二代測序檢測上行型與下行型鼻咽癌中高頻突變基因的研究

李佳星 曹輝 張瑜 李勇 王姿 景楚瀅 黃立敏

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)發(fā)病率位于我國耳鼻喉惡性腫瘤之首[1]，常見于我國南方地區(qū)。其主要的治療方法包括放療、化療、靶向及免疫治療，目前局部晚期鼻咽癌患者的控制率仍較差，約25%的局部晚期患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。因此，如何有效降低鼻咽癌的局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移對提高鼻咽癌患者治療療效具有重大意義。臨床上，鼻咽癌可表現(xiàn)為上行型、下行型或混合型三種類型[3]。三種類型具有顯著不同的臨床特征。分析并尋找它們之間的分子差異，對鼻咽癌的分子分型、治療選擇、預(yù)后預(yù)測等相關(guān)機制研究均具有十分重要的意義。

近年來，基因測序廣泛應(yīng)用于癌癥診療等領(lǐng)域，二代測序(Next-generation sequencing，NGS)具有高通量、高敏感性等優(yōu)點[4]。利用NGS篩選鼻咽癌的致病基因，尋找并分析不同臨床特征類型鼻咽癌的基因表達差異有望改進鼻咽癌的診療現(xiàn)狀。本研究利用NGS技術(shù)對40例鼻咽癌患者病變組織DNA進行檢測，挖掘并分析鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，為探索鼻咽癌相關(guān)基因診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月—2018年12月就診于貴州省人民醫(yī)院腫瘤科的40例鼻咽癌患者腫瘤組織，其中上行型鼻咽癌20例，為G1組，下行型鼻咽癌20例，為G2組。納入標準：(1)經(jīng)組織病理學(xué)診斷為鼻咽癌患者；(2)上行型鼻咽癌患者：局部損害嚴重，向上破壞顱底骨和顱神經(jīng)；下行型鼻咽癌患者：局部損害較輕，無顱底骨和顱神經(jīng)損害，頸部淋巴結(jié)多處轉(zhuǎn)移或形成巨大腫塊；(3)年齡范圍為20～70歲，本研究40例患者年齡42～63歲，平均(49.76±6.62)歲；(4)臨床病例資料完善，包括患者一般情況、病理資料、臨床分期相關(guān)資料(血常規(guī)、生化、EB-DNA、胸部CT、腹部CT或超聲、鼻咽部及頸部MRI、骨掃描等)、治療過程(放化療劑量及次數(shù)、靶向藥物劑量及次數(shù))、放化療前后影像學(xué)對比資料。每例患者留取活檢石蠟包埋組織樣本。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA的提取 采集鼻咽部活檢組織石蠟包埋組織切片，活檢組織留取3～5 μm厚度切片，經(jīng)病理評估每張切片腫瘤細胞比例大于20%，儲存于-20℃冰箱待用。采用DNA QIAamp FFPE組織試劑盒嚴格按照說明書提取石蠟包埋組織DNA，采用Nanodrop2000評估DNA質(zhì)量，將提取好的DNA儲存于-20℃冰箱待用。

1.2.2 NGS基因測序 使用人全外顯子組序列捕獲試劑盒SureSelect Human All Exon Kitversion 2，基因組DNA被隨機片段化，并與探針雜交捕獲、富集，然后采用Illumina高通量測序平臺進行測序，每個樣本的最小平均測序深度為50x。(1)文庫制備：DNA片段化：提取基因組DNA，文庫制備前使用Qubit system對基因組DNA進行質(zhì)檢；(2)質(zhì)量檢測：使用2100Bioanalyzer System和DNA1000 Assay運用Agilent2100 Expert軟件選擇合適的檢測程序，輸入樣品編號和注釋，加入樣品，開始檢測；(3)末端修復(fù)：使用SureSelect Library Prep Kit，ILM進行雜交及雜交后擴增；(4)生物信息學(xué)分析：測序完成后，下機數(shù)據(jù)fastq格式文件，采用BWA(Burrows Wheeler Aligner，Version 0.7.12)[5]序列比對軟件將每個樣本的原始測序堿基序列與人類參考基因組序列(hg19)進行比對，分別應(yīng)用SOAPsnp和SAMtools[6]等軟件檢測單核苷酸變異和小片段插入/缺失。

1.2.3 高頻突變基因的選擇 剔除同義突變、非移碼突變、既不是exonic也不是splicing類型的突變以及數(shù)據(jù)庫人群頻率≥2‰的突變，在此基礎(chǔ)上挑選出頻率≥5%且support reads≥4，深度≥40的高頻突變。

1.2.4 鼻咽癌臨床病理分期 根據(jù)AJCC(American Joint Committee on Cancer，美國癌癥聯(lián)合委員會)鼻咽癌TNM分期標準第七版對鼻咽癌標本進行分期。

1.2.5 KEGG信號通路分析 將G1組高頻突變基因和G2組高頻突變基因在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行分析，找到其參與的KEGG信號通路，為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

運用Microsoft EXCEL進行數(shù)據(jù)匯總，SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布計量資料數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；分類變量選擇χ2檢驗，連續(xù)性校正卡方檢驗或Fisher精確檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上行型鼻咽癌患者與下行型鼻咽癌患者間的臨床特征的比較

兩組臨床特征見表1。

表1 上行型鼻咽癌患者與下行型鼻咽癌患者間臨床特征的比較

2.2 上行型鼻咽癌與下行型鼻咽癌間的差異突變基因

通過NGS檢測上行型和下行型鼻咽癌，共發(fā)現(xiàn)20種高頻突變基因，其中BCL9L、COL4A2、LGR5、LSR、SPEG、ABCC2、ALPK2、ASB15、ASRGL1、ATXNAL、C5orf42、CCDC88A、CEBPZ、CELSR3、CEP290、COL6A5基因突變率上行型鼻咽癌患者高于下行型鼻咽癌患者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CEP170B、ABCA13、CACNA1F、CELSR2基因突變率上行型鼻咽癌低于下行型鼻咽癌患者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中CEP170B基因在下行型鼻咽癌患者的突變率為57%，在上行型組中未檢測到該基因的突變，該基因在下行型組鼻咽癌患者中的突變率明顯高于上行型鼻咽癌患者(P<0.05)(圖1)。

圖1 G1與G2組基因突變情況

2.3 在下行型鼻咽癌中突變基因的信號通路

通過二代外顯子測序，發(fā)現(xiàn)CEP170B基因趨向于在G2組出現(xiàn)；CACNA1F基因傾向于在G2組出現(xiàn)，其與MAPK信號通路有關(guān)(圖2)。

圖2 MAPK通路圖

2.4 G1與G2組的腫瘤突變負荷關(guān)系

上行型鼻咽癌組與下行型鼻咽癌組的腫瘤突變負荷分別為1.93(0.99～3.61)和1.01(0.65～4.95)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.470)(圖3)。

圖3 G1與G2組的腫瘤突變負荷

2.5 上行型鼻咽癌與下行型鼻咽癌組腫瘤異質(zhì)性(Mutant Allele Tumor Heterogeneity，MATH)的比較

上行型鼻咽癌和下行型鼻咽癌組腫瘤異質(zhì)性分別為103.31(74.90～106.85)和104.89(89.56～108.21)，與上行型鼻咽癌組比較，下行型鼻咽癌組腫瘤異質(zhì)性呈現(xiàn)更高一些的趨勢，但上行型鼻咽癌組與下行型鼻咽癌組腫瘤異質(zhì)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.885)(圖4)。

圖4 G1與G2組腫瘤異質(zhì)性

3 討論

隨著精準醫(yī)療的提出和發(fā)展，基因突變的檢測對于腫瘤患者的治療及預(yù)后越來越有價值，傳統(tǒng)的基因測序技術(shù)已逐漸不能滿足臨床的需求，二代測序的出現(xiàn)及發(fā)展為腫瘤研究者們探測腫瘤的基因突變譜提供了幫助，使人們對腫瘤基因組學(xué)有了進一步的認識，為腫瘤的早期診斷、治療靶點的發(fā)現(xiàn)、療效的評估、治療的選擇、預(yù)后的判斷提供了新方向。二代測序能覆蓋更多的基因和更全面的位點，且靈敏度高，通量高，速度快，并可以發(fā)現(xiàn)未知突變，從而逐漸成為當(dāng)代臨床檢測與科研探索主流的技術(shù)方式，已獲得了FDA的認可[7]。目前，直接測序法(又稱基因序列分析法)被稱為基因突變檢測的“金標準”。

本研究發(fā)現(xiàn)在上行型鼻咽癌與下行型鼻咽癌中，基因突變率存在顯著差異；在下行型鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)的高頻突變基因是CEP170B，該基因也被稱為FAM68C、KIAA0284。盡管CEP170B蛋白的生物學(xué)功能尚不清楚，但它與CEP170相似，有相同的結(jié)構(gòu)域，提示其具有磷脂?；δ芎图毎藖喖毎ㄎ籟8]，因此，CEP170B基因可能與細胞骨架組織和信號傳導(dǎo)有關(guān)[9]，而細胞骨架與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。由于它們的序列相似，所以Welburn等[10]將CEP170B稱為CEP170相關(guān)(CEP170R)。CEP170是中心體的一部分，在微管組織中起作用，微管是高活力的結(jié)構(gòu)，在細胞生長、膜泡運輸和分裂中均具有重要作用[11-12]。中心體是哺乳動物細胞的微管組織中心，是細胞內(nèi)一個無膜包被的小體積細胞器，由兩個互為垂直的中心粒和中心粒外周基質(zhì)組成，是微管聚集地。中心體也是紡錘體裝配的場所，在有絲分裂過程中作為紡錘體的兩極從而形成紡錘體，且對細胞的正常分裂有著重要作用。中心體的異常會導(dǎo)致染色體的非整倍性，引起細胞的異常分裂，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，對中心體相關(guān)蛋白及中心體相關(guān)基因的研究將是我們探討癌癥發(fā)生發(fā)展機制的重要內(nèi)容，同時為尋找腫瘤的診斷和治療提供新的思路。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的動態(tài)的過程[13]，細胞骨架重組和改建參與了這一過程。已有研究證實，部分中心體相關(guān)蛋白家族的高表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報道中心體相關(guān)蛋白55(Centrosomal protein 55，CEP55)的過表達能夠增強細胞的遷移和侵襲能力[14]。許多研究表明CEP55在人咽喉癌[15]、乳腺癌[16]、頭頸部鱗癌[17]、膠質(zhì)瘤[18]、食管鱗癌[19]等實體腫瘤中存在過表達現(xiàn)象，CEP55的過表達與這些腫瘤的發(fā)生和不良預(yù)后均密切相關(guān)[16，20]。邱霓等[21]研究推測中心體相關(guān)蛋白70能夠促進乳腺癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。本文研究發(fā)現(xiàn)，CEP170B在下行型鼻咽癌中高突變，與CACNA1F基因一樣傾向于在G2組出現(xiàn)，其與MAPK信號通路有關(guān)，MAPK介導(dǎo)腫瘤細胞粘附和運動，而腫瘤細胞粘附能力異常是發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機制，從而推測CEP170B可能通過增強微管蛋白的重新組織，促進鼻咽癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。鑒于本研究樣本量較少，仍需要后續(xù)擴大樣本量以及更嚴格的細胞學(xué)實驗研究進行進一步的探討。腫瘤突變負荷能有效預(yù)測免疫治療的療效，G1組與G2組腫瘤突變負荷無顯著性差異，提示上行型鼻咽癌與下行型鼻咽癌的免疫治療療效差別不大。目前各腫瘤沒有統(tǒng)一的腫瘤突變負荷截止值，Hellmann等[22]人在納武單抗聯(lián)合伊匹單抗一線治療晚期非小細胞肺癌研究中將10 mut/Mb作為腫瘤突變負荷的截止值探索腫瘤突變負荷與免疫治療療效的相關(guān)性，腫瘤突變負荷小于10 mut/Mb時，免疫治療與化療療效無顯著差異。腫瘤突變負荷值越高，免疫治療療效越顯著[23]。腫瘤的異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一，能夠使腫瘤的生長速度、侵襲與轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、放射治療敏感性、預(yù)后等各方面產(chǎn)生差異[24]。本研究發(fā)現(xiàn)G1組與G2組腫瘤異質(zhì)性無明顯差異，但G2組異質(zhì)性呈現(xiàn)更高一些的趨勢，腫瘤異質(zhì)性的表現(xiàn)之一是腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。該結(jié)果提示上行型鼻咽癌和下行型鼻咽癌在治療和預(yù)后上會產(chǎn)生一定的差異。腫瘤異質(zhì)性使得腫瘤產(chǎn)生耐藥，進而不斷地推進腫瘤相關(guān)治療方法。

綜上所述，NGS技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用在腫瘤的診斷、預(yù)后危險因素分層、治療方式和靶向藥物的選擇等多方面展現(xiàn)出了廣泛的前景。通過NGS技術(shù)進行相關(guān)基因的檢測前景廣闊，可以為患者找到更多治療的機會，為疾病的研究和靶向新藥的研發(fā)提供新視野，為個體化治療提供新方案。本研究中檢測上行型和下行型鼻咽癌患者病理組織DNA，發(fā)現(xiàn)CEP170B在下行型鼻咽癌的表達明顯高于上行型鼻咽癌，而下行型鼻咽癌是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的類型。鑒于本研究樣本量較少，仍需要后續(xù)擴大樣本量進行進一步驗證和研究。該結(jié)果初步提示CEP170B基因在鼻咽癌中的高突變可能與其轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，值得進一步深入研究。