丹參酮ⅡA 對宮腔黏連模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的改善作用及其機(jī)制

劉靜喬, 孟亞麗, 徐淑穩(wěn), 王云燦, 王 娜, 王玉靜

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050031；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，河北 石家莊 050031）

宮腔黏連（intrauterine adhesion，IUA） 是由于宮腔內(nèi)手術(shù)操作和細(xì)菌感染等原因?qū)е伦訉m腔、子宮峽部及子宮頸管損傷引起腔壁相互黏連。IUA患者常表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、周期性腹痛、不孕和自然流產(chǎn)，嚴(yán)重影響患者身心健康［1］。目前對IUA 的治療主要以宮腔鏡IUA 分離術(shù)為主，術(shù)后使用雌激素、宮內(nèi)置入宮內(nèi)節(jié)育器和干細(xì)胞治療，但復(fù)發(fā)率較高，且具有一定的局限性［2］。近年來，中藥以其安全性高和療效廣泛的特點受到學(xué)者關(guān)注，在治療IUA 方面具有明顯效果［3-4］。唇形科植物丹參具有活血調(diào)經(jīng)、排膿消腫的功效，臨床常應(yīng)用于血瘀經(jīng)閉和月經(jīng)不調(diào)等婦科疾?。?］。研究［6］表明：丹參具有明顯的類雌激素治療作用，具有輔助治療絕經(jīng)性疾病的用途。丹參酮ⅡA 是丹參提取物脂溶性菲醌化合物總丹參酮中的主要有效成分。目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于丹參酮ⅡA 對子宮內(nèi)膜容受性影響相關(guān)機(jī)制的研究。本研究通過建立實驗性大鼠IUA模型，通過觀察丹參酮ⅡA 對大鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)指標(biāo)整合素αVβ3 和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）表達(dá)水平的影響，探討其預(yù)防IUA 的效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性SD 大鼠50 只，15 周齡，體質(zhì)量（250±20） g，購自河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，動物使用許可證號：SYXK（冀） 2015-0064。室溫飼養(yǎng)，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，期間自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑和儀器丹參酮ⅡA（中國藥品生物制品檢定所），HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Masson 染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），鼠抗人整合素αVβ3 單克隆抗體（美國BD 公司），兔抗人LIF 多克隆抗體（美國Abbiotec 公司）。HY-1508 型石蠟切片機(jī)（上海華巖儀器設(shè)備有限公司），CX43 型生物顯微鏡（日本Olympus公司），9700型PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.3 實驗動物造模及分組50 只雌性SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、低劑量丹參酮ⅡA 組、中劑量丹參酮ⅡA 組和高劑量丹參酮ⅡA 組，每組10 只。除對照組外，其余各組大鼠根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法，在無菌條件下采用刮宮法建立大鼠IUA 模型：腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，解剖下腹部，暴露雙側(cè)子宮，于子宮分叉右上方行切口，行刮宮法，至子宮四壁感覺粗糙時，停止操作，縫合切口，給予青霉素消炎。造模7 d 后，低、中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠分別灌胃給予劑量為5、10和20 mg·kg－1的丹參酮ⅡA，對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。

1.4 HE 染色觀察大鼠子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)末次給藥后24 h 取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織，采用10%甲醛固定，無水乙醇脫水，石蠟包埋，行組織切片，厚度為4 μm，漂洗，行HE 染色，采用蘇木精染色5 min，置入含1% HCl 的無水乙醇中固定，采用伊紅染色4 min，清洗，置于高倍鏡（×200）下觀察，計數(shù)子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)，取平均值。

1.5 Masson 染色檢測大鼠子宮內(nèi)膜纖維化面積比每組隨機(jī)選取3 張大鼠子宮內(nèi)膜組織切片，行Masson 染色，在高倍鏡（×200）下隨機(jī)選取6 個視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0 計算子宮內(nèi)膜纖維化面積比，子宮內(nèi)膜纖維化面積比=子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化面積/視野總面積×100%，取平均值。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織切片，常規(guī)脫蠟至水，采用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，加稀釋一抗整合素αVβ3（1∶100） 和LIF（1∶100），4℃下過夜，加入二抗，于37℃孵育30 min，加入辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白，于37℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，陽性細(xì)胞呈棕黃色，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。置于高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取6 個視野，采用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0分別測定整合素αVβ3 和LIF 陽性染色區(qū)域的平均吸光度（A）值，以A 值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表達(dá)水平取各組大鼠子宮內(nèi)膜組織，按照總RNA 提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA 濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行實 時 熒 光 定 量PCR 擴(kuò) 增。 αV β3： 上 游 引 物5′-TCATGGACTCCTGTGCCCCGTGGCT-3′，下游 引 物 5′-CCTCCAGCTGCGGTGGACTGAGCCT-3′，345 bp； LIF： 上 游 引 物 5′-GGGATTGTGCCCCTACTGC-3′ ，下游引物5′-GCTGAGGAGGCCCCTCATGAC-3′，429 bp； β-actin：上游引物5′-ATGCCATCCTGCGTCTG-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′，542 bp。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、20 s，60 ℃、33 s，72 ℃、30 s，共35 個循環(huán)。整合素αVβ3 mRNA 和LIF mRNA 引 物 均 根 據(jù) 標(biāo) 準(zhǔn)RT-PCR 引物設(shè)計原則，由上海生工公司設(shè)計并合成。以β-actin 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA 相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)、纖維化面積比、整合素αVβ3 和LIF 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠宮腔結(jié)構(gòu)完整，腺體豐富，細(xì)胞排列整齊；與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體減少，細(xì)胞排列紊亂，纖維化增生；與模型組比較，低、中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠宮腔結(jié)構(gòu)明顯改善，子宮內(nèi)膜增厚，細(xì)胞排列較整齊，纖維細(xì)胞減少。與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與低劑量丹參酮ⅡA 組比較，中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見圖1 和表1。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.1 Pathomorphology of endometrium tissue of rats in various group(HE,×200)

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)Tab. 1 Number of endometrial glands of rats in various groups

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中腺體數(shù)Tab. 1 Number of endometrial glands of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose Number of endometrial glands 29.31±5.26 5.60±1.51*12.84±3.62△21.50±3.01△#23.41±3.45△#

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比明顯降低（P＜0.05）；與低劑量丹參酮ⅡA 組比較，中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比明顯降低（P＜0.05）；與中劑量丹參酮ⅡA 組比較，高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比明顯降低（P＜0.05）。見圖2 和表2。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Masson 染色結(jié)果（×200）Fig.2 Results of Masson staining of endometrium tissue of rats in various groups(×200)

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF蛋白表達(dá)水平整合素αVβ3 和LIF 主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜組織中腺上皮及腔上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量丹參酮ⅡA 組比較，中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與中劑量丹參酮ⅡA 組比較，高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見表3 和圖3。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比Tab. 2 Fibrosis area ratios of endometrium tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中纖維化面積比Tab. 2 Fibrosis area ratios of endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose Fibrosis area ratio 5.32±0.60 66.84±5.89*40.20±4.51△28.87±3.52△#19.74±3.17△#O

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA表達(dá)水平與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高（P＜0.05）；與低劑量丹參酮ⅡA 組比較，中和高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與中劑量丹參酮ⅡA 組比較，高劑量丹參酮ⅡA 組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見表4。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF proteins in endometrium tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF proteins in endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose αVβ3 protein 33.82±1.83 5.20±0.84*LIF protein 29.20±1.90 4.01±0.63*13.59±1.22△19.41±1.35△#23.01±1.84△#O 11.52±1.41△24.41±1.60△#28.99±1.63△#O

3 討 論

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）Fig.3 Results of immunohistochemical staining of endometrium tissue of rats in various group(×400)

IUA 的病因是由于宮腔操作或?qū)m腔感染引起子宮內(nèi)膜基底層受損和成纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致宮腔部分或全部黏連。目前對IUA 的研究常用刮宮法建立IUA 大鼠模型。張永裕等［8］采用刮宮加感染多重?fù)p傷法建立IUA 大鼠模型，結(jié)果顯示：IUA 模型大鼠子宮內(nèi)膜組織中LIF 和整合素αVβ3 水平均明顯降低，提示該方法建立IUA 模型能夠降低大鼠子宮內(nèi)膜容受性。本研究中HE 染色和Masson染色結(jié)果顯示：模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織壞死，腺體減少，細(xì)胞排列紊亂，組織纖維化增生，子宮內(nèi)膜組織纖維化面積比明顯增加，均符合子IUA 的特征［9-10］，IUA 破壞子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能完整性，從而損傷子宮內(nèi)膜容受性，降低妊娠率，增加流產(chǎn)風(fēng)險［11-12］。

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF mRNA in endometrium tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF mRNA表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of integrin αVβ3 and LIF mRNA in endometrium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with low dose of tanshinoneⅡA group；OP＜0.05 compared with medium dose of tanshinoneⅡA group.

Group Control Model Tanshinone ⅡA Low dose Medium dose High dose αVβ3 mRNA 0.813±0.023 0.145±0.019*LIF mRNA 0.794±0.031 0.136±0.015*0.566±0.018△0.617±0.020△#0.650±0.025△#O 0.490±0.021△0.542±0.024△#0.675±0.026△#O

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜接受胚胎著床的能力，與生育功能及正常妊娠有密切關(guān)聯(lián)［13］。整合素αVβ3 和LIF 是衡量子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)志物［14-15］。整合素αVβ3 是由αV 和β3 2 個亞基構(gòu)成的異源二聚體，分泌中期表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜組織從非黏附狀態(tài)向黏附狀態(tài)轉(zhuǎn)變，有利于胚胎著床；相反，整合素αVβ3 在子宮內(nèi)膜表達(dá)水平降低，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降［16］。LIF 是一種分泌型糖蛋白，在整個月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜腔上皮及腺上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，通過激活Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子 （Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions，JAK/STAT）途徑和RAS 蛋白-有絲分裂原活化蛋白激酶（RASmitogen-activated protein kinase，RAS-MAPK） 途徑等信號通路，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，影響組織細(xì)胞的功能活動［17-18］。整合素αVβ3是目前公認(rèn)最具代表性的反映子宮內(nèi)膜容受性的黏附分子，其表達(dá)水平升高可說明子宮內(nèi)膜容受性升高［19］。研究［20］表明： LIF 能夠上調(diào)整合素αVβ3和整合素αVβ5 的表達(dá)，從而提高子宮內(nèi)膜的容受性。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表達(dá)水平均明顯低于對照組，與有關(guān)研究［8，21］結(jié)果一致，說明子宮內(nèi)膜組織受損可引起整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表達(dá)水平變化，表明成功建立IUA 大鼠模型；給予丹參酮ⅡA 干預(yù)后，IUA 大鼠子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 及LIF 蛋白和mRNA 表達(dá)水平均明顯升高，表明丹參酮ⅡA 可改善子宮內(nèi)膜容受性，且呈劑量-效應(yīng)依賴性。

綜上所述，丹參酮ⅡA 可通過上調(diào)子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3 和LIF 的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。