• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于P18蛋白基因的新型鴨呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

    2021-01-29 10:44:14沈麗雅,潘群興,盧鳳英,董永毅,張敬峰,吳坤,劉青濤,姜平,張小飛

    沈麗雅,潘群興,盧鳳英,董永毅,張敬峰,吳坤,劉青濤,姜平,張小飛

    摘要:根據(jù)新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)特有的非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。用該方法和普通RT-PCR方法對(duì)239份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),NDRV陽(yáng)性檢出率分別為23.85%(57/239)和17.57%(42/239),熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的檢出率明顯高于普通RT-PCR檢測(cè)方法。隨機(jī)取5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)的陽(yáng)性的樣品用鴨胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),經(jīng)普通RT-PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序證明均為NDRV。用103.0 ELD50劑量的NDRV-SY株人工感染14日齡雛鴨,不同時(shí)間采集泄殖腔肛拭子樣品,通過熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行排毒情況監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示,雛鴨人工感染NDRV 48 h時(shí)可以從泄殖腔檢測(cè)到病毒排出,持續(xù)時(shí)間可達(dá)20 d,并發(fā)現(xiàn)在病毒感染后的第5 d和第10 d出現(xiàn)2次排毒高峰。試驗(yàn)結(jié)果表明,建立的NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性和較高的敏感性,可用于NDRV感染的排毒監(jiān)測(cè)以及臨床感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

    關(guān)鍵詞:新型鴨呼腸孤病毒;P18蛋白基因;熒光定量RT-PCR

    中圖分類號(hào):S858.325.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1000-4440(2021)06-1481-07

    Establishment of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of novel duck reovirus based on the gene encoding P18 protein

    SHEN Li-ya1,2,PAN Qun-xing1,LU Feng-ying1,DONG Yong-yi3,ZHANG Jing-feng1,WU Kun3,LIU Qing-tao1,JIANG Ping2,ZHANG Xiao-fei1

    (1.Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;2.College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3.Jiangsu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China)

    Abstract:In order to rapidly detect the novel duck reovirus (NDRV), the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established with a pair of specific primers designed according to the conservative gene sequence of the unique non-structural protein P18 of NDRV. 239 clinical samples were detected by the fluorescence quantitative RT-PCR method and ordinary RT-PCR methods, and the positive detection rates of the samples were 23.85% (57/239) and 17.57% (42/239), respectively. The detection rate of fluorescence quantitative RT-PCR method was significantly higher than that of ordinary RT-PCR method. Five samples were randomly selected for virus culture with duck embryo from the NDRV positive samples by the fluorescence quantitative RT-PCR method. It was proved that the five isolated viruses were NDRV by ordinary RT-PCR amplification and DNA sequencing technique. The 14-day-old ducklings were artificially infected with NDRV-SY strain at a dose of 103.0ELD50, and the cloaca swabs of these ducklings were collected for NDRV detection by this fluorescence quantitative RT-PCR at different time points. The results showed that the inoculated ducklings shed virus as early as 48 hours post inoculation, and could continue until 20 days post inoculation. In addition, two peaks of viral titers were observed at five and ten days post inoculation. Therefore, the established fluorescence quantitative RT-PCR is specific and sensitive, and can be used for the detection of NDRV, early diagnosis of clinical infection and epidemiological investigation.

    Key words:novel duck reovirus;gene encoding P18 protein;fluorescence quantitative RT-PCR

    鴨呼腸孤病毒病已成為危害中國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病,番鴨、麻鴨、半番鴨和北京鴨均可感染呼腸孤病毒(Reovirus,RV)并發(fā)病。根據(jù)宿主和病變的差異,鴨呼腸孤病毒病分為3種主要類型,即番鴨“白點(diǎn)病”、番鴨“新肝病”和北京鴨“脾壞死病”,其病原分別為MDRV[1-2]、新致病型番鴨呼腸孤病毒(New pathotype of Muscovy duck reovirus,N-MDRV)[3-4]和新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)[5-6]。2017年以來該病的發(fā)生率迅速上升,主要感染1月齡以內(nèi)的雛鴨,且發(fā)病率和死亡率隨著日齡的減少而升高。感染NDRV使得雛鴨出現(xiàn)免疫抑制,往往繼發(fā)一些細(xì)菌性疾病,臨床上報(bào)道過大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌與NDRV混合感染的病例[7-8]。

    NDRV的基因節(jié)段可分為3組,即L(大)、M(中)和S(?。┕?0個(gè)RNA片段,其中S組有S1、S2、S3、S4 4個(gè)基因片段[9-10]。NDRV的S1基因片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白P10、P18和σC;而MDRV的P10和σC蛋白則是由S4基因片段編碼,缺少編碼P18蛋白對(duì)應(yīng)的基因 [11-13],因此,非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因?yàn)镹DRV特有基因。研究結(jié)果顯示,在感染細(xì)胞后第6 h P18即可被檢測(cè)到,表明該蛋白質(zhì)為病毒感染早期表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒的復(fù)制[14-15]。因此本研究選擇NDRV P18蛋白基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo),建立NDRV熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法,并應(yīng)用該方法檢測(cè)臨床送檢樣品和NDRV強(qiáng)毒株(SY株)人工感染雛鴨不同時(shí)間的排毒情況。

    1材料與方法

    1.1毒株、SPF雞胚、雛鴨

    新型鴨呼腸孤病毒(NDRV SY株)、鴨源禽腺病毒4型(FAdV-4,SD2016-1株)、番鴨呼腸孤病毒(MDRV,CA株)、鴨甲型肝炎病毒1型(DHAV-1,W株)、鴨甲型肝炎病毒3型(DHAV-3,SD株)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV,JS2010株)、鴨瘟病毒(DEV,AV1221株)、鴨圓環(huán)病毒(DuCV,AQ0901株)、鴨源H9亞型禽流感病毒(AIV-H9,NJ01株)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的SPF鴨種蛋,本實(shí)驗(yàn)室孵化至11日齡;雛鴨由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃梅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地NDRV抗體陰性麻鴨所產(chǎn)種蛋孵化。

    1.2主要試劑

    Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qRT-PCR (gDNA digester plus)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)熒光定量試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司,核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收盒購(gòu)自Axygen 公司。

    1.3熒光定量RT-PCR方法的建立

    1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已發(fā)表的NDRV P18蛋白基因的高度保守區(qū)序列,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,上游引物(Primer-F)為5′-CTTCGTGATGTCACTCCCGC-3′,下游引物(Primer-R)為5′-CGTCGCTTGACTGGTAGGGG-3′,預(yù)期目的片段大小為366 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

    1.3.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以NDRV SY株核酸為模板和NDRV P18蛋白基因特異性引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增,獲得NDRV P18蛋白基因片段,將其克隆到pMD18-T載體,獲得克隆質(zhì)粒pMD18-P18。挑取重組菌并提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,鑒定為陽(yáng)性的菌送南京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,并與GenBank中的已公布的NDRV分離株序列進(jìn)行同源性比較。

    1.3.3熒光定量RT-PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化以構(gòu)建的重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,采用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(High Rox)試劑盒推薦的20 μl反應(yīng)體系,對(duì)退火溫度(55~65 ℃)和引物量(0.1 μl、0.2 μl、0.4 μl、0.6 μl)進(jìn)行優(yōu)化。

    1.3.4熒光定量RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將構(gòu)建的重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋,取1μl 1.42×103~1.42×108拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè),以Ct值為縱坐標(biāo),以稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.5特異性試驗(yàn)以NDRV、FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒的cDNA為模板,用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè),檢驗(yàn)該方法的特異性。

    1.3.6敏感性試驗(yàn)以10倍倍比稀釋(1 μl 1.42×101~1.42×107拷貝)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng),檢驗(yàn)該方法的敏感性。

    1.3.7重復(fù)性試驗(yàn)以同一批次提取的pMD18-P18陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的3個(gè)不同含量(1 μl 1.42×103~1.42×105拷貝)和不同批次提取的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的3個(gè)不同含量(1 μl 1.42×103~1.42×105拷貝)為模板進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算其組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)。

    1.3.8臨床樣品檢測(cè)將2020年江蘇省、山東省等地區(qū)鴨場(chǎng)送檢的239份臨床樣品,提取核酸并反轉(zhuǎn)錄后,利用建立的NDRV熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)[16],比較檢測(cè)結(jié)果。

    1.3.9病毒分離與鑒定隨機(jī)取5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)NDRV陽(yáng)性的樣品(脾臟或肝臟),分別用含雙抗各1 000 IU的生理鹽水制成1∶5勻漿,37 ℃作用1 h,凍融3次,6 000 g離心10 min,上清液用0.22 μm濾器過濾除菌,經(jīng)尿囊腔途徑接種11日齡SPF鴨胚5枚,每1枚0.2 ml,37 ℃孵化,24 h內(nèi)的死胚棄去,每日照胚2次,取出死胚置2~8 ℃暫存,至120 h時(shí)取出剩余胚置2~8 ℃過夜。無菌收獲尿囊液,按樣品將收獲的尿囊液混合,分別對(duì)5份鴨胚尿囊液混合樣進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析,針對(duì)NDRV特有的P18蛋白基因設(shè)計(jì)的上游引物(P18-F)為5′-ATGTCACTCCCGCCAACC-3′,下游引物(P18-R )為5′-CAGTTGTTGATTGTAGA T-3′,預(yù)期目的片段大小為488 bp。

    1.3.10人工感染雛鴨試驗(yàn)設(shè)置15只14日齡的健康雛鴨作為試驗(yàn)組,每只腿部皮下注射1.0 ml NDRV-SY株(病毒滴毒為1 ml1×103 ELD50),另設(shè)置15只14日齡健康雛鴨作為對(duì)照組,每只腿部皮下注射1.0 ml生理鹽水。在攻毒后7 d,從試驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)選擇9只雛鴨進(jìn)行剖檢,觀察病理變化。攻毒后6 h開始用無菌棉簽采集雛鴨泄殖腔肛拭子樣品置于生理鹽水中,第1 d每隔6 h采集一次,2~3 d每隔12 h采集一次,4~30 d每天采集一次,-80 ℃保存。將采集的肛拭子樣品凍融3次后經(jīng)漩渦振蕩,8 000 r/min離心4 min,取200 μl上清液,用試劑盒提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,共收集到624份鴨肛拭子cDNA樣品(312份為NDRV人工感染麻鴨試驗(yàn)組肛拭子cDNA,312份為健康雛鴨肛拭子cDNA)。用建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)樣品cDNA進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)3次,根據(jù)Ct值和熔解曲線分析NDRV感染鴨的排毒情況。

    2結(jié)果

    2.1重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

    重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定,得到1條366 bp的特異性片段,與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì),結(jié)果顯示,擴(kuò)增的P18蛋白基因片段與GenBank上公布的NDRV不同分離株的 S1基因片段的P18蛋白基因序列同源性高達(dá)99.7%以上,表明PCR擴(kuò)增的目的基因是NDRV病毒基因組中高度保守區(qū)序列, pMD18-P18質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    M:DNA marker 2 000;1:pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;2:陰性對(duì)照。

    2.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

    對(duì)引物量、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,最終確定NDRV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系(20.0 μl):Hieff qRT-PCR SYBR Green Master Mix(High Rox)10.0 μl,引物F/R(10 μmol/L)各0.1 μl,模板2.0 μl,DEPC水7.8 μl。最優(yōu)反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,62 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。

    2.3NDRV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

    將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng),并繪制NDRV的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線在1 μl 1.42×103 ~1.42×108拷貝具有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998,擴(kuò)增效率為90.105%。NDRV的拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為:Y=-3.582x+36.430,其斜率為-3.582,截距為36.43。依據(jù)此表達(dá)式,已知檢測(cè)樣品的Ct值,便可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。NDRV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熔解曲線峰值單一(圖3),熔解溫度在84.94 ℃左右。

    2.4NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的特異性

    用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)不同病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,只有NDRV病毒核酸有擴(kuò)增曲線,判定為陽(yáng)性,而FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(圖4)。

    △Rn=每點(diǎn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度-熒光基線強(qiáng)度。1: NDRV; 2~9: FAdV-4、MDRV、 DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9;10: 陰性對(duì)照。

    2.5NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性

    用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)10倍梯度稀釋(1 μl 1.42×101~1.42×107拷貝)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,該方法最低可以檢出1 μl 1.42×101拷貝的模板(圖5)。

    △Rn=每點(diǎn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度-熒光基線強(qiáng)度。

    2.6NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性

    對(duì)同一批次的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒3個(gè)不同含量(1 μl 1.42×103~1.42×105拷貝)和不同批次的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒3個(gè)不同含量(1 μl 1.42×103 ~1.42×105拷貝)模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)均小于0.5% (表1)。

    2.7臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

    用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)239份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),檢出陽(yáng)性樣品57份,檢出率為23.85%;普通RT-PCR檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品42份,檢出率為17.57%。臨床樣品檢出陽(yáng)性率高于普通RT-PCR檢測(cè)方法,且二者的檢測(cè)符合率為93.7%。說明建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法比普通RT-PCR檢測(cè)方法更適合NDRV臨床的準(zhǔn)確檢測(cè)(表2)。

    2.8NDRV病毒分離與鑒定

    5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)NDRV陽(yáng)性的組織樣品經(jīng)處理后,分別接種11日齡 SPF鴨胚各5枚,5個(gè)樣品接種的鴨胚于接種后96~120 h均有1~2枚胚死亡。對(duì)每個(gè)接種樣品的死亡胚和120 h存活胚尿囊液收獲后混合,進(jìn)行 P18蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增,5份樣品的鴨胚尿囊液均擴(kuò)增出488 bp目的基因片段,大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖6)。測(cè)序結(jié)果顯示,擴(kuò)增的目的基因與NDRV 的P18蛋白基因序列一致,表明分離的5株病毒均為NDRV。

    M:DNA marker 2 000;1~5:樣品1~樣品5;6:陽(yáng)性對(duì)照;7:陰性對(duì)照。

    2.9人工感染雛鴨試驗(yàn)結(jié)果

    NDRV SY株人工感染健康雛鴨后第7 d,從試驗(yàn)組和對(duì)照組中,隨機(jī)選擇9只雛鴨剖檢。結(jié)果顯示,試驗(yàn)組雛鴨肝臟腫大,有灰白色壞死點(diǎn)或出血斑;脾臟表面出現(xiàn)核桃皮狀、小米粒至綠豆粒大小的不規(guī)則壞死灶(圖7)。對(duì)照組肝、脾均無明顯病變(圖7)。

    A:健康肝;B:壞死肝;C:健康脾;D:壞死脾。

    用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)采集的雛鴨泄殖腔肛拭子樣品進(jìn)行檢測(cè),得到每只雛鴨各時(shí)間段樣品的Ct值,用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出其對(duì)應(yīng)的病毒拷貝數(shù)常用對(duì)數(shù)值,并計(jì)算各時(shí)間段平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,繪制排毒規(guī)律曲線圖。如圖8所示,試驗(yàn)組NDRV SY株感染鴨從第2 d(48 h)開始排毒,隨后排毒量不斷增加;第5 d達(dá)到第1個(gè)排毒高峰,病毒拷貝數(shù)為1 μl 1.42×102拷貝;第6~8 d,排毒量顯著減少,出現(xiàn)一個(gè)短暫的降低;從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加,第10 d形成第2個(gè)小高峰,病毒拷貝數(shù)為1 μl 1.42×101拷貝;個(gè)體排毒過程一直持續(xù)到第20 d左右,對(duì)照組均未檢出病毒。

    48 h~7 d病毒載量為15只雛鴨肛拭子病毒拷貝數(shù)的平均值,每個(gè)樣品3次重復(fù);8~20 d病毒載量為6只雛鴨肛拭子病毒拷貝數(shù)的平均值,每個(gè)樣品3次重復(fù),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,*、**表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)人工感染組病毒拷貝數(shù)與對(duì)照組之間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平。

    3討論

    NDRV、MDRV和ADV都是禽呼腸孤病毒,生物學(xué)特征表現(xiàn)基本相同,但是臨床和抗原性表現(xiàn)存在較大的差異[17]。NDRV可感染各種鴨,不僅能引起雛鴨發(fā)病和死亡,還能引起免疫抑制和生長(zhǎng)發(fā)育障礙,為NDRV的防控帶來極大的困難。因而,建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的快速檢測(cè)方法對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)NDRV十分重要。熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度高于普通RT-PCR,通常高100倍以上。張博等[18]根據(jù)NDRV σB基因的序列保守區(qū),建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。以NDRV特有的非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因?yàn)闄z測(cè)靶基因,該基因能將NDRV與MDRV和其他禽呼腸孤病毒區(qū)別開來[11-13]。P18蛋白還是病毒感染初期就表達(dá)的蛋白,參與病毒的復(fù)制。因此,針對(duì)NDRV P18蛋白基因進(jìn)行檢測(cè),有利于該病的早期診斷。

    建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度高,最低檢測(cè)限為1 μl 1.42×101拷貝的模板,與張博等[18]建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性相同;比常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)方法靈敏1 000倍[16];熔解曲線結(jié)果顯示,所擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值基本相同,擴(kuò)增特異性好;與其他常見鴨源性病毒無交叉反應(yīng),說明該方法具有很強(qiáng)的特異性;組內(nèi)和組間的變異系數(shù)小于0.5%,表明該方法重復(fù)性好。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),本熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率為23.85%,高于普通RT-PCR檢測(cè)方法的17.57%,且二者的檢測(cè)符合率為93.7%。隨機(jī)選5份經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法檢出為陽(yáng)性的樣品接種SPF鴨胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),對(duì)各自收獲的鴨胚尿囊液用NDRV特有P18蛋白基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的基因片段,基因測(cè)序結(jié)果顯示與NDRV 的P18蛋白基因序列一致,證明分離的5株病毒均為NDRV。試驗(yàn)結(jié)果表明,建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法更適合NDRV快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

    NDRV SY株是由本實(shí)驗(yàn)室從江蘇省沭陽(yáng)縣采集并分離鑒定的強(qiáng)毒株[19]。用該毒株人工感染雛鴨動(dòng)物試驗(yàn)中,利用NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的624份鴨肛拭子cDNA樣品(312份為NDRV人工感染麻鴨試驗(yàn)組肛拭子cDNA,312份為健康雛鴨肛拭子cDNA)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,試驗(yàn)組NDRV-SY株感染鴨從第2 d(48 h)開始排毒,第5 d達(dá)到第1個(gè)排毒高峰,從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加,第10 d形成第2個(gè)小高峰,排毒期一直持續(xù)到20 d左右,這可能與NDRV在宿主體內(nèi)的感染與復(fù)制有關(guān)。試驗(yàn)組雛鴨在攻毒后第5 d起開始出現(xiàn)肝臟、脾臟壞死,在攻毒后第7 d肝臟、脾臟病變最為明顯,這與人工感染雛鴨排毒高峰期和變化趨勢(shì)相符合。

    因此,本研究基于NDRV P18蛋白基因成功建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法,該方法適用于NDRV感染的排毒監(jiān)測(cè)以及臨床感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

    參考文獻(xiàn):

    [1]胡奇林,陳少鶯,林鋒強(qiáng),等.番鴨呼腸孤病毒的鑒定[J].病毒學(xué)報(bào),2004,20(3):242-248.

    [2]黃瑜,程龍飛,李文楊,等.雛半番鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(1):14-15.

    [3]陳少鸞,陳仕龍,林鋒強(qiáng),等.一種新的鴨?。〞好喅鲅詨乃佬愿窝祝┎≡瓕W(xué)研究初報(bào)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(16):28-31.

    [4]劉鴻,陸新浩,任祖伊,等.番鴨“新肝病”在浙江的流行情況及防控措施[J].浙江畜牧獸醫(yī),2010,35(6):26-28.

    [5]陳少鶯,陳仕龍,林鋒強(qiáng),等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學(xué)報(bào),2012,28 (3):224-230.

    [6]陳宗艷,朱英奇,王世傳,等.一株新型鴨源呼腸孤病毒(TH11株)的分離與鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2012,20(1):10-15.

    [7]焦哲,宋彥民,孫秀秀,等.鴨疫里默氏桿菌與鴨源呼腸孤病毒混合感染的病理學(xué)診斷[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2019,49(9):1194- 1198.

    [8]爨淑楠,徐海軍,范瀟會(huì),等.一例雛番鴨大腸桿菌和呼腸孤病毒混合感染的診治[J].中國(guó)動(dòng)物保健, 2020,22(10):44-45.

    [9]陳海鵬,云濤,張存,等.新型番鴨呼腸孤病毒σC蛋白的原核表達(dá)及其抗原特性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014 ,26(6):1448-1452.

    [10]YUN T, HUA J G, YE W C, et al. Comparative proteomic analysis revealed complex responses to classical/novel duck reovirus infections in Cairna moschata[J]. Scientific Reports, 2018,8(1):10079.

    [11]MA G, WANG D, SHI J, et al. Complete genomic sequence of reovirus isolate from Pekin ducklings in China[J].J Virol,2012,86:13137.

    [12]WANG D, XU F, MA G, et al. Complete genomic sequence of a new Muscovy duck-origin reovirus from China[J].J Virol, 2012,86:12445.

    [13]吳巧梅.水禽呼腸孤病毒p18蛋白鑒定及其反向遺傳操作平臺(tái)的建立[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2017.

    [14]吳巧梅,李傳峰,朱杰,等.新型鴨呼腸孤病毒P18基因的表達(dá)與鑒定[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì). 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集. 通遼:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì),2016.

    [15]DU X, DING M, WU Q, et al. Characterization of a P18 protein in the S1 segment of the novel duck reovirusgenome[J]. Acta Virologica, 2020,64(1):59-66.

    [16]云濤,張存,華炯鋼,等.鴨呼腸孤病毒基因Ⅰ型與Ⅱ型鑒別診斷RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,24(12):1964-1972.

    [17]王錫堃,唐秀英,劉慶祥,等.應(yīng)用瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢查雞病毒性關(guān)節(jié)炎[ J]. 家畜傳染病,1985(3 ):26-27.

    [18]張博,陳立功,武華,等.新型鴨呼腸孤病毒 Taq Man 探針實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2020, 43(5):80-84.

    [19]晁錦,盧鳳英,潘群興,等.新型鴨呼腸孤病毒SY株的分離鑒定及培養(yǎng)特性[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2020,28(3):1-8.

    (責(zé)任編輯:張震林)

    收稿日期:2021-03-19

    基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0500804);江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(水禽)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目[JATS(2020)321]

    作者簡(jiǎn)介:沈麗雅(1996-),女,浙江湖州人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物傳染病防治研究。(Tel)15205172927;(E-mail)823320658@qq.com

    通訊作者:張小飛,(E-mail)xiaofei0804@sina.com;姜平,(E-mail) jiangp@ njau.edu.cn

    欧美成人一区二区免费高清观看| 成人综合一区亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久中文看片网| 一级黄色大片毛片| 校园人妻丝袜中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| www.色视频.com| 国产欧美日韩精品一区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美极品一区二区三区四区| 搡老妇女老女人老熟妇| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲美女搞黄在线观看| 春色校园在线视频观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩成人伦理影院| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品午夜福利在线看| 亚洲成人久久性| 国产午夜精品论理片| 国产黄片视频在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久成人av| 午夜免费激情av| 日韩三级伦理在线观看| 熟女电影av网| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜福利在线在线| 国产精品.久久久| 国产成人a区在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 草草在线视频免费看| 日本熟妇午夜| 日韩av不卡免费在线播放| 特级一级黄色大片| 我要搜黄色片| 亚洲国产精品sss在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇人妻精品综合一区二区 | 精品无人区乱码1区二区| 成人国产麻豆网| 国产精品国产高清国产av| 国产伦一二天堂av在线观看| 如何舔出高潮| 亚洲国产精品成人综合色| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 黄色配什么色好看| 成人二区视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品免费一区二区三区在线| 黄色日韩在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 91精品国产九色| 岛国在线免费视频观看| 美女黄网站色视频| 亚洲精品自拍成人| 小说图片视频综合网站| 国产色爽女视频免费观看| 成人av在线播放网站| 中国国产av一级| 国产不卡一卡二| 在线a可以看的网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产黄片视频在线免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 天天一区二区日本电影三级| 日本一本二区三区精品| 日韩一区二区三区影片| 欧美日韩乱码在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 99久国产av精品| 人妻少妇偷人精品九色| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产黄片美女视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久午夜亚洲精品久久| or卡值多少钱| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 天天躁日日操中文字幕| 亚洲av男天堂| 女同久久另类99精品国产91| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久国内精品自在自线图片| 一级毛片久久久久久久久女| 国产不卡一卡二| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美高清成人免费视频www| 色视频www国产| 国内精品宾馆在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级黄片播放器| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲精品国产成人久久av| 91av网一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 内地一区二区视频在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产色片| 一区二区三区四区激情视频 | 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品国产av成人精品| 精品免费久久久久久久清纯| 国产黄a三级三级三级人| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本黄大片高清| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费在线观看成人毛片| 日韩欧美精品免费久久| 丝袜美腿在线中文| 日本免费a在线| 一级毛片电影观看 | 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲欧美日韩高清专用| 嫩草影院入口| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级毛片电影观看 | 三级经典国产精品| 免费无遮挡裸体视频| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 女人被狂操c到高潮| 少妇熟女欧美另类| 三级毛片av免费| 国产淫片久久久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一夜夜www| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩三级伦理在线观看| 少妇的逼好多水| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 日本免费a在线| 嫩草影院新地址| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产黄色小视频在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 一级av片app| 国产精品一区www在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 在线免费十八禁| 亚洲国产精品成人久久小说 | 在线观看66精品国产| av福利片在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 九草在线视频观看| 亚洲国产精品合色在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 白带黄色成豆腐渣| 大香蕉久久网| 在线a可以看的网站| 小说图片视频综合网站| 不卡一级毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩欧美 国产精品| 91久久精品电影网| 欧美+亚洲+日韩+国产| av在线观看视频网站免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品人妻视频免费看| 亚洲精品成人久久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 热99在线观看视频| 久久久久久久久久黄片| 有码 亚洲区| 乱人视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产黄a三级三级三级人| 97超视频在线观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产精品一区二区性色av| 九九在线视频观看精品| 欧美日韩综合久久久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| av.在线天堂| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲经典国产精华液单| .国产精品久久| 岛国毛片在线播放| 看十八女毛片水多多多| 亚洲色图av天堂| 国语自产精品视频在线第100页| 三级经典国产精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 啦啦啦啦在线视频资源| 女人被狂操c到高潮| 一级av片app| 国产69精品久久久久777片| 美女高潮的动态| 极品教师在线视频| 免费看av在线观看网站| 日本三级黄在线观看| 亚洲第一电影网av| 国产午夜精品一二区理论片| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲美女视频黄频| 国产高清视频在线观看网站| 国产一区二区在线av高清观看| 舔av片在线| 好男人视频免费观看在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 99热全是精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲三级黄色毛片| 中国美白少妇内射xxxbb| 岛国毛片在线播放| 不卡一级毛片| 国产精品无大码| 久久久久久久久久黄片| 哪里可以看免费的av片| 亚洲av一区综合| 亚洲精品影视一区二区三区av| 精品一区二区三区视频在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久人妻综合| 成人欧美大片| 亚洲性久久影院| 亚洲中文字幕日韩| 22中文网久久字幕| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品久久久久久精品电影| 黄片无遮挡物在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 美女内射精品一级片tv| 亚洲成a人片在线一区二区| 青春草国产在线视频 | 麻豆国产97在线/欧美| 久久久久久伊人网av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 天堂√8在线中文| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久人人爽人人爽人人片va| 最后的刺客免费高清国语| 嘟嘟电影网在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 看片在线看免费视频| 伦精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 免费看a级黄色片| 中文欧美无线码| 色综合亚洲欧美另类图片| 麻豆国产97在线/欧美| 免费观看人在逋| 午夜精品在线福利| 免费看av在线观看网站| 国产乱人偷精品视频| 99热精品在线国产| 久久久久久久久久成人| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成人久久性| 久久国产乱子免费精品| av免费在线看不卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲va在线va天堂va国产| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本一本二区三区精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 伦理电影大哥的女人| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜a级毛片| 91久久精品国产一区二区三区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 一进一出抽搐动态| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美+日韩+精品| 成人毛片60女人毛片免费| avwww免费| 久久久久久大精品| 亚洲欧美清纯卡通| 又爽又黄无遮挡网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 一级黄色大片毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 有码 亚洲区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜久久久久精精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久久久午夜电影| 国模一区二区三区四区视频| 国产单亲对白刺激| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成年女人看的毛片在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本一二三区视频观看| 免费黄网站久久成人精品| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费观看人在逋| 午夜激情欧美在线| 国产成人精品一,二区 | 哪里可以看免费的av片| 欧美成人a在线观看| 国产精品伦人一区二区| 免费观看精品视频网站| 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品精品国产色婷婷| 乱系列少妇在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 在线国产一区二区在线| 日本黄色视频三级网站网址| 五月伊人婷婷丁香| 深爱激情五月婷婷| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜久久久久精精品| 久久久久国产网址| 日韩精品青青久久久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲av男天堂| 精品久久久久久久末码| 极品教师在线视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 国产成人精品婷婷| 男插女下体视频免费在线播放| 99久国产av精品| 国产伦一二天堂av在线观看| av天堂在线播放| 国产成年人精品一区二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 免费看日本二区| 日韩欧美在线乱码| 欧美一区二区精品小视频在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中国美女看黄片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 91久久精品电影网| 看非洲黑人一级黄片| 国产黄色小视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 中文字幕久久专区| 成年版毛片免费区| 欧美日韩精品成人综合77777| 青青草视频在线视频观看| 免费在线观看成人毛片| 99热精品在线国产| 1000部很黄的大片| 国产成人91sexporn| 嫩草影院入口| 成人亚洲精品av一区二区| 不卡视频在线观看欧美| 免费观看a级毛片全部| 日日干狠狠操夜夜爽| 干丝袜人妻中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜精品在线福利| 国产日韩欧美在线精品| av.在线天堂| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 成人午夜高清在线视频| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久a久久爽久久v久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品三级大全| 久久久久网色| 99热精品在线国产| 成人毛片a级毛片在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 毛片女人毛片| 国产av一区在线观看免费| 网址你懂的国产日韩在线| 久久99热这里只有精品18| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产毛片a区久久久久| 日本五十路高清| 观看美女的网站| 免费看av在线观看网站| 特级一级黄色大片| 欧美日韩在线观看h| av在线播放精品| 久久草成人影院| 成年版毛片免费区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲国产欧美人成| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久中文| 免费看a级黄色片| 观看美女的网站| 国产91av在线免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 色吧在线观看| 国内精品宾馆在线| 成人综合一区亚洲| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品永久免费网站| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品国产成人久久av| 久久草成人影院| 女同久久另类99精品国产91| 日韩三级伦理在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 日本一二三区视频观看| 麻豆一二三区av精品| 国产三级在线视频| 六月丁香七月| 免费观看精品视频网站| 久久精品国产自在天天线| 好男人在线观看高清免费视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品国产av成人精品| 联通29元200g的流量卡| 村上凉子中文字幕在线| videossex国产| 只有这里有精品99| 最近视频中文字幕2019在线8| 久99久视频精品免费| 国产伦在线观看视频一区| 一区福利在线观看| 春色校园在线视频观看| 日韩一区二区视频免费看| 美女大奶头视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天堂网av新在线| 免费看a级黄色片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 直男gayav资源| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久国产成人精品二区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 性欧美人与动物交配| 免费av不卡在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品99久久久久久久久| avwww免费| 久99久视频精品免费| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品久久国产蜜桃| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美不卡视频在线免费观看| 深夜精品福利| 午夜福利成人在线免费观看| 只有这里有精品99| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近手机中文字幕大全| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 性插视频无遮挡在线免费观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产高清激情床上av| 亚洲人与动物交配视频| 网址你懂的国产日韩在线| 丰满乱子伦码专区| 国产乱人偷精品视频| 亚洲成人久久性| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美又色又爽又黄视频| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久久成人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 女同久久另类99精品国产91| 久久久精品欧美日韩精品| 国产综合懂色| av免费观看日本| 能在线免费观看的黄片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 观看免费一级毛片| 五月伊人婷婷丁香| 国产麻豆成人av免费视频| 免费av不卡在线播放| 欧美性感艳星| 精品久久久噜噜| 日韩中字成人| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 黄色日韩在线| 久久综合国产亚洲精品| av在线老鸭窝| 精华霜和精华液先用哪个| 国产人妻一区二区三区在| 欧美最新免费一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 日韩大尺度精品在线看网址| 搡女人真爽免费视频火全软件| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲中文字幕日韩| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产不卡一卡二| 成人av在线播放网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品,欧美在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产探花极品一区二区| 亚洲美女视频黄频| 在线观看午夜福利视频| 又爽又黄a免费视频| 国产亚洲精品av在线| 三级国产精品欧美在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线观看一区二区三区| 成年免费大片在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 一本久久中文字幕| 成年版毛片免费区| 综合色丁香网| 日韩成人伦理影院| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久亚洲精品不卡| 成人鲁丝片一二三区免费| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国产色婷婷99| 99热只有精品国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久精品国产自在天天线| 国产69精品久久久久777片| 波多野结衣高清无吗| 乱系列少妇在线播放| 国产精品一区二区性色av| 美女cb高潮喷水在线观看| 九九在线视频观看精品| 免费搜索国产男女视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 看片在线看免费视频| 麻豆国产97在线/欧美| 国产伦精品一区二区三区四那| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品久久久久久久久久久久久| 久久这里只有精品中国| 精品日产1卡2卡| 日韩一本色道免费dvd| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 小说图片视频综合网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av一区综合| 91狼人影院| 深爱激情五月婷婷| 搞女人的毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 天天一区二区日本电影三级| or卡值多少钱| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级二级三级毛片免费看| 国产午夜精品论理片| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产成人午夜福利电影在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久久午夜电影| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久久久久中文| 激情 狠狠 欧美| 97超碰精品成人国产| 听说在线观看完整版免费高清| 尾随美女入室| 综合色丁香网| 国内精品一区二区在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 成年版毛片免费区|