3D 打印鈦合金種植體的制備及其骨結(jié)合性能

王 蕊, 李美華, 周萬琳

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院口腔科，吉林 長春 130041）

3D 打印技術(shù)亦稱增量制造技術(shù)，是指將產(chǎn)品的數(shù)字模型文件先進(jìn)行分層離散處理，然后通過激光照射等方式將金屬和樹脂等材料逐層疊加精確堆積構(gòu)建該產(chǎn)品的空間結(jié)構(gòu)［1-2］。選擇性激光燒結(jié)（selected laser sintering，SLS）是其中一種經(jīng)典方式［3-4］，是在數(shù)控環(huán)境中利用激光燒結(jié)粉末材料，逐層疊加最終累積成形。近年來，種植技術(shù)逐漸成為牙齒缺失首選的治療方式，但是種植牙也存在材料價(jià)格昂貴和技術(shù)復(fù)雜等缺點(diǎn)，隨著3D 打印技術(shù)應(yīng)用在口腔種植領(lǐng)域的發(fā)展，可以滿足種植牙的個(gè)性化要求，同時(shí)種植牙技術(shù)的發(fā)展越來越成熟，因而3D 打印種植體必將成為發(fā)展的趨勢。因優(yōu)良的機(jī)械、化學(xué)性能和生物相容性，鈦（Ti）及鈦合金材料被作為生物種植材料廣泛應(yīng)用［5］，其具有高強(qiáng)度-質(zhì)量比、優(yōu)越的耐腐蝕性、良好的生物相容性、耐久性、骨整合能力以及相對(duì)較低的彈性模量等優(yōu)點(diǎn)，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的材料，目前廣泛應(yīng)用于牙種植體的是Ti-6Al-4V（TC4）［6-7］。盡管國外有大量關(guān)于3D 打印種植體臨床應(yīng)用的研究［8-9］，但目前國內(nèi)對(duì)于3D 種植體打印的臨床應(yīng)用尚無相應(yīng)、統(tǒng)一的指導(dǎo)意見，仍需要更多諸如3D 打印種植體長期負(fù)載或遠(yuǎn)期生物學(xué)及機(jī)械并發(fā)癥相關(guān)的研究證據(jù)來支持3D 打印種植體的長期穩(wěn)定性［10］，從而推動(dòng)相關(guān)部門出臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)或形成相應(yīng)的指南，早日實(shí)現(xiàn)3D 打印種植體在國內(nèi)外的臨床推廣與應(yīng)用［11］。 本 研 究 通 過 對(duì) 比TC4 種 植 體 與 經(jīng) 典Straumann 種植體骨結(jié)合性能的差異，以期為3D 打印種植體的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器6 月齡家兔由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （吉） 2017-0003。飼養(yǎng)條件嚴(yán)格依照GB14925 進(jìn)行，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～3.5 kg。Ti-6Al-4V ELI-0406 鈦合金粉末（上海艾荔艾金屬材料有限公司），Micro-90 清洗劑（上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），Straumann?種植體（吉林省圣諾商貿(mào)有限公司），75%酒精消毒液和名碘皮膚黏膜消毒液（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司），生理鹽水（石家莊四藥有限公司），水合氯醛溶液和中性甲醛固定液（北京雷根生物技術(shù)有限公司），注射用五水頭孢唑林鈉（深圳華潤九新藥業(yè)有限公司），亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色液（上海源葉生物科技有限公司），甲苯胺藍(lán)染色液（北京華越洋生物科技有限公司）。EinScan-Pro+多功能手持式3D 掃描儀（杭州先臨三維科技股份有限公司），RENISHAW AM250 金屬增材制造系統(tǒng)（深圳智誠三維網(wǎng)絡(luò)有限公司），Solid Works 2012 建模軟件（美國Solid Works 公司），F(xiàn)EI Scios 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（賽默飛世爾科技有限公司），超聲波清洗機(jī)和海德曼風(fēng)冷滅菌器（吉林大學(xué)第二醫(yī)院），NSK Surgic XT Plus 標(biāo)準(zhǔn)種植機(jī)（上海麥森醫(yī)療科技有限公司），Straumann?手術(shù)工具盒（吉林省圣諾商貿(mào)有限公司），YX932D 負(fù)壓吸引器（上海五相儀器儀表有限公司），KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機(jī)、Leica RM224 半自切片機(jī)、OLYMPUS BX51 金相顯微鏡、OLYMPUS DP73 數(shù)碼顯微照相裝置和OLYMPUS cellSens 顯微圖像軟件（吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司），

1.2 TC4 種植體的制備采用本課題組前期實(shí)驗(yàn)方 法 制 備TC4 種 植 體［12］。將Straumann 組 織 水 平種植體（4.1 mm×10.0 mm） 置于白光LED 燈下，選擇固定式自由掃描模式，使用EinScan-Pro+多功能手持式3D 掃描儀對(duì)Straumann 種植體實(shí)現(xiàn)逆向掃描，將掃描結(jié)果輸出為STL 格式文件，建立原始數(shù)字模型。之后依照設(shè)計(jì)需要運(yùn)用Solid-Works 2012 建模軟件對(duì)原始數(shù)字模型進(jìn)行表面修飾、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和圖形片切等處理，獲得最終數(shù)字模型，保存為STL 格式文件備用。將儲(chǔ)存有最終數(shù)字模型信息的STL 格式文件導(dǎo)入RENISHAW AM250 金屬增材制造系統(tǒng)，讀取數(shù)據(jù)后，以Ti-6Al-4V ELI-0406 鈦合金粉末為底料進(jìn)行打印。打印參數(shù)設(shè)置為高純度氬氣、層厚50 μm 和激光強(qiáng)度200 W 進(jìn)行燒結(jié)，共打印30 個(gè)種植體試件（TC4 種植體）。成形的種植體清潔余留鈦粉，噴砂去除結(jié)構(gòu)缺陷，依次使用Micro-90 清洗劑、75%酒精及蒸餾水超聲波震蕩清洗10 min，最后高溫高壓消毒備用。

1.3 家兔雙側(cè)股骨區(qū)種植體模型建立“1.2”中制備的TC4 種植體為實(shí)驗(yàn)組（TC4 種植體組），Straumann 種植體為對(duì)照組（Straumann 種植體組），在6 只家兔雙側(cè)股骨區(qū)建立種植體模型，每側(cè)股骨均植入1 顆TC4 種植體和1 顆Straumann 種植體，共植入12 顆TC4 種植體和12 顆Straumann種植體，并設(shè)置觀察時(shí)間點(diǎn)為術(shù)后2、4 和8 周，預(yù)計(jì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死2 只家兔。

1.4 標(biāo)本的固定和脫鈣NaH2PO44 g、Na2HPO46.5 g 及37%甲醛100 mL，蒸餾水溶解后定容至1 L，配制為10%中性甲醛溶液。甲酸100 mL，蒸餾水混勻后定容至1 L，配制為10%甲酸溶液。分別取等量10%中性甲醛溶液與10%甲酸溶液均勻混合，配制為10%甲酸-中性緩沖甲醛脫鈣液，現(xiàn)配現(xiàn)用。于術(shù)后2、4 和8 周采用過量麻醉法分別處死家兔，暴露股骨上段，完全清理骨面附著的軟組織后，截取種植體周圍0.5 cm 范圍以內(nèi)硬組織制成標(biāo)本，立即置入10% 中性甲醛溶液，固定1 周。固定完成后，流動(dòng)水漂洗4 h，按照標(biāo)本與脫鈣液1∶30 的體積比，將骨塊置入10%甲酸-中性緩沖甲醛脫鈣液內(nèi)脫鈣，脫鈣液更換周期為48 h，直至針刺入硬組織時(shí)阻礙明顯減小，即標(biāo)志脫鈣完成。常規(guī)包埋切片，備用。

1.5 甲苯胺藍(lán)染色檢測2 組種植體骨結(jié)合界面新骨形成及骨組織修復(fù)情況切片脫蠟至水： 二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次脫蠟40 min；系列乙醇浸潤水化：無水乙醇2 次，每次10 min；95% 乙醇2 次，每次5 min；80%乙醇1 次5 min。蒸餾水水洗2 次。浸染于甲苯胺藍(lán)工作液中30 min；蒸餾水沖洗3 min；0.5%冰乙酸工作液分化，至細(xì)胞核和顆粒清晰可見；切片脫水、透明和封片：95%乙醇快速脫水；無水乙醇脫水2 次，每次5 min；二甲苯透明2 次，每次10 min；中性樹膠封固切片。鏡下觀察2 組種植體骨結(jié)合界面新骨形成及骨組織修復(fù)情況。

1.6 亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色檢測2 組種植體骨結(jié)合界面新生骨形成和礦化情況切片脫蠟至水（同甲苯胺藍(lán)染色）；60℃水浴環(huán)境下亞甲基藍(lán)工作液浸染15 min，濾紙吸盡余留工作液；60℃蒸餾水漂洗1 min，干燥；加入酸性品紅工作液浸染5 min，濾紙吸盡余留工作液；切片脫水、透明和封固（同甲苯胺藍(lán)染色）。鏡下觀察2 組種植體骨結(jié)合界面新生骨和礦化骨情況。

1.7 術(shù)后TC4 種植體穩(wěn)定性和生物相容性檢測術(shù)后TC4 種植體取出后，進(jìn)行干燥處理，采用離子濺射鍍膜機(jī)噴金后，利用SEM 對(duì)種植體表面微觀形貌進(jìn)行觀察，同時(shí)使用能量色散X 射線光譜儀（energy-dispersive x-ray spectroscopy，EDS）對(duì)TC4 種植體進(jìn)行元素構(gòu)成分析。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)2 組種植體骨結(jié)合界面新生骨形成及骨組織修復(fù)情況術(shù)后2 周，高倍鏡下可見2 組緊貼種植體的骨組織邊緣有胞核深染、胞漿呈淡藍(lán)色的成骨細(xì)胞線性排列，未觀察到明顯的新骨形成。術(shù)后4 周，2 組種植體骨組織邊緣均可觀察到淡染的新生膠原纖維樣結(jié)構(gòu)，排列欠整齊，與原礦化骨組織界限不清。術(shù)后8 周，2 組靠近種植體一側(cè)骨組織均有淡藍(lán)色的新生類骨質(zhì)形成，結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，內(nèi)含大量骨細(xì)胞，與原礦化骨界限清晰。見圖1。

2.2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)2 組種植體骨結(jié)合界面新生骨形成及礦化情況術(shù)后2 周，Straumann 種植體組種植體-骨組織界面可見因種植外科手術(shù)切割形成的骨缺損，2 組近種植體側(cè)的骨接觸面上可見胞核深染成藍(lán)色的成骨細(xì)胞。術(shù)后4 周，2 組種植體與原礦化骨組織間均可見新形成且紅染的類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。術(shù)后8 周，2 組種植體表面均可見深紅色的新生骨組織，伴有一定程度的鈣化形成，Straumann 種植體組鈣化程度略優(yōu)于TC4 種植體組，紅染的原礦化骨與深紅染的新生骨界限相對(duì)模糊。見圖2。

圖1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)2 組種植體骨結(jié)合界面骨組織甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果（×400）Fig.1 Results of toluidine blue staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

2.3 術(shù)后TC4 種植體的穩(wěn)定性和生物相容性術(shù)后8 周時(shí)，SEM 觀察顯示：完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的TC4種植體表面結(jié)構(gòu)基本與術(shù)前TC4 種植體保持一致［12］，低倍鏡視野下可見種植體表面無明顯結(jié)構(gòu)缺陷，散在分布有較大的孔隙結(jié)構(gòu)；高倍鏡視野下可見種植體表面存在致密的片層狀結(jié)構(gòu)及相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)（圖3A）。EDS 掃描結(jié)果和元素分布結(jié)果顯示：完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的TC4 種植體除含有與術(shù)前TC4 種植體［12］一致的Ti、鋁（Al）、礬（V）、鐵（Fe）、碳（C）和氧（O）等元素外，尚有常量元素鈣（Ca）、錳（Mg）和微量元素硅（Si）散在分布于種植體表面（圖3B 和圖4）。

3 討 論

目前普遍認(rèn)為，支架材料最有利于新生骨再生形成的孔隙大小范圍為200～1 000 μm［8-13］，傳統(tǒng)技術(shù)通常難以控制種植體表面形成的孔隙大小和與孔隙率，且傳統(tǒng)制造工藝成本高、效率低且性能差，已不能滿足日益增長的醫(yī)學(xué)種植體的需求。隨著3D 打印技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的技術(shù)手段能夠精確孔隙尺寸的形成，獲得梯度孔隙率的多孔表面。

圖2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)2 組種植體骨結(jié)合界面骨組織亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色結(jié)果（×400）Fig. 2 Results of methylene blue-acid fuchsin staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

圖3 術(shù)后8周TC4種植體表面SEM(A)和EDS掃描圖像（×10 000）Fig. 3 Pictures of SEM(A) and EDS scaning of TC4 implant surface at 8 weeks after operation (×10 000 )

圖4 術(shù)后8 周TC4 種植體的EDS 分析Fig. 4 EDS analysis of TC4 implants at 8 weeks after operation

YU 等［14］采用3D 打印技術(shù)，制備了具有起伏宏觀粗糙表面的Ti-6Al-4V 種植體，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在3D 打印種植體表面的黏附、增殖、成骨分化和血管生成因子表達(dá)水平均高于傳統(tǒng)加工方法獲得的種植體，體內(nèi)研究也顯示3D 打印種植體在早期表現(xiàn)出相對(duì)較好的骨整合性能，表明3D 打印鈦合金具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和血管生成潛能，有望作為骨植入材料，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一致性。

組織學(xué)特殊染色法主要包括甲苯胺藍(lán)染色法、亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色法和Masson 染色法等，合適的染色法可以顯示骨成熟狀態(tài)和骨組織各種分化狀態(tài)［15］。本研究結(jié)果顯示：術(shù)后2 周時(shí)，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色可觀察到緊貼種植體的骨創(chuàng)邊緣聚集有胞核深染、單層排列的成骨細(xì)胞，TC4 種植體組成骨細(xì)胞數(shù)量略少于Straumann 種植體組，雖然未見明顯的骨質(zhì)形成，但成骨細(xì)胞的募集展示了TC4 種植體和Straumann種植體周圍均存在活躍且一致的成骨趨勢，提示種植體周圍骨修復(fù)進(jìn)入所謂的骨傳導(dǎo)階段［16］，與BUSER 等［17］的研究結(jié)果相符合；術(shù)后4 周時(shí)，鏡下觀察到活躍的類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)形成是這一時(shí)期的共同特征，而甲苯胺藍(lán)染色亦可觀察到淡染的新生膠原纖維樣結(jié)構(gòu)，排列欠整齊，與原礦化骨組織邊界不清，可認(rèn)為種植體周圍骨修復(fù)已進(jìn)入新生骨形成階段［16］；術(shù)后8 周時(shí)，種植體周圍骨修復(fù)開始進(jìn)入緩慢的骨重建階段［16］，甲苯胺藍(lán)染色可在近種植體一側(cè)觀察到淡藍(lán)色且連續(xù)完整的新生骨組織，新生骨與原礦化骨邊界清晰，而亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色則可見2 組種植體表面均有深紅色的新生骨組織形成，但與紅色的原礦化骨組織界限模糊，新生骨組織內(nèi)伴有一定程度的鈣化形成，可見有部分位點(diǎn)形成板層骨，且Straumann 種植體組在鈣化程度上相對(duì)優(yōu)于TC4 種植體組。本研究結(jié)果顯示：TC4種植體植入家兔體內(nèi)8 周后，SEM 掃描可見其表面結(jié)構(gòu)與術(shù)前基本保持一致，高倍鏡下仍可見種植體表面存在致密的片層狀結(jié)構(gòu)及相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)，提示SLS 技術(shù)成形的TC4 種植體具備優(yōu)越的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，術(shù)后8 周時(shí)在TC4 種植體和周圍骨組織之間已顯示出非常好的骨整合。亦有學(xué)者［18-19］提出不同理論，認(rèn)為鈦合金尤其是TC4，具有嚴(yán)重的生物惰性和釋放Al 和V 等金屬離子，影響骨愈合過程，為克服這些問題，可以進(jìn)行表面改性等處理。

綜上所述，3D 打印技術(shù)制備的TC4 種植體具備優(yōu)越的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和良好的生物相容性，并能夠在體內(nèi)形成與經(jīng)典種植體一致且相近的種植體-骨結(jié)合能力，3D 打印技術(shù)是一種具有良好發(fā)展前景的新技術(shù)。