基于PARMS技術(shù)的綠豆抗葉斑病基因VrTAF5分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

李靈慧，吳然然，陳景斌，崔曉艷，袁星星，朱月林，陳新

摘要：葉斑病是綠豆生產(chǎn)上主要的真菌性病害，利用抗性品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑。為篩選抗病資源，根據(jù)抗性基因VrTAF5的突變位點(diǎn)，利用五引物擴(kuò)增受阻突變體系（Penta-primer amplification refractory mutation system，PARMS）開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記。并利用抗病性具有差異的164份綠豆資源對(duì)所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的可靠性進(jìn)行檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，VrTAF5-1517分子標(biāo)記在7個(gè)分子標(biāo)記中的檢出率最高，基因分型為AA、AC、CC，可以有效區(qū)分基因堿基序列的SNP差異。根據(jù)葉斑病抗性評(píng)價(jià)結(jié)果，該標(biāo)記對(duì)抗病材料的選擇效率為75.00%、感病材料的選擇效率為93.42%。VrTAF5-1517分子標(biāo)記對(duì)抗病資源中檢出抗病基因型的比例、對(duì)高感和感病資源中檢出感病基因型比例均為100%，說(shuō)明本研究開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記可用于綠豆抗葉斑病分子標(biāo)記輔助育種。

關(guān)鍵詞：綠豆;葉斑病;VrTAF5基因;SNP分子標(biāo)記;PARMS技術(shù)

中圖分類號(hào)：S522.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2021）06-1386-07

Development of molecular markers of mung bean leaf spot disease resistance gene VrTAF5 based on PARMS technology

LI Ling-hui1，2，WU Ran-ran2，CHEN Jing-bin2，CUI Xiao-yan2，YUAN Xing-xing2，ZHU Yue-lin1，CHEN Xin2

（1.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;2.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Cercospora leaf spot （CLS） disease is the main fungal disease in mung bean production. Using resistant varieties is the most economical， safest and effective way to control CLS disease. For selection of disease-resistant resources， molecular markers were developed based on the mutation sites of the resistance gene VrTAF5 by penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS） technology. In addition， 164 mung bean resources with different disease resistance were used to test and evaluate the reliability of the developed molecular markers. The results showed that the detection rate of VrTAF5-1517 was the highest among the seven molecular markers， and the genotypes were AA， AC and CC. Moreover， SNP differences in gene base sequences could be effectively distonguished. According to the evaluation of leaf spot resistance， the selection efficiency of VrTAF5-1517 for resistant and susceptible accessions was 75% and 93.42%， respectively. The proportions of resistant genotypes detected in resistant resources and susceptoble genotypes detected in highly susceptible and susceptible resources by VrTAF5-1517 were 100%， suggestingt that the molecular markers developed in this study could be used in molecular marker-assisted breeding for resistance to CLS disease of mung bean.

Key words：mung bean;Cercospora leaf spot disease;VrTAF5 gene;SNP molecular marker;PARMS technology

葉斑病是中國(guó)綠豆生產(chǎn)上的主要真菌性病害，其病原菌為變灰尾孢菌（Cercosporacanescens Ell.etMartin），為害植株的葉片，以開(kāi)花結(jié)莢期為害嚴(yán)重，可導(dǎo)致葉片早落、豆莢數(shù)目減少及種子變小[1-3]。該病害在高溫高濕環(huán)境下發(fā)生與傳播迅速，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，綠豆減產(chǎn)可超過(guò)50%[4]。

葉斑病抗性品種能夠有效減輕病害的發(fā)生[5]，但抗病育種的效率受到抗病種質(zhì)資源較少的制約。Hartman等對(duì)近4 000份綠豆資源進(jìn)行抗病性鑒定，得到的抗葉斑病資源不足4%[6]，李怡琳和李淑英對(duì)200份綠豆資源進(jìn)行田間抗病性鑒定，表現(xiàn)抗性的資源僅占6%[7]。由于綠豆葉斑病的抗病性鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，田間鑒定還易受到環(huán)境的影響，因此相較于表型鑒定，分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)勢(shì)。

抗性基因的發(fā)掘?yàn)榉肿訕?biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。南海洋等通過(guò)大豆胞囊線蟲病抗性候選基因rhg1開(kāi)發(fā)InDel標(biāo)記，對(duì)抗病資源與感病資源的選擇效率分別為88.2%和100.0%[8]。在綠豆葉斑病抗性基因的研究中，Chankaew等利用抗病品種V4718與感病品種KPS1雜交，在所得的F2與BC1F1群體中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)主效QTL——qCLS，可以解釋65.5%-80.5%的抗病表型變異[9]。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，Yundaeng等通過(guò)F2群體與BC8F2群體將該QTL精細(xì)定位到綠豆6號(hào)染色體上，候選基因VrTAF5[編碼TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子5（TAF5），注釋基因ID為L(zhǎng)OC106765332]，是轉(zhuǎn)錄起始因子IID（Transcription initiation factor IID， TFIID）和Spt-Ada-Gcn5乙酰轉(zhuǎn)移酶（SAGA）復(fù)合物的亞基[10]。通過(guò)抗病親本V4718與感病親本KPS1的VrTAF5基因堿基序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這兩份材料在外顯子區(qū)域存在7個(gè)單核苷酸的突變[10]。五引物擴(kuò)增受阻突變體系（Penta-primer amplification refractory mutation system，PARMS）是一種新型SNP分型技術(shù)，屬于第三代分子標(biāo)記[11]，具有準(zhǔn)確性高、成本低廉、高通量等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[12-13]。

目前，將PARMS技術(shù)應(yīng)用于綠豆抗葉斑病資源篩選的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，基于定位親本V4718和KPS1在VrTAF5基因外顯子上7個(gè)單核苷酸的差異，利用PARMS技術(shù)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，并對(duì)164份綠豆種質(zhì)資源進(jìn)行抗性檢測(cè)，以期為綠豆抗葉斑病分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的綠豆[Vigna radiata （L.）Wilczek]資源共164份，均來(lái)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，其中V4718與KPS1分別作為抗病對(duì)照和感病對(duì)照。接種所用的變灰尾孢菌為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存。

1.2接種方法及抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

接種于2020年6月至10月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院光溫可控的溫室進(jìn)行，采用菌絲塊微傷法接種復(fù)葉期綠豆植株，接種后保濕36 h，之后于溫度25 ℃、濕度60%的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，接種15 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。每份綠豆資源3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6株，抗感評(píng)價(jià)方法參考劉振興等的方法[14]。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：葉片上無(wú)病斑;1級(jí)：葉片上僅有小點(diǎn)狀病斑，病斑面積占葉面積不足2%;3級(jí)：病斑直徑1.0～2.0 mm，無(wú)褪綠暈圈，病斑面積占葉面積2%～25%;5級(jí)：病斑較大，直徑2.1～5.0 mm，有褪綠暈圈，病斑面積占葉面積26%～50%;7級(jí)：病斑直徑5.1 mm以上，病斑面積占葉面積51%～75%;9級(jí)：病斑相連成片，病斑面積占葉面積76%以上，嚴(yán)重落葉。根據(jù)病情指數(shù)劃分抗病等級(jí)：高抗（HR）：病情指數(shù)0～2.0;抗病（R）：病情指數(shù)2.1～20.0;中抗（MR）：病情指數(shù)20.1～40.0;中感（MS）：病情指數(shù)40.1～60.0;感?。⊿）：病情指數(shù)60.1～80.0;高感（HS）：病情指數(shù)80.1～100.0。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值）×100

1.3綠豆DNA的提取

采用改良的CTAB法提取164份綠豆資源的DNA，利用KAIAO超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PARMS引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)

利用Primer 5.0軟件根據(jù)7個(gè)SNP位點(diǎn)的側(cè)翼序列信息設(shè)計(jì)PARMS引物，采用高通量SNP檢測(cè)平臺(tái)GeneMatrix進(jìn)行樣品檢測(cè)，兩次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為10.00 μl：5.00 μl 2×PARMSmaster mix，Allele X primer（10 μmol/L）與Allele Y primer（10 μmol/L）各0.15 μl，0.40 μl Common primer（10 μmol/L），1.00 μl模板DNA（50 ng/μl），3.30 μl ddH2O。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94 ℃熱激活15 min，94 ℃變性20 s，57～65 ℃退火和延伸1 min，10個(gè)循環(huán);94 ℃變性20 s，57 ℃退火和延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。使用TECAN infinite M1000酶標(biāo)儀讀取熒光信號(hào)，在軟件Snpdecoder（http：//www.snpway.com/snpdecoder/）中解析轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，得到清晰直觀的分型圖，并根據(jù)顏色不同，輸出基因型結(jié)果。

1.5PARMS標(biāo)記的驗(yàn)證

選擇4份綠豆材料對(duì)PARMS分型結(jié)果進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增體系為50 μl：25 μl 2×Phanta Max Buffer， 1 μl dNTP Mix ，正、反向引物各2 μl， 1 μl模板DNA ， 1 μl Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase ， 18 μl ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，56～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃終延伸5 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，送至上海生工生物工程有限公司南京部測(cè)序（測(cè)序引物參照參考文獻(xiàn)[10]）。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制表作圖，采用SPSS 22.0進(jìn)行聚類分析與方差分析，Chromas2輸出測(cè)序峰圖，BioXM 2.6進(jìn)行序列拼接與比對(duì)。

2結(jié)果與分析

2.1VrTAF5分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

通過(guò)抗病對(duì)照V4718和感病對(duì)照KPS1中VrTAF5基因堿基序列比對(duì)，對(duì)得到的7個(gè)SNP及側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了7組PARMS引物（表1）。每組引物包含2條攜帶不同熒光信號(hào)的等位基因特異引物，1條通用反向引物?？共?duì)照V4718與感病對(duì)照KPS1均可被7個(gè)標(biāo)記明確區(qū)分，表明標(biāo)記開(kāi)發(fā)成功。

2.2VrTAF5分子標(biāo)記的通用性

為驗(yàn)證分子標(biāo)記的通用性與準(zhǔn)確性，將開(kāi)發(fā)的標(biāo)記對(duì)164份綠豆資源進(jìn)行基因分型，并通過(guò)測(cè)序方法驗(yàn)證其可靠性。表2結(jié)果顯示，在供試綠豆資源中7個(gè)分子標(biāo)記均能有效區(qū)分對(duì)應(yīng)的SNP差異。VrTAF5-1517分型結(jié)果：10份綠豆資源為抗病基因型，2份為雜合基因型，152份為感病基因型;VrTAF5-10228分型結(jié)果：10份綠豆資源為抗病基因型，1份為雜合基因型，153份為感病基因型;VrTAF5-9884分型結(jié)果：152份感病基因型，1份雜合基因型，11份抗病基因型。VrTAF5-9548與VrTAF5-10010的分型結(jié)果：11份為抗病基因型，151份為感病基因型，2份雜合基因型。而在VrTAF5-1739和VrTAF5-4932分型結(jié)果中，只有抗性對(duì)照V4718顯示出與其他資源不同的基因分型，結(jié)合抗感情況，這兩個(gè)標(biāo)記的分型效率極低。同時(shí)取10份綠豆材料測(cè)序驗(yàn)證VrTAF5-1517分子標(biāo)記的特異性及準(zhǔn)確性，取4份材料測(cè)序驗(yàn)證剩余6個(gè)分子標(biāo)記，測(cè)序結(jié)果與分型結(jié)果完全吻合，說(shuō)明7個(gè)分子標(biāo)記的分型結(jié)果可靠。以VrTAF5-1517和VrTAF5-10228分子標(biāo)記為例，基因分型圖與部分品種的測(cè)序峰圖見(jiàn)圖1。

2.3VrTAF5分子標(biāo)記評(píng)價(jià)

根據(jù)7個(gè)分子標(biāo)記基因分型結(jié)果與抗病性鑒定結(jié)果的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)VrTAF5-1517分子標(biāo)記最佳，可以作為葉斑病抗性資源的篩選分子標(biāo)記。VrTAF5-10228分子標(biāo)記次之，可作為VrTAF5-1517分子標(biāo)記的補(bǔ)充。具體結(jié)果如表3所示，VrTAF5-1517對(duì)抗病材料的選擇效率為75.00%，對(duì)感病材料的選擇效率為93.42%，感病基因型與剩余基因型（雜合及抗?。┰诓∏橹笖?shù)上存在極顯著差異（F=37.928，P<0.01）。從不同抗性群體的基因分型來(lái)看，抗病、中抗綠豆資源中抗病基因型的比例分別為100.00%、37.50%，高感、感病、中感綠豆資源中感病基因型比例分別為100.00%、100.00%、94.64%。VrTAF5-10228對(duì)抗病材料的選擇效率為72.73%，對(duì)感病材料的選擇效率為92.81%。以VrTAF5-1517和VrTAF5-10228分子標(biāo)記為例，它們能夠準(zhǔn)確對(duì)綠豆抗病材料（R）與高感材料（HS）進(jìn)行分型（圖2）。

在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，Yundaeng等發(fā)現(xiàn)在定位群體（F2群體與BC8F2群體）內(nèi)VrTAF5_InDel標(biāo)記（F：5′-CTCATGAAACCTGGAGAACT-3′，R：5′-CCCAGTGTACTCAGTTTGACTT-3′）與葉斑病抗性完全連鎖[10]。在本研究中的供試材料中選取48份綠豆資源，利用VrTAF5_InDel標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示VrTAF5_InDel分子標(biāo)記與VrTAF5-1517、VrTAF5-10228分子標(biāo)記得到的結(jié)果完全一致（表4、圖3），進(jìn)一步驗(yàn)證了所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

3討論

綠豆葉斑病的主要致病菌為尾孢菌屬的變灰尾孢菌[3]，感染的最佳溫度為25～30 ℃[15]。同時(shí)由于變灰尾孢菌為死體營(yíng)養(yǎng)型[16]，需要穿過(guò)葉片表皮的物理屏障才可以引發(fā)葉斑病。故本研究中在人工接種前，利用無(wú)菌牙簽對(duì)葉片的表皮造成微傷口，有效規(guī)避了由于不同綠豆資源的表皮硬度差異引起的表型鑒定偏差，適用于抗病綠豆資源的篩選[17]。

分子標(biāo)記技術(shù)不僅在基因定位方面有著重要作用，同時(shí)可以作為優(yōu)良品種的選育工具[18-20]。如魏廣輝等在小麥富硒基因QTL定位基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出AX-1標(biāo)記，該標(biāo)記顯示高硒基因型在高硒材料中占比81% [21];卿冬進(jìn)等開(kāi)發(fā)出水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記顯示的1份抗病基因型材料表現(xiàn)為抗病，47份感病基因型材料中有36份表現(xiàn)為感病[22]。王文輝等開(kāi)發(fā)出1個(gè)SSR標(biāo)記Satt309，與抗大豆胞囊線蟲病的主效基因rhg1緊密連鎖，該分子標(biāo)記對(duì)抗病材料的鑒定效率達(dá)72.5%[23]。PARMS技術(shù)為新型的SNP分型技術(shù)[24]，被廣泛應(yīng)用在油菜[25]、小麥[26]、水稻[27]等研究中，在綠豆中應(yīng)用此技術(shù)的研究鮮有報(bào)道。且綠豆葉斑病抗性基因研究難度較大，在很大程度上限制了抗綠豆葉斑病優(yōu)良品種的選育。本研究開(kāi)發(fā)的VrTAF5-1517分子標(biāo)記為綠豆葉斑病抗性相關(guān)的高通量分子標(biāo)記，從操作便捷程度和經(jīng)濟(jì)成本上均優(yōu)于傳統(tǒng)分子標(biāo)記。在實(shí)際應(yīng)用中，可以利用該標(biāo)記先篩選出抗病基因型材料，再結(jié)合抗病性鑒定篩選出葉斑病抗性資源，可有效減少抗病性鑒定的工作量。值得注意的是VrTAF5-1517分型結(jié)果，152份感病基因型的綠豆種質(zhì)資源中，有10份綠豆資源表現(xiàn)為抗葉斑病，暗示了綠豆葉斑病的抗性機(jī)制非常復(fù)雜，可能存在其他抗病途徑。因此，在后續(xù)研究工作中仍需進(jìn)一步挖掘綠豆抗葉斑病的其他基因。

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（責(zé)任編輯：蔣永忠）

收稿日期：2020-03-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1001301、2019YFD1001300）;國(guó)家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物防治與綜合防控崗位科學(xué)家項(xiàng)目（CARS-08-G15）;江蘇特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心項(xiàng)目[JATS（2019）399];江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：李靈慧（1995-），男，山東德州人，碩士研究生，從事植物分子育種研究。（E-mail）2582355776@qq.com

通訊作者：朱月林，（E-mail）ylzhu@njau.edu.cn;陳新，（E-mail）cx@jaas.ac.cn