)于定性、定量分析至關(guān)重要。本文基于實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置[17]，設(shè)計(jì)表面增強(qiáng)劑與微量液態(tài)樣品自動(dòng)混勻控制裝置，旨在確保液態(tài)樣品和表面增強(qiáng)劑混勻吸附均一性，提高表面增強(qiáng)拉曼光譜的穩(wěn)定性和重復(fù)性。所設(shè)計(jì)的表面增強(qiáng)劑與微量液態(tài)樣品自動(dòng)混勻控制裝置通過(guò)拉曼檢測(cè)探頭與拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置相連，即通過(guò)支架將拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置的拉曼探頭固定于自動(dòng)混勻控制裝置的樣品槽上方激光焦距處(7.5 mm)，探頭通過(guò)分叉光纖分別與激光器、光譜儀相連；CCD相機(jī)和自動(dòng)混勻裝置通過(guò)USB數(shù)據(jù)線與計(jì)算機(jī)通信，上位機(jī)軟件進(jìn)行光譜信號(hào)處理與控制混勻裝置機(jī)械動(dòng)作，如圖1所示。

樣品槽中添加試樣和表面光增強(qiáng)劑后，通過(guò)自動(dòng)混勻裝置上的機(jī)械按鈕或上位機(jī)軟件中開(kāi)始檢測(cè)按鈕一鍵式觸發(fā)檢測(cè)過(guò)程。進(jìn)出樣模塊的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)旋轉(zhuǎn)臺(tái)帶動(dòng)試樣由進(jìn)樣口傳送至檢測(cè)口，同時(shí)混勻模塊通過(guò)偏振電機(jī)高速旋轉(zhuǎn)造成樣品板的振蕩使樣品槽中的試樣液滴與表面增強(qiáng)劑充分混勻吸附?？刂颇K通過(guò)串口通訊控制單片機(jī)和接收單片機(jī)反饋信號(hào)，識(shí)別按鈕觸發(fā)，驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器和直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器從而控制進(jìn)出樣模塊與混勻模塊。當(dāng)試樣到達(dá)檢測(cè)位置且完成設(shè)定時(shí)間的振蕩混勻后，單片機(jī)向上位機(jī)反饋信號(hào)，上位機(jī)控制拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置采集光譜數(shù)據(jù)。各模塊的結(jié)構(gòu)及連接關(guān)系如圖2所示。

1.2 硬件設(shè)計(jì)

根據(jù)連續(xù)多次測(cè)樣、自動(dòng)化、微量試樣混勻、控制簡(jiǎn)單的思路，分別設(shè)計(jì)了進(jìn)出樣模塊、混勻模塊、控制系統(tǒng)模塊。根據(jù)光學(xué)檢測(cè)需要屏蔽外部光信號(hào)干擾的要求，將3個(gè)模塊集成于金屬殼體中，其中控制模塊的電氣部分與機(jī)械部分相互隔離，如圖3所示。裝置外側(cè)設(shè)計(jì)了樣品架便于試樣的存放，整個(gè)裝置的各部件靈活可調(diào)，拉曼探頭與支架以及檢測(cè)孔處的連接固定處設(shè)計(jì)了軟接觸保護(hù)，以免損傷光學(xué)器件。自動(dòng)混勻裝置加工實(shí)物如圖4所示，整體尺寸(長(zhǎng)×寬×高)為300 mm×200 mm×250 mm，便于光譜儀間的移植使用。

1.2.1進(jìn)出樣模塊

進(jìn)出樣模塊主要完成樣品輸送功能，包括樣品板、電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)、步進(jìn)電機(jī)、工位調(diào)節(jié)手輪、旋轉(zhuǎn)體5個(gè)部件，如圖5所示。為實(shí)現(xiàn)連續(xù)批量的測(cè)樣功能，采用了多樣品槽設(shè)計(jì)。樣品板頂面均勻分布了兩周半球形樣品槽，每周30個(gè)，通過(guò)滑板與滑槽的設(shè)計(jì)，可精確控制兩周樣品槽的切換利用。樣品板通過(guò)螺釘固定，簡(jiǎn)單可靠，方便更換，加工多個(gè)樣品板更換使用，保障了足量樣品的檢測(cè)能力。為檢測(cè)過(guò)程的連續(xù)與自動(dòng)化，使用了電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)。利用高精度電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)，根據(jù)設(shè)置時(shí)間精確控制樣品槽在進(jìn)樣口與檢測(cè)孔之間的轉(zhuǎn)移，保證試樣滴加后操作時(shí)間的一致性，同時(shí)避免了樣品在激光下長(zhǎng)時(shí)間照射造成的過(guò)熱、灼燒問(wèn)題。表面增強(qiáng)劑與試樣的混合吸附時(shí)長(zhǎng)對(duì)采集光譜信號(hào)穩(wěn)定性和重復(fù)性影響非常大，同一樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)隨時(shí)長(zhǎng)變化如圖6所示。

另外，光譜采集過(guò)程中激光拉曼探頭與檢測(cè)試樣的距離應(yīng)保持在激光焦距約7.5 mm，而且應(yīng)避免外界光的干擾，將進(jìn)樣槽設(shè)置在檢測(cè)孔180°方向，通過(guò)電控旋轉(zhuǎn)臺(tái)的旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)樣品輸送，如圖7所示，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程小于30 s。步進(jìn)電機(jī)連續(xù)運(yùn)行會(huì)造成累積誤差，設(shè)計(jì)在裝置殼體外的工位調(diào)節(jié)手輪可微調(diào)因累積誤差造成的樣品槽位置偏移。

1.2.2混勻模塊

目前常用的混勻裝置為機(jī)械振搖式，通過(guò)電機(jī)帶動(dòng)偏振塊高速旋轉(zhuǎn)振搖達(dá)到分散混勻的目的。然而現(xiàn)有的機(jī)械混勻裝置體積大、功能單一，難以實(shí)現(xiàn)微量物質(zhì)的混合操作，無(wú)法滿足表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)中微量試樣和增強(qiáng)劑均勻混合的需求。

混勻模塊通過(guò)固定于振動(dòng)平板的微型直流電機(jī)帶動(dòng)偏振子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生振蕩，振蕩經(jīng)3根連接振動(dòng)平板與樣品板的傳振立柱傳導(dǎo)，引發(fā)樣品槽內(nèi)液體的快速波動(dòng)，使原本上下分層的粘稠液滴快速融合吸附。如圖8所示，混勻后的液面平整，能避免人工混合造成的液面變化，有利于消除因激光斑點(diǎn)大小差異造成的拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度變異。

混勻模塊整體設(shè)計(jì)為旋轉(zhuǎn)體，以滿足連續(xù)檢測(cè)的需求。振蕩的發(fā)生與消除在中空的旋轉(zhuǎn)體內(nèi)部，振源部分采用懸浮式設(shè)計(jì)，利用壓縮彈簧將振動(dòng)平板支持固定于旋轉(zhuǎn)體殼體上的沉頭孔內(nèi)?？紤]振動(dòng)平板的大小以及傳振立柱的分布，上下各采用3根0.6 mm×11 mm×30 mm的不銹鋼壓縮彈簧，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證可有效吸收激振，消除噪聲與殼體振動(dòng)。振動(dòng)平板、傳動(dòng)立柱的材料選用聚甲醛(POM)材料，強(qiáng)度、剛度高，彈性好，質(zhì)量輕。選用的5 V直流高速偏振電機(jī)作為振蕩源，體積小，易驅(qū)動(dòng)，滿足樣品槽中微量液態(tài)試樣的混勻需求。電機(jī)導(dǎo)線通過(guò)旋轉(zhuǎn)體底部的空槽引出，并通過(guò)導(dǎo)電滑環(huán)連接外部電路，避免了因連續(xù)旋轉(zhuǎn)造成導(dǎo)線纏繞卡死，保證了設(shè)備的連續(xù)運(yùn)行。

1.2.3控制模塊

控制模塊連接整個(gè)系統(tǒng)，并控制完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，由計(jì)算機(jī)、單片機(jī)、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、直流電機(jī)、直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、降壓板以及若干開(kāi)關(guān)按鈕組成，如圖9所示。因SH-215B型高性能細(xì)分驅(qū)動(dòng)器的供電電源為24 V直流電，選用了24 V直流電源適配器，并通過(guò)直流可調(diào)降壓穩(wěn)壓板對(duì)5 V直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器與單片機(jī)供電。STC89C52RC單片機(jī)編程簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，單片機(jī)通過(guò)USB數(shù)據(jù)線與上位機(jī)進(jìn)行串口通訊、控制按鈕功能以及驅(qū)動(dòng)電機(jī)工作，從而實(shí)現(xiàn)了裝置的控制。

1.3 系統(tǒng)控制軟件

基于NI LabVIEW軟件開(kāi)發(fā)工具，基于G語(yǔ)言編寫(xiě)了上位機(jī)控制軟件，軟件圖形界面如圖10所示。上位機(jī)軟件可設(shè)定相關(guān)光譜采集和振動(dòng)混勻時(shí)間參數(shù)，同時(shí)具備觸發(fā)采集、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和光譜顯示功能。上位機(jī)控制軟件和下位機(jī)自動(dòng)混勻控制裝置的控制流程如圖11所示。上位機(jī)首先判斷下位機(jī)開(kāi)關(guān)按鈕狀態(tài)，當(dāng)開(kāi)關(guān)按鈕閉合時(shí)，觸發(fā)上位機(jī)開(kāi)始檢測(cè)按鈕，或者通過(guò)上位機(jī)軟件操作界面直接觸發(fā)開(kāi)始檢測(cè)按鈕。開(kāi)始檢測(cè)按鈕觸發(fā)后，上位機(jī)向單片機(jī)發(fā)送開(kāi)始檢測(cè)信號(hào)，單片機(jī)接收信號(hào)后向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器發(fā)送脈沖，步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣，同時(shí)轉(zhuǎn)換直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器信號(hào)端口電平向直流電機(jī)供電混合樣品。達(dá)到設(shè)定振動(dòng)混勻時(shí)間后，上位機(jī)向單片機(jī)發(fā)送指令，單片機(jī)控制直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)器信號(hào)引腳電平轉(zhuǎn)換，振動(dòng)停止。當(dāng)單片機(jī)完成發(fā)送指定的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)脈沖數(shù)后，向上位機(jī)發(fā)送到位信號(hào)，上位機(jī)控制光譜采集系統(tǒng)獲取光譜信息，并實(shí)時(shí)顯示在上位機(jī)界面。完成設(shè)定積分次數(shù)后，上位機(jī)向單片機(jī)發(fā)送信號(hào)，單片機(jī)向步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器發(fā)送指定數(shù)量的脈沖，驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)旋轉(zhuǎn)到下一個(gè)空樣品槽位置，等待下一次進(jìn)樣。上位機(jī)完成光譜數(shù)據(jù)處理后，顯示預(yù)測(cè)值并復(fù)位開(kāi)始檢測(cè)按鈕。

2 自動(dòng)混勻控制拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)試驗(yàn)

2.1 試驗(yàn)材料與方法

2.1.1試驗(yàn)材料

于北京美廉美超市購(gòu)買(mǎi)某品牌棗花蜂蜜，用于不同濃度獸藥殘留樣品的制備。硝基呋喃妥因(高效液相色譜大于98%)、磺胺甲氧噠嗪(高效液相色譜大于98%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，用于獸藥拉曼特征位移的確定以及樣品的加標(biāo)。

2.1.2試驗(yàn)方法

樣品制備：利用硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪標(biāo)準(zhǔn)品分別配制質(zhì)量比為20 mg/kg的硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪水溶液，將配制好的藥品溶液逐級(jí)稀釋并按照質(zhì)量比1∶1與蜂蜜混合，分別制備硝基呋喃妥因、磺胺甲氧噠嗪質(zhì)量比范圍在0～10 mg/kg的蜂蜜樣品各39個(gè)。

表面增強(qiáng)劑制備：根據(jù)Lee-Meisel經(jīng)典方法[18]制備銀溶膠，置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

光譜采集及預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)室自行搭建的拉曼點(diǎn)檢測(cè)裝置，設(shè)定曝光時(shí)間為1 s，激光功率為120 mW，手工操作采集蜂蜜樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜。然后將表面增強(qiáng)劑與試樣自動(dòng)混勻控制裝置與拉曼點(diǎn)檢測(cè)裝置相連，設(shè)定振動(dòng)混勻時(shí)間為7 s，保持同樣的曝光和激光功率，采集蜂蜜樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜。所獲光譜均利用Matlab R2016進(jìn)行Savitzky-Golay(S-G)5點(diǎn)平滑和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)預(yù)處理。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1蜂蜜中兩種獸藥拉曼特征位移的歸屬

2.2.2兩種獸藥拉曼特征峰值穩(wěn)定性比較分析

分別采集硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪質(zhì)量比為2.5、5、7.5、10 mg/kg的蜂蜜樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜，對(duì)比使用自動(dòng)混勻控制裝置前后采集的獸藥拉曼特征峰值穩(wěn)定性以驗(yàn)證裝置使用效果。每個(gè)濃度的樣品分別重復(fù)試驗(yàn)10次，采集的蜂蜜表面增強(qiáng)拉曼光譜均經(jīng)過(guò)S-G與SNV預(yù)處理，其中硝基呋喃妥因預(yù)處理后的光譜曲線如圖14所示。經(jīng)對(duì)比分析，自動(dòng)混勻控制裝置使用前獸藥拉曼特征峰值強(qiáng)度在每個(gè)濃度分布離散，峰值強(qiáng)度與濃度的相關(guān)性較差，而使用自動(dòng)混勻控制裝置后，采集的獸藥拉曼特征峰值強(qiáng)度和濃度之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)系，且每個(gè)濃度所獲取的峰值強(qiáng)度分布集中，圖15為不同濃度的硝基呋喃妥因表面增強(qiáng)拉曼特征峰值強(qiáng)度箱線圖。另外，使用自動(dòng)混勻控制裝置后，所獲硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪拉曼特征峰值在不同濃度下變異系數(shù)明顯優(yōu)于僅使用拉曼點(diǎn)檢測(cè)裝置采集的結(jié)果，其中硝基呋喃妥因1 353 cm-1處的平均峰值變異系數(shù)降為0.032 2，1 612 cm-1處的平均峰值變異系數(shù)降為0.04；磺胺甲氧噠嗪833 cm-1處的平均峰值變異系數(shù)降為0.036 1，1 124 cm-1處的平均峰值變異系數(shù)降為0.064 9。其中，硝基呋喃妥因拉曼特征峰值強(qiáng)度變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明使用自動(dòng)混勻控制裝置顯著提高了采集光譜數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，減小了因人工操作造成的誤差，有利于后續(xù)蜂蜜中硝基呋喃妥因定量預(yù)測(cè)分析。

表1 蜂蜜中硝基呋喃妥因表面增強(qiáng)拉曼特征峰值強(qiáng)度變異系數(shù)Tab.1 Coefficients of variation of SERS characteristic peaks intensity of nitrofurantoin in honey

2.2.3蜂蜜中獸藥定量預(yù)測(cè)模型建立

表2 蜂蜜中獸藥殘留一元線性回歸模型的校正集和驗(yàn)證集結(jié)果Tab.2 Calibration and prediction results of linear regression model of veterinary drug residues in honey

3 結(jié)論

(1)設(shè)計(jì)了表面增強(qiáng)劑與試樣自動(dòng)混勻控制拉曼光譜檢測(cè)硬件系統(tǒng)，系統(tǒng)主要由拉曼光譜點(diǎn)檢測(cè)裝置、表面增強(qiáng)劑和微量液態(tài)樣品自動(dòng)混勻控制裝置及數(shù)據(jù)處理部分組成。該系統(tǒng)保證每次檢測(cè)樣品與增強(qiáng)劑的均勻混合吸附條件的一致性，提高了表面增強(qiáng)拉曼光譜重復(fù)性。

(2)基于NI LabVIEW軟件開(kāi)發(fā)工具，采用G語(yǔ)言編寫(xiě)了實(shí)時(shí)控制分析軟件，實(shí)現(xiàn)了微量液態(tài)樣品和表面增強(qiáng)劑自動(dòng)混勻進(jìn)樣、光譜采集及數(shù)據(jù)處理等一鍵式操作，通過(guò)上位機(jī)與下位機(jī)均可一鍵完成檢測(cè)。

(3)通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了表面增強(qiáng)劑與試樣自動(dòng)混勻控制拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，利用表面增強(qiáng)劑與試樣自動(dòng)混勻控制拉曼檢測(cè)系統(tǒng)采集的硝基呋喃妥因拉曼特征平均峰值強(qiáng)度變異系數(shù)降為0.04以下，顯著提高了拉曼光譜穩(wěn)定性。蜂蜜中硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪兩種獸藥的最佳一元線性回歸模型驗(yàn)證集決定系數(shù)分別為0.961 9與0.979 0，均方根誤差為0.672 3 mg/kg與0.518 6 mg/kg，說(shuō)明自動(dòng)混勻裝置在提高光譜穩(wěn)定性的同時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)蜂蜜中獸藥殘留的定量預(yù)測(cè)。