內(nèi)生真菌Paraconiothyrium brasiliense代謝產(chǎn)物β-咔啉生物堿及其黃嘌呤氧化酶抑制活性研究

周繼慧，閆鑫磊，田 夢(mèng)，李 慧，劉朝霞，劉呈雄,2*，鄒 坤*

1三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002

川芎哚(川芎Ⅲ號(hào)堿，perlolyrine)是中藥川芎的有效活性β-咔啉生物堿之一，具有很強(qiáng)的藥理活性，對(duì)冠心病和腦血管病有一定的療效，但其在體內(nèi)代謝迅速、排泄較快、生物利用度低及藥效維持時(shí)間較短，經(jīng)化學(xué)改造后的川芎哚類(lèi)似物在抗血小板聚集和體外抗血栓形成作用明顯強(qiáng)于川芎哚和川芎嗪，且作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)[1-4]，然而植物來(lái)源的川芎哚含量較少且其類(lèi)似物種類(lèi)較少，且目前為止，微生物來(lái)源的川芎哚，非常罕見(jiàn)，只有Jishengellaendophytica[5]和真菌Fusariumequiseti[6]、Trametestrogii[7]能產(chǎn)川芎哚。因此，有必要通過(guò)各種有效途徑獲取川芎哚類(lèi)似物，研究其構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制，從中篩選出高效、低毒、作用時(shí)間長(zhǎng)的治療心血管疾病的新型藥物。

本課題組前期從中華劍角蝗腸道中分得一株類(lèi)殼小圓孢真菌Paraconiothyriumbrasiliense(P.brasiliense)，經(jīng)發(fā)酵后分離，首次發(fā)現(xiàn)該真菌可生產(chǎn)天然川芎哚[8,9]，但其產(chǎn)量很低，本課題通過(guò)前體添加介導(dǎo)該株真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)，結(jié)果使得川芎哚的產(chǎn)量得到明顯提高，且生成了10個(gè)β-咔啉生物堿，文獻(xiàn)報(bào)道化合物3具有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制活性[10]，近年來(lái)，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體研究都證實(shí)了黃嘌呤氧化酶與心血管疾病密切相關(guān)，黃嘌呤氧化酶抑制劑可應(yīng)用于多種心血管疾病的治療[11]。本研究通過(guò)測(cè)定10個(gè)所分離的生物堿對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性，以別嘌呤醇作為陽(yáng)性藥，選擇出抑制活性較好的化合物，研究其構(gòu)效關(guān)系，對(duì)于川芎哚及其類(lèi)似物的產(chǎn)量和種類(lèi)提供了思路，并為開(kāi)發(fā)出具有優(yōu)良利用價(jià)值的黃嘌呤氧化酶抑制劑提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400 MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)；Waters 1525EF高效液相色譜(美國(guó)Waters公司)；Venusil XBP C18色譜柱(250 mm×10 mm，10 μm，半制備型；250 mm×4.6 mm，5 μm，分析型，天津博納艾杰爾科技有限公司)；低溫冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Labconco公司)；正相色譜硅膠(煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所)；電子天平(上海民橋精密儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司)；黃嘌呤氧化酶(signa)；別嘌呤醇(Ruibio)；黃嘌呤氧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；高效液相用乙腈、甲醇均為色譜純(美國(guó)Tedia公司)，水為三蒸水；其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 菌種與材料

本實(shí)驗(yàn)室前期從中華劍角蝗腸道中分得一株類(lèi)殼小圓孢真菌Paraconiothyriumbrasiliense(P.brasiliense，Genbank Accession No.KM880019)，經(jīng)發(fā)酵后分離，首次發(fā)現(xiàn)該真菌可生產(chǎn)天然川芎哚(已授權(quán)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)：ZL201610408151.X)。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：新鮮的去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖 20.0 g，瓊脂20.0 g，自然pH，0.1 MPa，滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基(g/L)：新鮮的去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖 20.0 g，自然pH，0.1 MPa，滅菌20 min。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵、提取和分離

將采用PDA培養(yǎng)基活化好的菌種接種于PDB培養(yǎng)基，在28 ℃，180 rpm條件下分批次加入終濃度為1.0 mM的前體L-色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)20天后收集發(fā)酵液和菌絲體，采用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液3次，菌絲體在45 ℃條件下烘干，加入丙酮浸泡過(guò)夜，超聲(45 ℃、60 W)提取30 min，反復(fù)提取3次，合并所有浸提物總重量為15 g?？偺崛∥镞M(jìn)行正相硅膠(200～300目)柱層析分離，采用氯仿-甲醇=20∶1(體積比)橫梯度洗脫，共得到50個(gè)流份。進(jìn)行TLC檢測(cè)，展開(kāi)體系為：氯仿-甲醇=15∶1(體積比)，在365 nm紫外燈下觀察熒光，再用改良碘化必鉀噴霧顯色，觀察有無(wú)橙色斑點(diǎn)，經(jīng)TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)第25個(gè)到第30個(gè)流份，共6個(gè)流份中具有紫外365 nm熒光顯色和改良碘化必鉀噴霧顯橙色的斑點(diǎn)，合并這6個(gè)流份。合并后經(jīng)制備型和半制備型高效液相(HPLC)反復(fù)精制純化。最終分離得到化合物1(200 mg)、2(3.0 mg)、3(2.5 mg)、4(3.1 mg)、5(3.4 mg)、6(3.6 mg)、7(3.3 mg)、8(3.4 mg)、9(2.0 mg)、10(2.3 mg)?；衔锝Y(jié)構(gòu)均采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)波譜方法鑒定，并與文獻(xiàn)對(duì)照確定化合物1～10的結(jié)構(gòu)。

2.2 黃嘌呤氧化酶抑制活性

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用前體介導(dǎo)調(diào)控技術(shù)，以L-色氨酸作為前體添加后，川芎哚的含量顯著提高，且通過(guò)TLC 365 nm顯色和生物堿顯色反應(yīng)以及HPLC DAD紫外掃描，發(fā)現(xiàn)一系列與川芎哚紫外吸收類(lèi)似的峰如圖1所示，最終分離得到10個(gè)化合物如圖1所示。

圖1 添加L-色氨酸后菌株發(fā)酵液HPLC分析Fig.1 The HPLC analysis of fermentation broth of L-tryptophan added into the strain注：a：未添加L-色氨酸；b：添加L-色氨酸。Note:a:No L-tryptophan added,b:L-tryptophan added.

化合物1淡黃色針狀晶體;mp.185～187 ℃；UVλmax= 237，252，275，292，364，378 nm；EI-MS：m/z264 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.30(1H，s，H-9)，8.36(1H，d，J= 5.1 Hz，H-3)，8.26(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，8.07(1H，d，J= 5.1 Hz，H-4)，7.79(1H，d，J= 8.2 Hz，H-8)，7.59(1H，t，J= 7.0 Hz，H-7)，7.28(1H，t，J= 7.9 Hz，H-6)，7.20(1H，d，J= 3.4 Hz，H-3′)，6.58(1H，d，J= 3.4 Hz，H-4′)，4.65(2H，s，H-6′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.7(C-2′)，152.1(C-5′)，140.9(C-1)，138.2(C-3)，133.1(C-8a)，130.5(C-4b)，129.4(C-6)，128.4(C-9a)，121.6(C-5)，120.6(C-4a)，119.7(C-7)，113.6(C-4)，112.5(C-3′)，109.6(C-4′)，109.0(C-8)，55.9(C-6′)。該化合物由苯環(huán)、吡啶環(huán)和呋喃環(huán)構(gòu)成，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為川芎哚。

化合物2淡黃色粉末;mp.190～191 ℃；UVλmax=237，252，275，292，364，378 nm；EI-MS：m/z284 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.51(1H，s，H-9)，8.24(1H，d，J=5.2 Hz，H-3)，8.20(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，8.00(1H，d，J=5.2 Hz，H-4)，7.70(1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，7.52(1H，ddd，J=8.2，7.2，1.0 Hz，H-7)，7.22(1H，ddd，J=7.8，7.2，0.5 Hz，H-6)，5.32(1H，br t，J=6.5 Hz，H-1′)，3.56(1H，ddd，J=9.2，5.6，2.8 Hz，H-3′)，3.51(1H，m，H-5a′)，3.33(1H，m，H-4′)，3.33(1H，m，H-5b′)，2.30(1H，ddd，J=14.0，6.3，2.8 Hz，H-2a′)，1.98(1H，ddd，J=14.0，9.2，7.5 Hz，H-2b′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：148.0(C-1)，140.6(C-8a)，136.5(C-3)，132.8(C-9a)，128.2(C-4a)，127.8(C-7)，121.4(C-5)，120.5(C-4b)，119.0(C-6)，113.5(C-4)，112.4(C-8)，75.0(C-4′)，72.0(C-1′)，70.2(C-3′)，63.1(C-5′)，39.4(C-2′)。該化合物由苯環(huán)、吡啶環(huán)和1′，2′-二去氧吡喃核糖構(gòu)成，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為1-(1′,2′-dideoxy-α-D-ribopyranosyl)-β-carboline。

化合物3淡黃色粉末;mp.231～233 ℃；UVλmax=217，275，364，378 nm；EI-MS：m/z308 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.68(1H，s，H-9)，8.85(1H，s，H-4)，8.43(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.83(1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，7.67(1H，t，J= 7.8 Hz，H-7)，7.44(1H，d，J=3.3 Hz，H-4′)，7.37(1H，t，J=7.5 Hz，H-6)，6.64(1H，d，J=3.3 Hz，H-3′)，4.67(2H，s，H-6′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：167.3(C-7′)，158.6(C-2′)，151.5(C-5′)，141.9(C-8a)，132.9(C-1)，132.3(C-9a)，130.3(C-3)，129.4(C-7)，122.4(C-5)，121.4(C-4b)，121.0(C-4a)，119.3(C-6)，116.1(C-4)，113.3(C-8)，111.5(C-4′)，109.7(C-3′)，56.4(C-6′)。該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為flazin。

化合物4淡黃色粉末;mp.225～227 ℃；UVλmax=238，254，272，295，366，375 nm；EI-MS：m/z302 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.45(1H，s，H-9)，8.24(1H，d，J= 5.2 Hz，H-3)，8.21(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，8.00(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4)，7.71(1H，d，J=8.7 Hz，H-8)，7.52(1H，t，J=7.4 Hz，H-7)，7.22(1H，t，J=7.4 Hz，H-6)，5.30(1H，m，H-1′)，3.51(1H，m，H-3′)，3.48(1H，overlapped，H-5′a)，3.34(1H，overlapped，H-5′b)，3.33(1H，m，H-4′)，3.31(1H，m，H-2′a)，1.97(1H，m，H-2′b)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：148.4(C-1)，141.0(C-8a)，137.0(C-3)，133.1(C-9a)，128.7(C-4a)，128.2(C-7)，121.8(C-5)，120.9(C-4b)，119.4(C-6)，114.0(C-4)，113.0(C-8)，75.5(C-4′)，72.6(C-1′)，70.6(C-3′)，63.9(C-5′)，40.9(C-2′)。該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為tangutorid E。

化合物5淡黃色粉末;mp.202～204 ℃；UVλmax= 260，282，305，380 nm；EI-MS：m/z210 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.90(1H，s，H-9)，8.50(1H，d，J= 4.7 Hz，H-3)，8.42(1H，d，J= 5.0 Hz，H-4)，8.30(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，7.80(1H，d，J= 8.0 Hz，H-8)，7.60(1H，ddd，J= 8.2，7.2，1.0 Hz，H-7)，7.30(1H，ddd，J= 8.2，7.2，1.0 Hz，H-6)，2.80(3H，s，H-2′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：201.9(C-1′)，142.3(C-1)，137.8(C-3)，136.2(C-8a)，134.3(C-9a)，131.3(C-4b)，129.3(C-6)，122.2(C-5)，120.7(C-4a)，120.3(C-7)，120.0(C-4)，113.5(C-8)，26.4(C-2′)。該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18,19]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為1-acetyl-β-carboline。

化合物6淡黃色粉末;mp.234～236 ℃；UVλmax= 220，282，308，380 nm；EI-MS：m/z268 [M]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.97(1H，s，H-9)，8.52(1H，d，J=4.9 Hz，H-3)，8.46(1H，d，J= 4.9 Hz，H-4)，8.32(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，7.81(1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，7.61(1H，m，H-7)，7.32(1H，m，H-6)，3.53(1H，d，J=6.8 Hz，H-3′)，2.70(1H，d，J=6.8 Hz，H=2′)；13C NMR (100 MHz，DMSO-d6)δ：201.8(C-4′)，173.8(C-1′)，141.8(C-1)，137.8(C-3)，135.7(C-8a)，133.9(C-9a)，131.2(C-4b)，129.3(C-6)，122.2(C-5)，120.6(C-4a)，120.3(C-7)，119.8(C-4)，113.5(C-8)，31.0(C-3′)，29.4(C-2′)。該化合物的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為4-(9H-β-carbolin-1-yl)-4-oxobutyric acid。

化合物7淡黃色粉末;mp.127～129 ℃；UVλmax= 236，253，274，292，365，378 nm；EI-MS：m/z234 [M]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.38(1H，s，H-9)，8.46(1H，d，J= 5.2 Hz，H-3)，7.89(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4)，8.15(1H，d，J= 7.7 Hz，H-5)，7.58(1H，m，H-6)，7.35(1H，m，H-7)，7.33(1H，overlapped，H-8)，6.71(1H，dd，J= 3.4，1.7 Hz，H-3′)，7.64(1H，m，H-4′)，7.74(1H，m，H-5′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：154.6(C-2′)，142.8(C-5′)，140.4(C-1)，138.9(C-3)，133.3(C-8a)，131.4(C-4b)，130.3(C-9a)，128.6(C-6)，121.7(C-5)，121.2(C-4a)，120.1(C-7)，113.7(C-4)，112.4(C-3′)，111.5(C-4′)，108.7(C-8)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[21,22]，鑒定該化合物7為1-(furan-2-yl)-9H-pyrido[3,4-b]indole。

化合物8淡黃色粉末;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：10.80(1H，s，-NH)，7.52(1H，d，J=7.7 Hz，H-4)，7.33(1H，d，J=8.1 Hz，H-7),7.14(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，7.06(1H，m，H-6)，6.97(1H，m，H-5)，3.65(2H，t，J=7.2 Hz，H-2′)，2.85(2H，t，J=7.2 Hz，H-1′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：136.6(C-7a)，127.7(C-3a)，123.2(C-2)，121.2(C-6)，118.8(C-5)，118.6(C-4)，112.0(C-7)，111.7(C-3)，62.2(C-2′)，29.3(C-1′)。通過(guò)分析化合物8的1H NMR譜和13C NMR譜，該化合物為一個(gè)吲哚類(lèi)生物堿，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[23]，鑒定該化合物為indole-3-ethanol。

化合物9淡黃色粉末;分子式：C10H11NO，mp.163～165 ℃；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：10.90(1H，s，-NH)，7.51(1H，d，J=7.7 Hz，H-4)，7.35(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.23(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，7.09(1H，m，H-6)，6.99(1H，m，H-5)，3.64(2H，s，H-1′)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：173.8(C-2′)，136.6(C-7a)，127.9(C-3a)，123.2(C-2)，121.2(C-6)，118.8(C-5)，118.6(C-4)，112.0(C-7)，108.3(C-3)，31.6(C-1′)。通過(guò)分析化合物9的1H NMR譜和13C NMR譜，該化合物為一個(gè)吲哚類(lèi)生物堿，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[24]，鑒定該化合物為indole-3-acetic acid。

化合物10淡黃色粉末;分子式：C9H7NO，EI-MS：m/z145 [M]+。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：9.94(1H，s，-NH)，8.29(1H，s，H-2)，8.10(1H，d，J=7.1 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J=7.6 Hz，H-7)，7.27(1H，td，J=7.5，1.3 Hz，H-6)，7.23(1H，td，J=7.5，1.3 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：185.4(C-1′)，139.0(C-7a)，137.7(C-2)，124.7(C-3a)，121.3(C-4)，118.6(C-3)，123.9(C-6)，122.5(C-5)，112.9(C-7)。通過(guò)分析化合物10的1H NMR譜和13C NMR譜，該化合物為一個(gè)吲哚類(lèi)生物堿，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[25]，鑒定該化合物為indole-3-carboxaldehyde。

圖2 化合物1～10的結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of compounds 1-10

3.2 黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)化合物1～10進(jìn)行抑酶活性篩選，通過(guò)測(cè)試酶反應(yīng)后與顯色劑生成的紫色化合物吸光度的大小可間接反應(yīng)黃嘌呤氧化酶的活性，紫色化合物吸光度越大，酶活性越強(qiáng)。不同濃度的別嘌呤醇作為陽(yáng)性藥對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用的測(cè)試結(jié)果如表1所示，其半數(shù)抑制濃度為1.61 mM，與文獻(xiàn)[12，26]報(bào)道數(shù)據(jù)較一致，具有一定重復(fù)性和參考價(jià)值。10個(gè)化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用的測(cè)定結(jié)果如表2所示，其中7個(gè)化合物具有不同程度的抑制作用，化合物2、3和6對(duì)黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度最小，分別為0.90、0.98和0.68 mM，且明顯好于別嘌呤醇。與川芎哚(化合物1)(IC50=2.84 mM)的活性相比，4個(gè)川芎哚類(lèi)似物(化合物2～4、6)的抑制作用更佳。

表1 別嘌呤醇對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用結(jié)果(n=3)

4 討論與結(jié)論

微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物與植物來(lái)源相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，具有生長(zhǎng)周期短、可代謝調(diào)控、可規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)。本課題菌株雖然可產(chǎn)生川芎哚，但在發(fā)酵產(chǎn)物中含量很低。關(guān)于川芎哚的生物合成途徑研究也未見(jiàn)報(bào)道，如何通過(guò)菌株的代謝調(diào)控，提高川芎哚或其類(lèi)似物的產(chǎn)量，是本課題繼續(xù)開(kāi)展的關(guān)鍵所在。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，川芎哚化學(xué)合成中最重要的一步是L-色氨酸和5-乙酰氧甲基糠醛通過(guò)Pictet-Spengler(P-S)反應(yīng)的環(huán)化，且P-S反應(yīng)酶(Pictet-Spenglerase)是β-咔啉類(lèi)生物堿合成的關(guān)鍵酶[27]。所以，本課題通過(guò)對(duì)真菌進(jìn)行前體介導(dǎo)從而完成次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控，對(duì)提取物浸膏進(jìn)行LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)其中含有大量生物堿，分子量在m/z200～400之間，符合川芎哚類(lèi)似物的分子量推測(cè)，因此，可以推測(cè)，L-色氨酸前體的加入，激活了β-咔啉類(lèi)似物的沉默基因簇的表達(dá)，合成了大量的生物堿。本課題通過(guò)研究從中獲得了10個(gè)生物堿類(lèi)化合物，以上化合物均為首次從該屬菌株中分離得到，其中7個(gè)β-咔啉生物堿，6個(gè)川芎哚類(lèi)似物，有針對(duì)性的提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類(lèi)；對(duì)10個(gè)生物堿進(jìn)行了黃嘌呤氧化酶抑制活性測(cè)試，結(jié)果顯示7個(gè)化合物具有明顯的抑制活性，IC50值的范圍在0.68～9.30 mM之間，化合物2、3和6的抑制作用效果明顯，且優(yōu)于陽(yáng)性藥。4個(gè)川芎哚類(lèi)似物(化合物2～4、6)與川芎哚(化合物1)的活性相比，抑制作用更佳。Li等[10]從醬油中也分離得到化合物3，生物活性篩選結(jié)果表明，化合物3具有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制活性(IC50= 0.51 ± 0.05 mM)，與本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較一致，他們根據(jù)熒光猝滅和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)化合物3能通過(guò)疏水作用力和氫鍵進(jìn)入黃嘌呤氧化酶催化中心與氨基酸Lys1045、Gln1194和Arg912相互作用產(chǎn)生抑制活性；而且該化合物的ADME(吸收、分布、代謝、排泄)藥物體內(nèi)過(guò)程結(jié)果表明，其在體內(nèi)具有良好的口服生物利用度；此外，該課題組[28]還發(fā)現(xiàn)化合物3有較強(qiáng)的抗HIV活性(EC50=2.36 μM，TI=12.1)，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾得到flazinamide后，發(fā)現(xiàn)其顯示出很強(qiáng)的抗HIV-1活性(EC50=0.38μM，TI=312.0)，現(xiàn)已進(jìn)入臨床前各項(xiàng)研究工作。另外有研究表明[29]，在四氫-β-咔啉的3位引入羧酸側(cè)鏈，可提高其生物溶解度，使其具有更高的抗血栓活性及抗血小板聚集活性，而化合物3即為川芎哚的3位羧酸化產(chǎn)物。結(jié)合以上文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)化合物1～10的初步構(gòu)效關(guān)系分析，可以看出，β-咔啉生物堿的3位羧酸化(化合物3)，及1位側(cè)鏈的羥基化(化合物2)或羧基化(化合物6)，均能夠有效提高黃嘌呤氧化酶抑制活性。近年來(lái)，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體研究都證實(shí)了黃嘌呤氧化酶與心血管疾病密切相關(guān)，黃嘌呤氧化酶抑制劑可應(yīng)用于多種心血管疾病的治療。本文的研究結(jié)果對(duì)于川芎哚及其類(lèi)似物的產(chǎn)量和種類(lèi)提供了思路，并為開(kāi)發(fā)出具有優(yōu)良利用價(jià)值的黃嘌呤氧化酶抑制劑提供了參考依據(jù)。

表2 不同濃度化合物1～10對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率(n=3)