辣椒miR169及其靶基因的生物信息學(xué)分析

劉雪梅，王悅，李瑋琦，魏繼承，任如意，郝愛平

摘要：為了解miR169基因家族在辣椒生長發(fā)育過程的重要調(diào)控作用，通過生物信息學(xué)的方法對can-miR169基因家族的成員進行了染色體定位、序列保守性分析、系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析、前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和靶基因預(yù)測。結(jié)果表明：can-miR169家族成員定位在4條染色體上;成熟序列高度保守，前體序列在產(chǎn)生成熟序列的位置高度保守;預(yù)測結(jié)果顯示can-miR169家族成員均有靶基因，這些靶基因主要以靶基因核因子A（NF-YA）復(fù)合物為主，且大體相同。這些靶基因可以參與到種子萌發(fā)、植株發(fā)育和對外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答等多種生命活動中。

關(guān)鍵詞：miR169;辣椒;生物信息學(xué);NF-YA

中圖分類號：S641.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1510-06

Bioinformatics analysis of miR169 and its target genes in pepper

LIU Xue-mei，WANG Yue，LI Wei-qi，WEI Ji-cheng，REN Ru-yi，HAO Ai-ping

（ College of Life Sciences and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157011， China）

Abstract： In order to understand the important regulatory role of miR169 gene family in the growth and development of pepper， the members of can-miR169 gene family were analyzed by bioinformatics， including chromosome mapping， sequence conservation analysis， phylogenetic tree analysis， precursor sequence secondary structure prediction and target gene prediction. The results showed that the members of can-miR169 family were located on four chromosomes， the mature sequence was highly conserved. The precursor sequence was highly conserved in the position where the mature sequence was produced. The forecasting results indicated that all members of can-miR169 family had target genes， which were mainly composed of nuclear factor Y （NF-YA） complexes and were roughly the same. These target genes can be involved in a variety of life activities such as seed germination， plant development and response to external environmental stress.

Key words：miR169;pepper;bioinformatics;NF-YA

MicroRNA（miRNA）是真核生物體中內(nèi)生的，長度大致為20～24個核苷酸[1]，具有一定的保守性、時序性和結(jié)構(gòu)特異性的非編碼小分子RNA。miRNA調(diào)控植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和對外界環(huán)境非生物脅迫的響應(yīng)等生命活動[2]。一個miRNA可能具有一個或多個靶基因，且miRNA一般都是通過對靶基因的切割和翻譯抑制[3]對靶基因進行調(diào)控。

從目前的研究結(jié)果來看，miRNA家族龐大且調(diào)控方式復(fù)雜，其中，miR169是植物miRNA中幾個最大的miRNA家族之一，僅水稻miR169家族就登記了十幾個家族成員，且成員間具有大體相同的成熟序列和靶基因。近年，越來越多的科研人員研究了miR169對植物的逆境調(diào)控作用。Li等[4]發(fā)現(xiàn)miR169可在水稻抗稻瘟病中起負調(diào)節(jié)作用。陳禹彤等[5]發(fā)現(xiàn)miR169o可以參與干旱脅迫的應(yīng)答。舒李露等[6]發(fā)現(xiàn)當miR169過表達時能夠促進山核桃植株提前開花。阮先樂等[7]發(fā)現(xiàn)油菜miR169可以參與到非生物脅迫的應(yīng)答中。而董云等[8]進一步研究發(fā)現(xiàn)油菜miR169d也可以通過對靶基因的調(diào)控實現(xiàn)早花。方輝等[9]發(fā)現(xiàn)葡萄miR169是重要的生長發(fā)育和逆境脅迫的調(diào)控元件。Sorin等[10]發(fā)現(xiàn)擬南芥miR169通過調(diào)節(jié)靶基因核因子A（NF-YA）來直接或間接地參與到植物對環(huán)境信號的應(yīng)答中。Serivichyaswat等[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥miR169可以對外界溫度的影響進行負調(diào)控。Hanemian等[12]發(fā)現(xiàn)在擬南芥抗青枯病突變體中miR169表現(xiàn)為負調(diào)控，miR169的過表達則使突變株失去抗性。Yu等 [13]發(fā)現(xiàn)在大豆中g(shù)ma-miR169c通過抑制其靶基因NF-YA復(fù)合物的表達來對大豆干旱脅迫的應(yīng)答起負調(diào)控作用，是一種應(yīng)對干旱脅迫的候選miRNA。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)在番茄中sly-miR169c的過表達增強了番茄的耐旱性。

在以往的研究中，NF-YA轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中的作用也被一點點地挖掘出來。Marcoantonio等[15]研究發(fā)現(xiàn)NF-YA過表達可以延緩某種因脅迫造成的植物衰老。NF-YA可以抑制一些包括早期ABA介導(dǎo)的基因表達，還可以通過降低植物的生長速率來實現(xiàn)對非生物脅迫的調(diào)控，而且一般含有NF-YA復(fù)合物的植物對外界環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)的植物衰老具有一定的耐受性。Ni等[16]發(fā)現(xiàn)在大豆中NF-YA與抗旱息息相關(guān)，NF-YA可以通過增強大豆對高鹽度和外源ABA的敏感性來發(fā)揮自己在正調(diào)控植物抗旱性的重要作用。

辣椒在中國是一種十分重要的蔬菜作物，能夠帶來很大的經(jīng)濟效益，但是產(chǎn)量易受環(huán)境因素的影響[17-19]。環(huán)境脅迫已成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要限制因子，發(fā)掘利用植物自身的抗逆境能力， 選育優(yōu)良品種已成為重要課題[20]。辣椒miR169（can-miR169）家族之中成員較多且在辣椒的生長過程中可能具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，但具體的作用機理以及調(diào)控機制尚未知道。本研究將利用Phytozome等數(shù)據(jù)庫以及多種在線軟件對can-miR169基因家族的序列分布、染色體定位特征、二級結(jié)構(gòu)、發(fā)育進化樹以及靶基因的調(diào)控機理進行一定的生物信息學(xué)分析，以期明確can-miR169在辣椒生長過程中的調(diào)控作用，為辣椒抗逆性研究以及優(yōu)秀品種選育等提供參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

在miRNA數(shù)據(jù)庫PmiREN（http：//www.pmiren.com/）中直接搜索can-miR169數(shù)據(jù)，并通過下載的方式獲得can-miR169家族的全部15名成員的成熟序列。

1.2染色體定位

將can-miR169家族全部成員的前體序列以FASTA格式提交至數(shù)據(jù)庫PEPPER GENOME（http：//peppergenome.snu.ac.kr/）中通過在線比對的方式獲得染色體定位信息，其中參數(shù)設(shè)置均為默認值。

1.3前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將can-miR169的前體序列以FASTA格式提交至RNAfoldWebServer（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）中，預(yù)測can-miR169基因家族的全部成員的前體二級結(jié)構(gòu)，其中參數(shù)均為默認。

1.4序列比對分析與系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

利用Multiple Sequence Alignment（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）和ESPript3.X（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）對can-miR169的成熟序列進行多序列比對，結(jié)果利用WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制序列保守性圖片。Logo圖可以顯示出序列中每個位置上堿基出現(xiàn)的頻率以及序列保守程度。其中參數(shù)均為默認值。利用MEGA X通過鄰近法（Neighbor-Joining method）繪制can-miR169基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，其中Bootstrap設(shè)置為1 000次，其余參數(shù)均為默認值。

1.5靶基因預(yù)測

利用PmiREN（http：//www.pmiren.com/）和WMD3（http：//wmd3.weigelworld.org/cgi）的在線預(yù)測獲得can-miR169家族成員的靶基因預(yù)測信息，結(jié)果再通過利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Nucleotide數(shù)據(jù)庫以及BLAST的在線比對進行靶基因的功能注釋。

2結(jié)果與分析

2.1can-miR169家族成熟序列分析及其基因定位結(jié)果

利用PmiREN數(shù)據(jù)庫搜索到15個can-miR169基因家族成員（表1），結(jié)果顯示除can-miR169c和can-miR169g的長度為22個堿基外其余13個成員的長度均為21個堿基。利用數(shù)據(jù)庫PEPPER GENOME對全部15個成員進行定位，結(jié)果顯示15個基因序列分布在4條染色體上，分別為染色體2、染色體4、染色體7、染色體8。其中有8個成員位于染色體7上，分別為can-miR169a、can-miR169b、 can-miR169e、 can-miR169f 、can-miR169g、 can-miR169j、can-miR169k、 can-miR169l，有5個成員位于染色體8上，分別為can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n、can-miR169o，其余2個成員中can-miR169c位于染色體2上，can-miR169i位于染色體4上。

2.2can-miR169家族成員成熟序列的保守性分析

利用Multiple Sequence Alignment和ESPript 3.X對can-miR169家族成員成熟序列及前體序列進行保守性分析（圖1），并利用WebLogo對結(jié)果繪制了更為直觀的序列保守性對比圖（圖2）。由圖1和圖2可以看出can-miR169家族成熟序列中18個堿基完全保守，另有2個堿基高度保守，其余堿基保守性較低甚至不保守，而且can-miR169a、can-miR169b、can-miR169i、can-miR169j、can-miR169k、can-miR169l、can-miRm、can-miR169n、can-miR169o和can-miRd、can-miRe、can-miRf成熟序列堿基完全相同。前體序列高度保守區(qū)域幾乎與成熟序列完全重合，而前體序列其余位置保守性差應(yīng)可能是其處于不同發(fā)育階段不同的植物組織中造成的。

2.3can-miR169基因家族前體序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件RNAfoldWebServer對can-miR169基因家族前體序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。結(jié)果顯示can-miR169基因家族成員均能形成穩(wěn)定的莖環(huán)架構(gòu)。在這些家族成員中，其結(jié)構(gòu)特點與Luan等[21]研究結(jié)果相同，can-miR169二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)高度可變，高度保守結(jié)構(gòu)均位于莖區(qū)，其他區(qū)域在大小和莖環(huán)結(jié)構(gòu)差異很大。挑選出幾個較為典型的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖（can-miR169a、can-miR169g、can-miR169k、can-miR169n二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖）作為展示（圖3）。

2.4can-miR169家族前體序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

利用MEGA X對can-miR169基因家族的前體序列進行比對分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示，前體序列進化樹（圖4）顯示，can-miR169 15個成員除can-miR169o、can-miR169c外，共分為3個分支：can-miR169d、can-miR169h、can-miR169m、can-miR169n（分支Ⅰ），can-miR169a、can-miR169b、can-miR169l、can-miR169i（第Ⅱ分支），can-miR169e、can-miR169g、can-miR169f、can-miR169j、can-miR169k（分支Ⅲ）。從進化樹上看，can-miar169o、can-miR169c應(yīng)比其他成員產(chǎn)生早，兩者序列差異也較其他序列大。與此同時參考了miRNA數(shù)據(jù)庫PmiREN中成熟序列表達位置和RPM值信息，大部分can-miR169成員的主要表達位置為植物的根和莖，只有can-miR169c在植物根、莖、葉、花、果實中極少量表達。結(jié)合進化樹，可解釋can-miR19c成熟序列與其他成熟序列差異最大。因此推測can-miR169基因在其進化過程中發(fā)生了較多堿基突變、替換等現(xiàn)象，或者其進化過程更為復(fù)雜，這與蔣夢琦等[22]關(guān)于miR156家族的序列分析結(jié)果類似，即不同成員由于不同時間不同速度進化或所處于植物體不同的組織中從而導(dǎo)致前體序列差異較大，同時也證明了其在進化過程中功能區(qū)的保守性。

2.5can-miR169家族靶基因預(yù)測

利用數(shù)據(jù)庫PmiREN和在線軟件WMD3的初步預(yù)測以及NCBI的BLAST在線比對，獲得了一個較為準確的can-miR169靶基因預(yù)測結(jié)果（表2）。結(jié)果顯示，除can-miR169g外，其余成員均具有多個靶基因且大多數(shù)都為NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因，說明NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因是can-miR169家族的重要靶基因。這些靶基因編碼產(chǎn)物中包含了多種轉(zhuǎn)錄因子和多種蛋白質(zhì)，說明miR169參與調(diào)控了辣椒的多種生命活動，參與了辣椒的多種代謝活動。這為以后can-miR169-NF-YA非生物脅迫代謝途徑研究提供了理論基礎(chǔ)。

3討論

到目前為止，科研工作者已經(jīng)從35種植物中發(fā)現(xiàn)了超400個miR169基因家族成員[23-24]。本研究利用生物信息學(xué)方法對can-miR169基因家族的成熟序列和前體序列進行了保守性分析、系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和靶基因預(yù)測，至此我們對can-miR169基因家族有了初步的了解。本研究結(jié)果顯示，can-miR169基因家族共有15個家族成員，且這15個家族成員在成熟序列中保守性較高，在前體序列中位于成熟序列產(chǎn)生位置的堿基保守性較高。通過對can-miR169基因家族前體序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析可以看出，前體序列在進化過程中因處于不同植物組織在不同時間以不同的速率發(fā)生堿基突變和缺失從而產(chǎn)生了除莖區(qū)外幾乎不具保守區(qū)的特點。

通過對靶基因的預(yù)測不難看出can-miR169家族成員除can-miR169g外都具有多個靶基因并且這些靶基因大體相同。這不僅表明在辣椒中miR169家族參與了多種生命活動的調(diào)控，也表明了在辣椒中miR169家族具有大體相同的調(diào)控作用。在can-miR169家族眾多的靶基因中，大多數(shù)為NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因，這說明NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因是can-miR169家族的主要靶基因。徐妙云等 [25]發(fā)現(xiàn)在玉米中NF-YA能提高玉米對外界脅迫的耐受性。NF-YA通過調(diào)控根系來作為對外界干旱、高鹽等非生物脅迫的應(yīng)答，提高玉米對外界環(huán)境脅迫的耐受性。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)在水稻中NF-Y復(fù)合物可以起到一定的抗旱作用，在對水稻miR169家族成員進行高鹽誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)大量NF-Y亞基在干旱條件下受到抑制，說明調(diào)控NF-Y復(fù)合物的某些基因表達被關(guān)閉，進而說明NF-Y復(fù)合物在植物抗旱中發(fā)揮重要作用。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)NF-YA5同樣在植物抗旱方面可以起到作用，NF-YA5可以通過在植物保衛(wèi)細胞中的表達或者對氣孔大小的調(diào)控來實現(xiàn)對植物抗旱性的調(diào)控，另外這也證明NF-YA復(fù)合物在植物抗旱性方面的調(diào)控作用是必不可少的。辣椒每年受干旱影響造成產(chǎn)量減少的情況頻發(fā)，通過對can-miR169基因家族的生物信息學(xué)分析，可以為辣椒抗旱優(yōu)良品種的選育與性狀改良提供思路和理論基礎(chǔ)。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-04-20

基金項目：牡丹江師范學(xué)院科研項目（YB2020005）;黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費科研項目（1353MSYYB011）

作者簡介：劉雪梅（1996-）女，貴州黔東南人，碩士，研究方向為分子生物學(xué)與生物化學(xué)。（E-mail）lxm12252021@163.com

通訊作者：郝愛平，（E-mail）swxhap@126.com