長鏈非編碼RNA 母系表達基因3調控miR-34a對糖尿病視網膜病變Müller細胞活化及炎癥因子分泌的影響△

王坤 朱曼輝 陳莉莉 涂園園 萬光明 梁申芝

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是工作年齡人群致盲的主要原因[1]。雖然DR的確切發(fā)病機制尚未完全清楚，但研究表明糖尿病患者視網膜的多種異常均與炎癥密切相關，應激性視網膜細胞產生的多種細胞因子失調是導致神經血管損傷的關鍵因素[2-3]，如血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素-1β(IL-1β)等。其中，Müller細胞源性VEGF是導致DR視網膜炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關鍵因素[4]。盡管抗VEGF治療具有顯著的療效，但依然存在許多局限性，如需要眼內反復注射，只對疾病晚期有效，更重要的是僅有約一半的患者對治療有應答[5]。因此，深入探索DR發(fā)生發(fā)展的機制對于其預防及治療具有重要的意義。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類轉錄本長度大于200 nt,缺乏蛋白質編碼潛能的非編碼RNA。隨著對LncRNA研究的深入，其在DR中的作用已受到廣泛關注[6]。有研究顯示,母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在DR患者血漿及小鼠視網膜中表達降低，沉默MEG3促進視網膜內皮細胞增殖、遷移及管腔形成[7-8]，MEG3過表達抑制大鼠視網膜中IL-1β的產生[9]。但是，有關MEG3在DR的Müller細胞中的作用及機制的報道尚少，本研究旨在通過構建的DR小鼠體內模型及高糖刺激視網膜Müller細胞株(MIO-M1)的體外模型，探討MEG3在DR的Müller細胞活化及炎癥因子分泌中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料8周齡健康雄性C57BL/6小鼠30只，體質量20～22 g，購自蘇州大學實驗動物中心；視網膜Müller干細胞MIO-M1(北納生物，中國)；DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco，美國)；GFAP、VEGF、IL-1β、ELISA試劑盒、辣根過氧化物酶標記的二抗(Abcam，美國)；GAPDH單克隆抗體(Proteintech，美國)；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)；MEG3過表達質粒、miR-34a mimic及其陰性對照(RiboBio，廣州)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)；電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(Bio-Rad，美國)；萊卡激光共聚焦顯微鏡(SP8，德國)；冰凍切片機(SLEE，德國)；7500實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)；酶標儀(Gene limited，中國香港)。

1.2 方法

1.2.1 DR小鼠模型制作C57BL/6小鼠共30只飼養(yǎng)于蘇州大學SPF級實驗動物中心。適應性喂養(yǎng)5 d后，使用隨機數(shù)字表法將其隨機分為兩組，分別為正常對照組和DR組，每組各15只。正常對照組小鼠未做處理，DR組小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)8周，再以60 mg·kg-1STZ(美國Sigma公司)連續(xù)腹腔注射5 d構建糖尿病模型。當血糖>16.7 mmol·L-1且出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀時為造模成功。8周時取各組小鼠雙眼眼球及視網膜進行檢測。首先通過50 g·L-1戊巴比妥鈉(0.01 L·kg-1)腹腔注射麻醉小鼠，其中5只小鼠眼球置于固定液中用于免疫熒光化學檢測。剩余10只小鼠眼球置于培養(yǎng)基中，于手術顯微鏡下沿眼球角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體及外層鞏膜-脈絡膜復合體，取得視網膜，用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.2 細胞培養(yǎng)視網膜Müller干細胞MIO-M1培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的完全培養(yǎng)基中。將細胞置于37 ℃含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中。2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 細胞轉染與處理分別使用5 mmol·L-1(對照組)及30 mmol·L-1(高糖組)葡萄糖刺激MIO-M1細胞24 h用于構建DR體外模型。取對數(shù)生長期的MIO-M1細胞接種于6孔板，每孔約2×105個細胞，當細胞融合達60%～80%時，使用Lipofectamine 2000轉染MEG3過表達質粒、miR-34a mimic及其陰性對照(NC mimic)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后qRT-PCR檢測其轉染效率。轉染成功后加入含30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)轉染物的不同將實驗分為：pcDNA組、pcDNA-MEG3組、pcDNA+NC mimic組、pcDNA+miR-34a mimic組、pcDNA-MEG3+NC mimic組、pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組。取細胞培養(yǎng)上清置于-80 ℃用于酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測IL-1β及VEGF蛋白表達。

1.2.4 免疫熒光化學染色快速取出小鼠眼球進行固定，然后分別在100 g·L-1、200 g·L-1和300 g·L-1的蔗糖溶液中脫水過夜。使用冷凍切片機將眼球切成10 μm的薄片，用于免疫熒光化學染色。

對于MIO-M1細胞，將細胞接種在24孔細胞玻片上，并在室溫下使用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min。隨后2 g·L-1Triton X-100室溫通透5 min；體積分數(shù)5%BSA室溫封閉30 min；加GFAP一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育30 min；DAPI復染后激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 Western blot檢測各組小鼠視網膜及細胞中GFAP及VEGF蛋白的表達使用組織及細胞裂解液提取小鼠視網膜組織及MIO-M1細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取蛋白質80 μg經過100 g·L-1丙烯酰胺凝膠電泳后使用半干法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GFAP及VEGF一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育1 h。最后化學發(fā)光法顯色，拍照，檢測GFAP及VEGF蛋白表達，GAPDH作為內參。

1.2.6 ELISA檢測各組小鼠視網膜及細胞上清中VEGF及IL-1β蛋白的表達將小鼠處死后分離視網膜，勻漿、離心吸取的上清和MIO-M1培養(yǎng)基上清各100 μL加入各孔中，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作。測量各樣本在450 nm波長下的光密度(D)值，獲得上清中VEGF及IL-1β蛋白的表達量。

1.2.7 qRT-PCR檢測各組小鼠視網膜及細胞中MEG3 mRNA及miR-34a的表達為進一步驗證MEG3是否通過下調miR-34a 抑制DR Müller細胞活化及炎癥因子的產生，我們將miR-34a mimic及MEG3過表達質粒pcDNA-MEG3分別或同時轉染進Müller細胞中，隨后高糖刺激24 h。Trizol法提取小鼠視網膜組織及MIO-M1細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。加入MEG3及miR-34a特異性引物，PCR反應條件設置為尿嘧啶DNA糖基酶激活50 ℃ 2 min,預變性95 ℃ 2 min,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 1 min,4 ℃終止反應。每個樣本設置三個復孔，使用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。GAPDH作為內參基因。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 DR小鼠視網膜的改變及MEG3 mRNA的表達情況免疫熒光化學染色(圖1)及Western blot檢

圖1 免疫熒光化學染色檢測各組小鼠視網膜GFAP表達情況

測(圖2A-2B)結果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網膜中GFAP蛋白表達升高(P<0.01)。ELISA檢測(圖2C-2D)結果顯示，DR組小鼠視網膜VEGF及IL-1β蛋白的表達均增多，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.001)。qRT-PCR檢測小鼠視網膜中MEG3 mRNA表達(圖2E)結果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網膜中MEG3 mRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 各組小鼠視網膜GFAP、VEGF、IL-1β蛋白及MEG3 mRNA的表達情況 A、B:Western blot 檢測小鼠視網膜中GFAP及VEGF蛋白表達；與正常對照組比較，**P<0.01。C、D:ELISA檢測小鼠視網膜VEGF 及IL-1β蛋白表達；與正常對照組比較，***P<0.001。E:qRT-PCR檢測小鼠視網膜MEG3 mRNA水平；與正常對照組比較，**P<0.01。

2.2 MEG3對Müller細胞活化及炎癥因子產生的影響使用高糖刺激Müller細胞構建DR體外模型檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組Müller細胞中GFAP、VEGF、IL-1β蛋白表達均升高，MEG3 mRNA表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，與體內模型檢測結果一致。而與高糖組和高糖+pcDNA組比較，高糖+pcDNA-MEG3組可顯著增加MEG3 mRNA表達,并抑制高糖誘導的Müller細胞中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達的升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖3-圖4)。

圖3 免疫熒光化學染色檢測Müller細胞中GFAP表達

圖4 MEG3對Müller細胞活化及炎癥因子產生的影響 A:qRT-PCR檢測MEG3 mRNA水平，與對照組比較,**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05。B、C:Western blot檢測Müller細胞中GFAP及VEGF蛋白表達；與對照組比較，**P<0.01;與高糖組比較，#P<0.05。D、E:ELISA檢測VEGF蛋白及IL-1β蛋白表達；與對照組比較，***P<0.001；與高糖組比較,##P<0.01。

2.3 MEG3調控miR-34a對Müller細胞活化及炎癥因子產生的影響與pcDNA+NC mimic組比較，pcDNA+miR-34a mimic組GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達均增加，而其在pcDNA-MEG3+NC mimic組中表達均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見圖5)。

圖5 MEG3調控miR-34a對Müller細胞活化及炎癥因子產生的影響 A、B:Western blot 檢測Müller細胞中GFAP及VEGF蛋白表達；與pcDNA + NC mimic組比較，*P<0.05；與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，#P<0.05。C、D:ELISA檢測VEGF蛋白及IL-1β蛋白表達；與pcDNA + NC mimic組比較，*P<0.05,**P<0.01；與pcDNA-MEG3+NC mimic組比較，#P<0.05。A組：pcDNA+NC mimic組；B組：pcDNA+miR-34a mimic組；C組：pcDNA-MEG3+NC mimic組；D組：pcDNA-MEG3+miR-34a mimic組。

2.4 MEG3對miR-34a的調控作用qRT-PCR檢測小鼠視網膜及Müller細胞中miR-34a的表達，結果顯示，與正常對照組比較，DR組小鼠視網膜中miR-34a mRNA表達升高(圖6A)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與體內實驗結果一致，體外實驗結果顯示，與對照組Müller細胞比較，高糖組Müller細胞中miR-34a mRNA表達亦升高(圖6B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉染MEG3過表達質粒后，與pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組中miR-34a mRNA表達降低(圖6C)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 MEG3對miR-34a的調控作用 A:qRT-PCR檢測小鼠視網膜中miR-34a水平；與正常對照組比較,**P<0.01。B:qRT-PCR檢測Müller細胞中miR-34a水平；與對照組比較，**P<0.01。C:正常條件下轉染MEG3過表達質粒后24 h,qRT-PCR檢測Müller細胞中miR-34a水平；與pcDNA組比較，**P<0.01。

3 討論

DR是糖尿病引起的最嚴重的眼部并發(fā)癥之一。DR早期一般無癥狀，但當患者開始出現(xiàn)視力障礙時，視網膜病變已發(fā)展到幾乎不可逆轉的程度[10]。DR主要的病理特點是微血管病變，但在微血管發(fā)生改變之前，即出現(xiàn)視網膜神經元及膠質細胞病變[11-12]。Müller細胞為神經視網膜中主要的膠質細胞，其功能障礙被認為是DR發(fā)生發(fā)展的關鍵因素[13]。

Müller細胞是視網膜中主要的膠質細胞。它是跨越整個視網膜的唯一細胞，并且與視網膜血管和神經元都緊密接觸[14]。在DR早期，Müller細胞即被激活并分泌多種細胞因子，參與視網膜細胞的免疫和炎癥反應[13,15]。Müller細胞被激活最明顯的標志之一是GFAP的表達增加[16]。GFAP是反應性膠質增生的常見標志物，正常條件下Müller細胞幾乎不表達GFAP[17]。本研究中，DR小鼠視網膜中GFAP表達升高，表明Müller細胞被激活。Bai等[4]通過條件性敲除小鼠Müller細胞中VEGF，發(fā)現(xiàn)阻斷Müller細胞源性VEGF可以顯著抑制缺血誘導的視網膜新生血管和血管滲漏，并減少缺血誘導的血-視網膜屏障破壞。提示Müller細胞源性的VEGF是導致DR視網膜炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關鍵因素。本研究中，通過免疫熒光化學染色及Western blot檢測,我們發(fā)現(xiàn)DR小鼠視網膜及高糖刺激的Müller細胞中，VEGF蛋白表達均升高，與以往研究結果一致。此外，炎癥因子IL-1β的分泌亦增多。通過過表達MEG3抑制了Müller細胞的激活及VEGF和IL-1β的產生。提示DR早期Müller細胞處于激活狀態(tài)，抑制Müller細胞的活化可能成為DR的重要治療策略。

近年來，大量證據(jù)表明MEG3在DR中發(fā)揮重要作用[7-9]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者及糖尿病非DR患者血清中MEG3較正常對照組表達下降，IL-1β及轉化生長因子-β1表達升高。提高視網膜色素上皮(RPE)細胞中MEG3的表達水平，減少了高糖刺激引起的IL-1β和轉化生長因子-β1的升高。DR大鼠中，MEG3通過抑制插頭樣轉錄因子O1及IL-1β改善糖尿病大鼠視網膜病變[9]。沉默MEG3加重了糖尿病引起的體內微血管功能障礙，并在體外促進了內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成功能[8]。但MEG3在視網膜Müller細胞中的作用報道尚少。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖處理的Müller細胞中MEG3 mRNA表達下降，過表達MEG3 mRNA減少Müller細胞的活化及VEGF、IL-1β的釋放，過表達MEG3 mRNA或許可以作為DR的潛在治療靶點，抑制DR的發(fā)生發(fā)展。

LncRNA能夠識別microRNA (miRNA)的互補序列，并與其靶向結合。miRNA是一類普遍存在于生物體基因組中的由內源基因編碼的單鏈非編碼RNA分子，長度約為22個核苷酸。隨著對miRNA研究的深入，有證據(jù)表明miRNA在DR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。miR-34a在高糖刺激的RPE細胞中表達升高，沉默miR-34a可抑制高糖導致的RPE細胞活力降低及凋亡增加[19]。本研究中，DR小鼠視網膜及高糖處理的Müller細胞中miR-34a表達均升高，過表達miR-34a促進了高糖誘導的Müller細胞中GFAP及VEGF、IL-1β蛋白的表達。Huang等[20]證實，MEG3充當miR-34a的競爭內源性RNA，并以Argonaute 2依賴性方式相互抑制。高糖處理的RPE細胞中，MEG3通過抑制miR-34a，抑制RPE細胞的炎癥與凋亡[19]。但有關Müller細胞中兩者的靶向關系報道尚少。本研究結果發(fā)現(xiàn)，MEG3 mRNA在DR小鼠視網膜及高糖刺激的Müller細胞中表達均降低，且過表達MEG3 mRNA后miR-34a表達降低，提示MEG3對miR-34a具有調節(jié)作用。

為進一步驗證MEG3是否通過下調miR-34a抑制DR中Müller細胞活化及炎癥因子的產生，我們將miR-34a mimic及MEG3過表達質粒pcDNA-MEG3分別或同時轉染進Müller細胞中。結果顯示,pcDNA-MEG3組GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達均減少。相反，miR-34a mimic組轉染后細胞內GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表達均增多。共轉染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic 后，GFAP的表達及炎癥因子的分泌較單獨過表達MEG3組增多。提示MEG3 通過下調miR-34a 抑制DR中Müller細胞活化及炎癥因子的產生。

綜上所述，本研究結果表明，MEG3 mRNA在DR小鼠視網膜及高糖刺激的Müller細胞中表達均下降，MEG3過表達可抑制Müller細胞的活化及VEGF、IL-1β的釋放，其機制與調控miR-34a有關。本研究對MEG3在視網膜Müller細胞中的生物學功能所做的基礎性研究，將為DR發(fā)病機制的闡明及新治療手段的開發(fā)提供一定的理論基礎。