水蛭素聯(lián)合阿托伐他汀對急性心肌梗死大鼠血管內(nèi)皮功能的影響

成 穎, 楊 靜, 饒 莉, 薛 強(qiáng), 胡 杰, 付 樂, 張巧月

（1. 河北省唐山市工人醫(yī)院急診科，河北 唐山 063000；2. 河北省唐山市工人醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北唐山 063000；3. 河北省唐山市工人醫(yī)院藥學(xué)部，河北 唐山 063000）

在我國，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病率和死亡率逐年升高，是臨床上較為常見的心血管急癥之一。研究［1］表明：血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂參與AMI 的發(fā)展過程。凝血酶主要通過損傷內(nèi)皮細(xì)胞和釋放炎性細(xì)胞因子促進(jìn)血管栓塞斑塊形成［2-3］。研究［4］顯示：水蛭素是活性很強(qiáng)的特異性凝血酶抑制劑，能夠抑制凝血酶對內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)的激活作用。他汀類藥物是公認(rèn)為治療心肌梗死基礎(chǔ)藥物之一，目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于水蛭素和阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用于急性心肌梗死的報(bào)道。本研究通過觀察水蛭素聯(lián)合阿托伐他汀對AMI 大鼠心肌梗死面積、心肌組織病理和內(nèi)皮損傷相關(guān)指標(biāo)的影響，評價(jià)水蛭素聯(lián)合阿托伐他汀對急性心肌梗死的保護(hù)作用，為AMI 的臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SD 大鼠50 只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購于河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，動(dòng)物使用許可證號：SYXK （冀）2015-0064。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食和飲水。水蛭素購自南寧市金海科康生物醫(yī)藥科技有限公司，阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字H20051408），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC） 購自北京沃比森科技有限公司，鼠抗人血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1） 和細(xì)胞間黏 附分子1（intercellularcelladhesion molecule-1，ICAM-1）單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢Boster有限公司。CX21 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司），DG-3022 型酶標(biāo)儀（南京華東電子管廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立采用結(jié)扎左冠脈前降支的 方 法［5］建 立 大 鼠AMI 模 型。 給 予 大 鼠3 mL·kg－1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，碘伏消毒，剪開頸部皮膚，分離皮下組織及肌肉，斷第4 肋骨，打開胸腔，剪開心包，露出心臟，在左心耳下緣約2 mm 處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，20 min 后左心室前壁顏色變蒼白、收縮力減弱即認(rèn)為造模成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥50 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組。水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠分別灌胃給予水蛭素50 U·kg－1、阿托伐他汀10 mg·kg－1［6］及水蛭素50 U·kg－1+阿托伐他汀10 mg·kg－1，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥4 周。

1.4 TTC 染色法檢測大鼠心肌梗死面積取5 只大鼠處死后，迅速取下心臟，主動(dòng)脈逆向插管，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗心臟，經(jīng)主動(dòng)脈注入TTC，37 ℃孵育30 min，壞死心肌呈現(xiàn)白色，非壞死心肌呈紅色，置于－80 ℃冰箱保存10 min，切片（厚度為1.0 mm），采用10%甲醛溶液固定過夜。采用Image J 軟件計(jì)算左室心肌壞死面積和左室總面積，心肌梗死面積百分比=左室心肌壞死面積/左室總面積×100%。

1.5 HE 染色觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)取5 只大鼠處死后，迅速取下心臟，取心肌梗死區(qū)，切片，置于4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），行蘇木精-伊紅染色，封片后置于顯微鏡下觀察。

1.6 Western blotting 法檢測大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平取大鼠心肌梗死區(qū)，加入裂解液，勻漿，12 000 r·min－1離心15 min 后取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，封閉液孵育1 h，分別加入ICAM-1、VCAM-1 和GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，發(fā)光底物孵育3 min，顯影，采用Image J 軟件分析，目的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶吸光度（A）值與GAPDH蛋白條帶A 值比值表示。

1.7 ELISA 法檢測大鼠血清中ET-1、vWF、NO、TNF-α 和IL-6 水平大鼠處死前眼眶取血，于離心機(jī)1 500 r·min－1離心10 min，按照ELISA 試劑盒說明書檢測，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋5 個(gè)梯度，各個(gè)梯度均設(shè)置空白孔和樣品孔，在反應(yīng)孔內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品、抗體，孵育1 h，加入顯色劑，取出酶標(biāo)板加入硫酸終止液后，用酶標(biāo)儀測定結(jié)果并記錄A 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所檢測樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠心肌梗死面積，心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平，血清中ET-1、vWF 、NO、TNF-α 和IL-6 水平，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積假手術(shù)組大鼠未發(fā)生心肌梗死。與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠心肌梗死面積均明顯減?。≒＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯(lián)合組大鼠心肌梗死面積均明顯減?。≒＜0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞不完整，心肌壞死程度嚴(yán)重，有炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，心肌壞死程度明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤情況明顯減輕。見圖2。

表1 各組大鼠心肌梗死面積百分比Tab. 1 Percentages of myocardial infarction areas of rats in various groups

表1 各組大鼠心肌梗死面積百分比Tab. 1 Percentages of myocardial infarction areas of rats in various groups

*P＜0.05 compared with model group；△P＜0.05 compared with hirudin group；#P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination Percentage of myocardial infarction area 0 54.20±2.61 42.31±2.14*36.22±1.89*△23.96±1.76*△#

圖1 各組大鼠心肌組織TTC 染色結(jié)果Fig.1 Results of TTC staining of myocardium tissue of rats in various groups

2.3 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠血清中內(nèi)皮損傷指標(biāo)水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中ET-1 和vWF 水平明顯升高（P＜0.05），NO 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠血清中ET-1 和vWF 水平明顯降低（P＜0.05），NO 水平明顯升高（P＜0.05）；與水蛭素組和阿伐他汀組比較，聯(lián)合組大鼠血清ET-1 和vWF 水平明顯降低（P＜0.05），NO 水平明顯升高（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠血清中NO 水平明顯升高（P＜0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平明顯降低（P＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯(lián)合組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌功能，能調(diào)節(jié)血液流動(dòng)、血管緊張性、平滑肌細(xì)胞增殖和管壁炎癥修復(fù)等，血管內(nèi)皮功能損傷是AMI的主要發(fā)病因素之一［7-8］。血管內(nèi)皮功能障礙通過分泌ET-1、vWF 和NO 等血管活性物質(zhì)，影響成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌梗死的病情發(fā)展［9］。ET-1 是內(nèi)皮細(xì)胞釋放并具有收縮血管的活性物質(zhì)，可引起冠狀動(dòng)脈收縮痙攣，使血管阻力增加，進(jìn)一步加重內(nèi)皮功能的損傷［10］。vWF 是內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞分泌的一種多聚體糖蛋白，是反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，血清中vWF 具有促進(jìn)血小板黏附和聚集的作用，介導(dǎo)血小板釋放功能和纖溶過程，促進(jìn)血栓形成，是缺血性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［11］。NO 是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)大舒血管物質(zhì)，能保 護(hù) 血 管 內(nèi) 皮［12］。血 清 中ET-1、vWF 和NO 水 平可作為血管內(nèi)皮功能指標(biāo)［13］。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中ET-1 和vWF水平明顯升高，NO 水平明顯降低；給予水蛭素或阿托伐他汀干預(yù)后，大鼠血清ET-1 和vWF 水平明顯降低，NO 水平明顯升高，說明水蛭素和阿托伐他汀均對血管內(nèi)皮功能起保護(hù)作用，而且二者聯(lián)合使用療效明顯提高。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.2 Pathomorphology of myocardium tissue of rats in various groups（HE，×200）

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination VCAM-1 0.22±0.02 0.56±0.03*0.34±0.02△○0.43±0.03△#0.28±0.03△#○ICAM-1 0.26±0.02 0.82±0.04*0.38±0.03△○0.56±0.04△#0.25±0.02△#○

表3 各組大鼠血清中ET-1、vWF 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1, vWF and NO in serum of rats in various groups

表3 各組大鼠血清中ET-1、vWF 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1, vWF and NO in serum of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination ET-1 55.31±4.30 126.20±9.74*98.31±9.06△91.20±8.87△70.31±6.01△#○vWF 4.56±0.64 8.21±0.73*6.12±0.51△6.54±0.62△5.26±0.59△#○NO 61.26±5.34 23.51±1.99*39.42±2.56△○31.55±2.61△#54.80±5.03△#○

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination TNF-α 87.20±10.26 198.26±15.31*123.40±11.20△○147.29±10.54△#104.82±9.33△#○IL-6 61.23±8.65 120.44±10.16*84.20±8.84△○102.31±11.23△#70.51±9.30△#○

ICAM-1 和VCAM-1 是黏附分子家族中免疫球蛋白超家族成員。ICAM-1 主要參與各細(xì)胞間的黏附作用，其高表達(dá)能促進(jìn)血管生長［14］。VCAM-1能夠介導(dǎo)細(xì)胞間移動(dòng)，并與異位內(nèi)膜細(xì)胞存活、分裂和增殖有關(guān)聯(lián)［15-16］。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高，其共同參與心肌梗死炎癥反應(yīng)過程，同時(shí)可作為黏附分子ICAM-1 及VCAM-1 表 達(dá) 的 強(qiáng) 誘 導(dǎo) 劑。研 究［17-18］表明：IL-6 可調(diào)節(jié)C 反應(yīng)蛋白的合成，從而增加ICAM-1 的表達(dá)，促進(jìn)血小板的聚集，同時(shí)促進(jìn)TNF-α 分泌。TNF-α 可增強(qiáng)白 細(xì)胞趨化作用，直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞［19］。本研究結(jié)果顯示：給予水蛭素或阿托伐他汀干預(yù)后，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯(lián)合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達(dá)水平以及血清中TNF-α 和IL-6 水平均降低，說明水蛭素具有明顯抗炎作用，與文獻(xiàn)［20］報(bào)道一致，可通過抑制炎癥反應(yīng)起到減少細(xì)胞黏附的作用，與阿托伐他汀聯(lián)合應(yīng)用療效明顯提高。

綜上所述，水蛭素和阿托伐他汀能夠通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮活性物質(zhì)分泌、抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞黏附，起到保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用，水蛭素和阿托伐他汀聯(lián)合治療效果優(yōu)于單用水蛭素或阿托伐他汀。