非編碼RNA在生防菌-植物線蟲-寄主互作中的研究進(jìn)展

陳立杰 楊帆 范海燕 趙迪 王媛媛 朱曉峰 劉曉宇 段玉璽

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 設(shè)施園藝教育部重點實驗室（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)），沈陽 110866；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心， 沈陽 110866；3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，沈陽 110866；4. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，沈陽 110866）

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括rRNA，tRNA，snRNA和microRNA 等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的circRNA和lncRNA等。這些RNA的共同特點是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物學(xué)功能。其中microRNA（miRNA）、circRNA和lncRNA是目前生物學(xué)領(lǐng)域主要的研究熱點。

植物線蟲可危害多種蔬菜作物，是世界上最難防治的土傳病原物，線蟲通過其分泌物誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)寄主植物的細(xì)胞發(fā)育為自己建立專門的巨細(xì)胞，從而為其不斷地供應(yīng)營養(yǎng)，建立穩(wěn)定的互作關(guān)系。生防菌指那些可以防治植物病害的各種微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等。生防菌可有效控制線蟲危害，并激發(fā)植物對線蟲的免疫機制，一直是研究的熱點。而生防假單胞菌（Pseudomonas）是防治作物根結(jié)線蟲病的重要生防菌，如熒光假單胞菌（P. fluorescens）［1-2］和惡臭假單胞（P. putidaSneb821），具有毒殺線蟲、誘導(dǎo)番茄抗性和促生長等多方面作 用［3］。Yang等［4］研 究 發(fā) 現(xiàn)ncRNAs中miRNA、lncRNA和circRNA等響應(yīng)惡臭假單胞Sneb821激發(fā)番茄免疫抗南方根結(jié)線蟲的侵染，預(yù)測到lncRNA44664關(guān) 聯(lián) 到miR396/GRFs，lncRNA48734關(guān)聯(lián)到miR156/SPL，這些發(fā)現(xiàn)為生防細(xì)菌誘導(dǎo)番茄抗根結(jié)線蟲侵染的機理提供了新的分子調(diào)控模型。為探究ncRNAs在植物與線蟲互作過程中的作用以及植物、病原物和生防菌三者之間的關(guān)系，本文闡述了植物線蟲、生防假單胞菌與寄主互作中ncRNA的研究進(jìn)展，剖析植物線蟲病害研究中ncRNAs發(fā)揮何種作用，旨為植物線蟲學(xué)理論研究新領(lǐng)域添磚加瓦。

1 miRNA 響應(yīng)植物線蟲脅迫和假單胞菌誘抗的研究進(jìn)展

1.1 miRNA響應(yīng)植物線蟲脅迫的研究進(jìn)展

ncRNAs中只有miRNA在植物線蟲領(lǐng)域研究較多，也是最早被鑒定到參與免疫反應(yīng)的小RNA分子。miRNA的主要功能是通過引起靶基因mRNA的降解或者阻止靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而抑制靶基因 功能［5］。

植物寄生線蟲如胞囊線蟲和根結(jié)線蟲會在寄主根系形成特殊的取食細(xì)胞如合胞體和巨細(xì)胞，是寄主細(xì)胞的基因被額外誘導(dǎo)表達(dá)形成的新型取食細(xì)胞，其中miRNA發(fā)揮了作用［6］。miR396在擬南芥和大豆中靶向生長調(diào)控因子GRF，在植物線蟲侵染寄主形成取食細(xì)胞時通過調(diào)節(jié)GRF1、GRF3［7］和GRF6、GRF9［8］等基因表達(dá)而影響取食細(xì)胞的發(fā)育，證實miR396/GRF分子模型調(diào)控取食細(xì)胞形成的作用具有保守性。Cabrera 等［9］證明miR390a和TAS3在根結(jié)和巨細(xì)胞中可共表達(dá)，根結(jié)形成過程需要 miR390/TAS3/ARF3 分子模型調(diào)控。Zhao 等［10］發(fā)現(xiàn)番茄的 miR319/TCP4 和miR396/GRF 潛在的交互作用可能介導(dǎo)了對根結(jié)線蟲的抗性。Díaz-Manzano等［11］研究發(fā)現(xiàn)miRNA172/TOE1/FT基因調(diào)控模型在爪哇根結(jié)線蟲侵染擬南芥的巨細(xì)胞形成和發(fā)育過程中通過修飾生長素而起到重要作用。

擬南芥接種胞囊線蟲后，miRNA及其靶基因呈負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系，其中miR156、miR159、miR172和miR396 表達(dá)量下調(diào)［6］。miR159不但自身可以受到生長素誘導(dǎo)，它還可以調(diào)控 MYB33和 MYB65的表達(dá)［12］，并參與調(diào)控抑制了寄主根結(jié)中靶基因MYB33的表達(dá)從而限制南方根結(jié)線蟲的早期侵染［13］。Pan等［14］分析miR159-MYB，miR319-TCP4 和 miR167-ARF8 三對基因調(diào)控模型的逆表達(dá)方式可能響應(yīng)了南方根結(jié)線蟲侵染棉花根系的脅迫反應(yīng)。

1.2 miRNA響應(yīng)假單胞菌誘抗的研究進(jìn)展

擬南芥 miR393 是第一個在植物免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用的 ncRNA，被丁香假單胞菌鞭毛蛋白 flg22 誘導(dǎo)激發(fā)，miR393、miR160 和 miR167 通過抑制生長素信號途徑而影響細(xì)菌的侵染［15］。Flg22 是被用于 PTI（PAMP-triggered immunity，PAMP 觸發(fā)免疫）體系中重要的元素可誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積，但是人們對 PTI 在根系上的作用，尤其是在植物與線蟲互作中作用知之甚少。Lee 等［16］證明了來源于丁香假單胞菌的 RNA 激發(fā)了擬南芥的先天免疫反應(yīng)。細(xì)菌侵染擬南芥后 miR398a 和 miR773 表達(dá)量降低，調(diào)控靶基因 SOD 上調(diào)表達(dá)來抵抗細(xì)菌侵染。miR858-MYB83調(diào)控系統(tǒng)被證明具有平衡甜菜胞囊線蟲對擬南芥致病性的優(yōu)異分子功能［17］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)lncRNA48734-miR156-SPL和lncRNA44664-miR396-GRF也參與了生防假單胞菌Sneb821調(diào)控的番茄抗南方根結(jié)線蟲侵染的生物學(xué)過程［4］。

?wi?cicka等［18］研究證實miRNA與NBS-LRR和激酶接受子家族RLKs成負(fù)相關(guān)性，顯示miRNA介導(dǎo)的R基因抑制可能是馬鈴薯金線蟲致病番茄的關(guān)鍵調(diào)控因子。NBS-LRR（nucleotide binding siteleucine rich repeat，甘氨酸結(jié)合位點和亮氨酸富集重復(fù)）結(jié)構(gòu)是迄今從植物中克隆到的最大一類抗病基因，NBS-LRR介導(dǎo)了植物對專性和半專性寄生病原物的抗性［19］。番茄基因組中NBS-LRR基因家族中CNL（CC-NBS-LRR）亞家族成員擴展程度大于TNL（TIR-NBS-LRR）亞家族，已克隆的番茄抗爪哇根結(jié)線蟲Mi-1、Mi-9和抗馬鈴薯白線蟲Gpa2基因都屬于CNL亞家族，而番茄中抗馬鈴薯金線蟲Hero抗病基因和小麥中抗燕麥胞囊線蟲的抗病基因Cre3和Cre1屬于NL（NBS-LRR）亞家族［20-21］。陸秀紅等［22］初步從番茄中獲得2條具有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域的序列，F(xiàn)5-8與Mi-1相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似，F(xiàn)5-20與Hero基因相似。番茄通過lncRNA23468-miR482b-NBS-LRR調(diào)控模式抵抗致病疫霉的侵染［23］。生防芽胞桿菌AR156誘導(dǎo)了擬南芥抗PstDC3000的侵染，是miR825和miR472受到抑制從而增強NBSLRR基因家族CNLs介導(dǎo)基礎(chǔ)免疫而實現(xiàn)的［24-25］。有人提出了NBS-LRRs和miRNAs的共進(jìn)化模型假設(shè)，是植物平衡NBS-LRR 抗病基因的收益與成本的結(jié)果［26］。

2 lncRNA和circRNA 對植物病原物脅迫的響應(yīng)

2.1 lncRNA對植物病原物脅迫的響應(yīng)

lncRNA是一類長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA。Zhang等［27］研究了棉花響應(yīng)病原真菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的lncRNA表達(dá)譜，功能分析顯示兩個core lncRNAGhlncNAT-ANX2與GhlncNAT-RLP7沉默的幼苗對病原真菌的抗性增強，可能與LOX1和LOX2的表達(dá)增加有關(guān)。我們前期的研究表明，lncRNA48734和lncRNA44664可能參與到番茄的免疫激活過程當(dāng)中［4］。Qin等［28］鑒定到一個lncRNA（DRIR）在干旱和鹽脅迫下起到正調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)DRIR基因的擬南芥突變體具有抗旱耐鹽的能力。lncRNA-At5NC056820 過表達(dá)轉(zhuǎn)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株能夠在一定程度上提高擬南芥的耐旱性［29］。番茄的lncRNA23468-miR482b-NBSLRR調(diào) 控 模 式［23］和WRKY1-lncRNA33732-RBOH模型調(diào)控H2O2積累［30］，也是通過ncRNAs調(diào)控番茄生物學(xué)過程從而達(dá)到抗病的作用。

2.2 circRNA對植物病原物脅迫的響應(yīng)

circRNA（環(huán)狀RNA）是一類由前體mRNA選擇性剪切產(chǎn)生，3'和5'末端共價結(jié)合形成環(huán)狀單鏈閉合的ncRNA，最早于20世紀(jì)70年代在馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病樣中被首次發(fā)現(xiàn)［31］，但由于大多低豐度表達(dá)、閉環(huán)結(jié)構(gòu)等特點而不被認(rèn)識。2013年Memczak等［32］利用高通量測序技術(shù)分別在人、小鼠和線蟲中確定了成百上千個circRNAs的存在，而后研究者在各類生物中陸續(xù)挖掘到circRNA并鑒定其功能，使其成為RNA研究領(lǐng)域的又一個新征程［32-34］。circRNA 作為 miRNA 的“海綿”及競爭性內(nèi)源 RNA 結(jié)合胞內(nèi) miRNA，阻斷miRNA 對其靶點 mRNA 的抑制作用，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［35］；或與調(diào)控元件結(jié)合、或與蛋白互作調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［36］；也可影響親本基因的選擇性剪切和表達(dá)水平［37］；并參與多種生物學(xué)過程，在植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮特殊作用［33，38-40］。

自 2014 年在模式植物擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)植物 circRNA 以來，在水稻和番茄等十余種植物上有所研究，近3年人們開始關(guān)注生物脅迫下 circRNA 作用。如研究發(fā)現(xiàn) circR5g05160 激發(fā)了水稻免疫抗稻瘟病菌侵染［41］。有 3個 circRNA 基因與甜瓜蔓枯病抗性相關(guān)［42］。馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)了circRNA可能通過作為 miRNA “海綿”來調(diào)節(jié)對馬鈴薯軟腐病菌的免疫應(yīng)答［43］。lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在西瓜響應(yīng) CGMMV（黃瓜綠斑駁病毒）侵染中發(fā)揮重要作用［44］。

3 總結(jié)與展望

植物受病原物脅迫時，lncRNA和circRNA多通過 miRNA 調(diào)控 mRNA 起作用，但目前所鑒定的 circRNA 數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而且生物學(xué)功能未知太多，因此需要大量研究深入挖掘和證明 circRNA 的生物學(xué)功能與作用。

人們利用擬南芥突變體驗證了干擾miRNA和siRNA途徑會增加寄主對根結(jié)線蟲和胞囊線蟲的抗性［13，45-46］。Huang等［47］在擬南芥中表達(dá)了南方根結(jié)線蟲（M.incognita）16D10基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的根結(jié)線蟲數(shù)量下降了63%-93%。Steeve等［48］利用大豆胞囊線蟲中的RNAi機制，以編碼線蟲中特異蛋白MSP的基因為靶基因，在轉(zhuǎn)基因大豆中表達(dá)相應(yīng)的siRNA（small interfering RNA）使轉(zhuǎn)基因大豆根中胞囊線蟲數(shù)量減少了68%，此外，殘存線蟲后代的繁殖能力也大大減弱。

RNAi作為一種新工具用于植物線蟲病害的防控正在被研究，但是距離真正應(yīng)用還有一段距離。miRNA 是根際中植物與微生物互作和微生物群落形成的關(guān)鍵媒介，通過共進(jìn)化，植物與相關(guān)微生物構(gòu)成的共生有機體建立了跨界雙向通信通道［49］。干擾 miRNA 合成或分解途徑會增加寄主對線蟲的抗性［13］。對于根結(jié)線蟲這種高等的植物專性寄生物，RNAi 干擾可能會起到類似農(nóng)藥的防治作用，而來源于生防菌調(diào)控的寄主 RNA 或有益微生物本身的 RNA，將來是否能夠作為防控植物線蟲病害的因子？2021年2月，中國科學(xué)院微生物研究所郭惠珊課題組提出利用有益微生物表達(dá)小 RNA，靶向病原菌關(guān)鍵致病基因的植物保護(hù)新方法［50］，也為線蟲生防菌的利用拓展了新思路。此外，Panstruga［51］認(rèn)為細(xì)菌的RNA也可以作為一種新型的MAMP激發(fā)植物免疫反應(yīng)。也有研究表明，蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156 可以通過激活MAPK 通路誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，并且一些miRNA在其中起到一定作用［52］。因此，深入研究和理解ncRNAs 在植物線蟲與寄主互作中的調(diào)控作用將為利用ncRNAs防控線蟲病害提供新思路。

ncRNAs的研究剛剛興起，目前的研究結(jié)果多顯示其參與了各種脅迫條件下植物的免疫響應(yīng)，尤其是在線蟲的生物脅迫和假單胞菌的免疫激活方面研究逐漸增多。因此，假單胞菌作為生防菌激發(fā)植物對根結(jié)線蟲的RNA免疫調(diào)控機制研究將會為復(fù)雜精致的免疫調(diào)控分子機理提供新線索。