基于P18蛋白基因的新型鴨呼腸孤病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

沈麗雅，潘群興，盧鳳英，董永毅，張敬峰，吳坤，劉青濤，姜平，張小飛

摘要：根據(jù)新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）特有的非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。用該方法和普通RT-PCR方法對(duì)239份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，NDRV陽(yáng)性檢出率分別為23.85%（57/239）和17.57%（42/239），熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的檢出率明顯高于普通RT-PCR檢測(cè)方法。隨機(jī)取5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)的陽(yáng)性的樣品用鴨胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，經(jīng)普通RT-PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序證明均為NDRV。用103.0 ELD50劑量的NDRV-SY株人工感染14日齡雛鴨，不同時(shí)間采集泄殖腔肛拭子樣品，通過熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行排毒情況監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，雛鴨人工感染NDRV 48 h時(shí)可以從泄殖腔檢測(cè)到病毒排出，持續(xù)時(shí)間可達(dá)20 d，并發(fā)現(xiàn)在病毒感染后的第5 d和第10 d出現(xiàn)2次排毒高峰。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性和較高的敏感性，可用于NDRV感染的排毒監(jiān)測(cè)以及臨床感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：新型鴨呼腸孤病毒;P18蛋白基因;熒光定量RT-PCR

中圖分類號(hào)：S858.325.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2021）06-1481-07

Establishment of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of novel duck reovirus based on the gene encoding P18 protein

SHEN Li-ya1，2，PAN Qun-xing1，LU Feng-ying1，DONG Yong-yi3，ZHANG Jing-feng1，WU Kun3，LIU Qing-tao1，JIANG Ping2，ZHANG Xiao-fei1

（1.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.Jiangsu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention， Nanjing 210009， China）

Abstract：In order to rapidly detect the novel duck reovirus （NDRV）， the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established with a pair of specific primers designed according to the conservative gene sequence of the unique non-structural protein P18 of NDRV. 239 clinical samples were detected by the fluorescence quantitative RT-PCR method and ordinary RT-PCR methods， and the positive detection rates of the samples were 23.85% （57/239） and 17.57% （42/239）， respectively. The detection rate of fluorescence quantitative RT-PCR method was significantly higher than that of ordinary RT-PCR method. Five samples were randomly selected for virus culture with duck embryo from the NDRV positive samples by the fluorescence quantitative RT-PCR method. It was proved that the five isolated viruses were NDRV by ordinary RT-PCR amplification and DNA sequencing technique. The 14-day-old ducklings were artificially infected with NDRV-SY strain at a dose of 103.0ELD50， and the cloaca swabs of these ducklings were collected for NDRV detection by this fluorescence quantitative RT-PCR at different time points. The results showed that the inoculated ducklings shed virus as early as 48 hours post inoculation， and could continue until 20 days post inoculation. In addition， two peaks of viral titers were observed at five and ten days post inoculation. Therefore， the established fluorescence quantitative RT-PCR is specific and sensitive， and can be used for the detection of NDRV， early diagnosis of clinical infection and epidemiological investigation.

Key words：novel duck reovirus;gene encoding P18 protein;fluorescence quantitative RT-PCR

鴨呼腸孤病毒病已成為危害中國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病，番鴨、麻鴨、半番鴨和北京鴨均可感染呼腸孤病毒（Reovirus，RV）并發(fā)病。根據(jù)宿主和病變的差異，鴨呼腸孤病毒病分為3種主要類型，即番鴨“白點(diǎn)病”、番鴨“新肝病”和北京鴨“脾壞死病”，其病原分別為MDRV[1-2]、新致病型番鴨呼腸孤病毒（New pathotype of Muscovy duck reovirus，N-MDRV）[3-4]和新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）[5-6]。2017年以來該病的發(fā)生率迅速上升，主要感染1月齡以內(nèi)的雛鴨，且發(fā)病率和死亡率隨著日齡的減少而升高。感染NDRV使得雛鴨出現(xiàn)免疫抑制，往往繼發(fā)一些細(xì)菌性疾病，臨床上報(bào)道過大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌與NDRV混合感染的病例[7-8]。

NDRV的基因節(jié)段可分為3組，即L（大）、M（中）和S（?。┕?0個(gè)RNA片段，其中S組有S1、S2、S3、S4 4個(gè)基因片段[9-10]。NDRV的S1基因片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白P10、P18和σC;而MDRV的P10和σC蛋白則是由S4基因片段編碼，缺少編碼P18蛋白對(duì)應(yīng)的基因 [11-13]，因此，非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因?yàn)镹DRV特有基因。研究結(jié)果顯示，在感染細(xì)胞后第6 h P18即可被檢測(cè)到，表明該蛋白質(zhì)為病毒感染早期表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制[14-15]。因此本研究選擇NDRV P18蛋白基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，建立NDRV熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法檢測(cè)臨床送檢樣品和NDRV強(qiáng)毒株（SY株）人工感染雛鴨不同時(shí)間的排毒情況。

1材料與方法

1.1毒株、SPF雞胚、雛鴨

新型鴨呼腸孤病毒（NDRV SY株）、鴨源禽腺病毒4型（FAdV-4，SD2016-1株）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV，CA株）、鴨甲型肝炎病毒1型（DHAV-1，W株）、鴨甲型肝炎病毒3型（DHAV-3，SD株）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV，JS2010株）、鴨瘟病毒（DEV，AV1221株）、鴨圓環(huán)病毒（DuCV，AQ0901株）、鴨源H9亞型禽流感病毒（AIV-H9，NJ01株）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的SPF鴨種蛋，本實(shí)驗(yàn)室孵化至11日齡;雛鴨由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃梅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地NDRV抗體陰性麻鴨所產(chǎn)種蛋孵化。

1.2主要試劑

Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qRT-PCR （gDNA digester plus）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix （High Rox Plus）熒光定量試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收盒購(gòu)自Axygen 公司。

1.3熒光定量RT-PCR方法的建立

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已發(fā)表的NDRV P18蛋白基因的高度保守區(qū)序列，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物（Primer-F）為5′-CTTCGTGATGTCACTCCCGC-3′，下游引物（Primer-R）為5′-CGTCGCTTGACTGGTAGGGG-3′，預(yù)期目的片段大小為366 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以NDRV SY株核酸為模板和NDRV P18蛋白基因特異性引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增，獲得NDRV P18蛋白基因片段，將其克隆到pMD18-T載體，獲得克隆質(zhì)粒pMD18-P18。挑取重組菌并提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的菌送南京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并與GenBank中的已公布的NDRV分離株序列進(jìn)行同源性比較。

1.3.3熒光定量RT-PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化以構(gòu)建的重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，采用HieffqPCR SYBR Green Master Mix（High Rox）試劑盒推薦的20 μl反應(yīng)體系，對(duì)退火溫度（55～65 ℃）和引物量（0.1 μl、0.2 μl、0.4 μl、0.6 μl）進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4熒光定量RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將構(gòu)建的重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋，取1μl 1.42×103～1.42×108拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，以Ct值為縱坐標(biāo)，以稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5特異性試驗(yàn)以NDRV、FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒的cDNA為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.3.6敏感性試驗(yàn)以10倍倍比稀釋（1 μl 1.42×101～1.42×107拷貝）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，檢驗(yàn)該方法的敏感性。

1.3.7重復(fù)性試驗(yàn)以同一批次提取的pMD18-P18陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的3個(gè)不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）和不同批次提取的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的3個(gè)不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）為模板進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)。

1.3.8臨床樣品檢測(cè)將2020年江蘇省、山東省等地區(qū)鴨場(chǎng)送檢的239份臨床樣品，提取核酸并反轉(zhuǎn)錄后，利用建立的NDRV熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)[16]，比較檢測(cè)結(jié)果。

1.3.9病毒分離與鑒定隨機(jī)取5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)NDRV陽(yáng)性的樣品（脾臟或肝臟），分別用含雙抗各1 000 IU的生理鹽水制成1∶5勻漿，37 ℃作用1 h，凍融3次，6 000 g離心10 min，上清液用0.22 μm濾器過濾除菌，經(jīng)尿囊腔途徑接種11日齡SPF鴨胚5枚，每1枚0.2 ml，37 ℃孵化，24 h內(nèi)的死胚棄去，每日照胚2次，取出死胚置2～8 ℃暫存，至120 h時(shí)取出剩余胚置2～8 ℃過夜。無菌收獲尿囊液，按樣品將收獲的尿囊液混合，分別對(duì)5份鴨胚尿囊液混合樣進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，針對(duì)NDRV特有的P18蛋白基因設(shè)計(jì)的上游引物（P18-F）為5′-ATGTCACTCCCGCCAACC-3′，下游引物（P18-R ）為5′-CAGTTGTTGATTGTAGA T-3′，預(yù)期目的片段大小為488 bp。

1.3.10人工感染雛鴨試驗(yàn)設(shè)置15只14日齡的健康雛鴨作為試驗(yàn)組，每只腿部皮下注射1.0 ml NDRV-SY株（病毒滴毒為1 ml1×103 ELD50），另設(shè)置15只14日齡健康雛鴨作為對(duì)照組，每只腿部皮下注射1.0 ml生理鹽水。在攻毒后7 d，從試驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)選擇9只雛鴨進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。攻毒后6 h開始用無菌棉簽采集雛鴨泄殖腔肛拭子樣品置于生理鹽水中，第1 d每隔6 h采集一次，2～3 d每隔12 h采集一次，4～30 d每天采集一次，-80 ℃保存。將采集的肛拭子樣品凍融3次后經(jīng)漩渦振蕩，8 000 r/min離心4 min，取200 μl上清液，用試劑盒提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，共收集到624份鴨肛拭子cDNA樣品（312份為NDRV人工感染麻鴨試驗(yàn)組肛拭子cDNA，312份為健康雛鴨肛拭子cDNA）。用建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)樣品cDNA進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)Ct值和熔解曲線分析NDRV感染鴨的排毒情況。

2結(jié)果

2.1重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，得到1條366 bp的特異性片段，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，擴(kuò)增的P18蛋白基因片段與GenBank上公布的NDRV不同分離株的 S1基因片段的P18蛋白基因序列同源性高達(dá)99.7%以上，表明PCR擴(kuò)增的目的基因是NDRV病毒基因組中高度保守區(qū)序列， pMD18-P18質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA marker 2 000;1：pMD18-P18標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;2：陰性對(duì)照。

2.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

對(duì)引物量、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定NDRV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系（20.0 μl）：Hieff qRT-PCR SYBR Green Master Mix（High Rox）10.0 μl，引物F/R（10 μmol/L）各0.1 μl，模板2.0 μl，DEPC水7.8 μl。最優(yōu)反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，62 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3NDRV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，并繪制NDRV的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在1 μl 1.42×103 ～1.42×108拷貝具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，擴(kuò)增效率為90.105%。NDRV的拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Y=-3.582x+36.430，其斜率為-3.582，截距為36.43。依據(jù)此表達(dá)式，已知檢測(cè)樣品的Ct值，便可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。NDRV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熔解曲線峰值單一（圖3），熔解溫度在84.94 ℃左右。

2.4NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的特異性

用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)不同病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有NDRV病毒核酸有擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性，而FAdV-4、MDRV、DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9病毒和陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線（圖4）。

△Rn=每點(diǎn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度-熒光基線強(qiáng)度。1： NDRV; 2～9： FAdV-4、MDRV、 DHAV-3、DHAV-1、DTMUV、DEV、DuCV、AIV-H9;10： 陰性對(duì)照。

2.5NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性

用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)10倍梯度稀釋（1 μl 1.42×101～1.42×107拷貝）的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，該方法最低可以檢出1 μl 1.42×101拷貝的模板（圖5）。

△Rn=每點(diǎn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度-熒光基線強(qiáng)度。

2.6NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性

對(duì)同一批次的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒3個(gè)不同含量（1 μl 1.42×103～1.42×105拷貝）和不同批次的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒3個(gè)不同含量（1 μl 1.42×103 ～1.42×105拷貝）模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間Ct值變異系數(shù)均小于0.5% （表1）。

2.7臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)239份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣品57份，檢出率為23.85%;普通RT-PCR檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品42份，檢出率為17.57%。臨床樣品檢出陽(yáng)性率高于普通RT-PCR檢測(cè)方法，且二者的檢測(cè)符合率為93.7%。說明建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法比普通RT-PCR檢測(cè)方法更適合NDRV臨床的準(zhǔn)確檢測(cè)（表2）。

2.8NDRV病毒分離與鑒定

5份熒光定量RT-PCR檢測(cè)NDRV陽(yáng)性的組織樣品經(jīng)處理后，分別接種11日齡 SPF鴨胚各5枚，5個(gè)樣品接種的鴨胚于接種后96～120 h均有1～2枚胚死亡。對(duì)每個(gè)接種樣品的死亡胚和120 h存活胚尿囊液收獲后混合，進(jìn)行 P18蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增，5份樣品的鴨胚尿囊液均擴(kuò)增出488 bp目的基因片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖6）。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的基因與NDRV 的P18蛋白基因序列一致，表明分離的5株病毒均為NDRV。

M：DNA marker 2 000;1～5：樣品1～樣品5;6：陽(yáng)性對(duì)照;7：陰性對(duì)照。

2.9人工感染雛鴨試驗(yàn)結(jié)果

NDRV SY株人工感染健康雛鴨后第7 d，從試驗(yàn)組和對(duì)照組中，隨機(jī)選擇9只雛鴨剖檢。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組雛鴨肝臟腫大，有灰白色壞死點(diǎn)或出血斑;脾臟表面出現(xiàn)核桃皮狀、小米粒至綠豆粒大小的不規(guī)則壞死灶（圖7）。對(duì)照組肝、脾均無明顯病變（圖7）。

A：健康肝;B：壞死肝;C：健康脾;D：壞死脾。

用建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)采集的雛鴨泄殖腔肛拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到每只雛鴨各時(shí)間段樣品的Ct值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出其對(duì)應(yīng)的病毒拷貝數(shù)常用對(duì)數(shù)值，并計(jì)算各時(shí)間段平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，繪制排毒規(guī)律曲線圖。如圖8所示，試驗(yàn)組NDRV SY株感染鴨從第2 d（48 h）開始排毒，隨后排毒量不斷增加;第5 d達(dá)到第1個(gè)排毒高峰，病毒拷貝數(shù)為1 μl 1.42×102拷貝;第6～8 d，排毒量顯著減少，出現(xiàn)一個(gè)短暫的降低;從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加，第10 d形成第2個(gè)小高峰，病毒拷貝數(shù)為1 μl 1.42×101拷貝;個(gè)體排毒過程一直持續(xù)到第20 d左右，對(duì)照組均未檢出病毒。

48 h～7 d病毒載量為15只雛鴨肛拭子病毒拷貝數(shù)的平均值，每個(gè)樣品3次重復(fù);8～20 d病毒載量為6只雛鴨肛拭子病毒拷貝數(shù)的平均值，每個(gè)樣品3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*、**表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)人工感染組病毒拷貝數(shù)與對(duì)照組之間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平。

3討論

NDRV、MDRV和ADV都是禽呼腸孤病毒，生物學(xué)特征表現(xiàn)基本相同，但是臨床和抗原性表現(xiàn)存在較大的差異[17]。NDRV可感染各種鴨，不僅能引起雛鴨發(fā)病和死亡，還能引起免疫抑制和生長(zhǎng)發(fā)育障礙，為NDRV的防控帶來極大的困難。因而，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的快速檢測(cè)方法對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)NDRV十分重要。熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏度高于普通RT-PCR，通常高100倍以上。張博等[18]根據(jù)NDRV σB基因的序列保守區(qū)，建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。以NDRV特有的非結(jié)構(gòu)蛋白P18基因?yàn)闄z測(cè)靶基因，該基因能將NDRV與MDRV和其他禽呼腸孤病毒區(qū)別開來[11-13]。P18蛋白還是病毒感染初期就表達(dá)的蛋白，參與病毒的復(fù)制。因此，針對(duì)NDRV P18蛋白基因進(jìn)行檢測(cè)，有利于該病的早期診斷。

建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度高，最低檢測(cè)限為1 μl 1.42×101拷貝的模板，與張博等[18]建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性相同;比常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)方法靈敏1 000倍[16];熔解曲線結(jié)果顯示，所擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值基本相同，擴(kuò)增特異性好;與其他常見鴨源性病毒無交叉反應(yīng)，說明該方法具有很強(qiáng)的特異性;組內(nèi)和組間的變異系數(shù)小于0.5%，表明該方法重復(fù)性好。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，本熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率為23.85%，高于普通RT-PCR檢測(cè)方法的17.57%，且二者的檢測(cè)符合率為93.7%。隨機(jī)選5份經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法檢出為陽(yáng)性的樣品接種SPF鴨胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，對(duì)各自收獲的鴨胚尿囊液用NDRV特有P18蛋白基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的基因片段，基因測(cè)序結(jié)果顯示與NDRV 的P18蛋白基因序列一致，證明分離的5株病毒均為NDRV。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法更適合NDRV快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

NDRV SY株是由本實(shí)驗(yàn)室從江蘇省沭陽(yáng)縣采集并分離鑒定的強(qiáng)毒株[19]。用該毒株人工感染雛鴨動(dòng)物試驗(yàn)中，利用NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的624份鴨肛拭子cDNA樣品（312份為NDRV人工感染麻鴨試驗(yàn)組肛拭子cDNA，312份為健康雛鴨肛拭子cDNA）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組NDRV-SY株感染鴨從第2 d（48 h）開始排毒，第5 d達(dá)到第1個(gè)排毒高峰，從第9 d起感染鴨排毒量又一次增加，第10 d形成第2個(gè)小高峰，排毒期一直持續(xù)到20 d左右，這可能與NDRV在宿主體內(nèi)的感染與復(fù)制有關(guān)。試驗(yàn)組雛鴨在攻毒后第5 d起開始出現(xiàn)肝臟、脾臟壞死，在攻毒后第7 d肝臟、脾臟病變最為明顯，這與人工感染雛鴨排毒高峰期和變化趨勢(shì)相符合。

因此，本研究基于NDRV P18蛋白基因成功建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法適用于NDRV感染的排毒監(jiān)測(cè)以及臨床感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

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（責(zé)任編輯：張震林）

收稿日期：2021-03-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0500804）;江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水禽）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目[JATS（2020）321]

作者簡(jiǎn)介：沈麗雅（1996-），女，浙江湖州人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病防治研究。（Tel）15205172927;（E-mail）823320658@qq.com

通訊作者：張小飛，（E-mail）xiaofei0804@sina.com;姜平，（E-mail） jiangp@ njau.edu.cn