尾靜脈注射碘酸鈉對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響△

牛占宇 李建德 石永鵬 陳臨池 楊鵬飛 田換兵 高嵐

老年性黃斑病變(SMD)是世界范圍內(nèi)60歲以上老年人致盲的首要原因，明確SMD的發(fā)病過程和病理機制是進行有效治療的關(guān)鍵。碘酸鈉(NaIO3)是一種可以對視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞造成選擇性損傷的穩(wěn)定氧化劑[1]，在多種哺乳動物中能誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生視網(wǎng)膜毒性，包括猴、綿羊、豬、兔、大鼠、小鼠[2-3]。由于NaIO3誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性過程與非滲出性SMD患者病變過程相似，因此NaIO3誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性常作為非滲出性SMD的動物模型[4-5]。盡管已有不少基于小鼠SMD模型的研究，但是對于NaIO3誘導(dǎo)的小鼠SMD模型視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)隨時間變化的研究較少。因此，本研究旨在于評估尾靜脈單劑量注射NaIO3(35 mg·kg-1)后不同時間小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷程度，以期為NaIO3誘導(dǎo)SMD動物模型的研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組選取6～8周齡健康昆明小鼠36只，體質(zhì)量25～30 g，雌性(蘭州大學(xué)實驗動物中心提供)，飼養(yǎng)于符合醫(yī)學(xué)實驗動物要求的環(huán)境中。將小鼠分為對照組、損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組，每組9只小鼠，3只用于石蠟切片，3只用于冰凍切片，3只用于視網(wǎng)膜鋪片。對照組不作任何處理，各損傷組小鼠經(jīng)尾靜脈單劑量注射NaIO3，分別于損傷后3 d、7 d、14 d取材。實驗過程中無小鼠死亡，所有動物實驗均符合醫(yī)學(xué)動物實驗倫理規(guī)定。

1.1.2 主要儀器與試劑石蠟切片機、冰凍切片機(德國Leaca公司)，烤片機(天津天利航空機電有限公司)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，體式顯微鏡(德國Zeiss公司)。NeuN抗兔多克隆抗體、Opn1mw抗兔多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，GFAP抗兔多克隆抗體(武漢博士德生物公司)，Iba1抗兔多克隆抗體(英國Abcom公司)，594標(biāo)記的山羊抗兔二抗、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAPI染色液、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，NaIO3(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立稱取0.07 g NaIO3溶于PBS中，配制成終濃度為70 g·L-1溶液。按5 μL·g-1(35 mg·kg-1)體質(zhì)量尾靜脈單劑量注射到小鼠體內(nèi)，建立視網(wǎng)膜變性模型。將處理后的小鼠在干凈、安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 取材分別于NaIO3注射后3 d、7 d、14 d取材，將小鼠用50 g·L-1水合氯醛深度麻醉，四肢伸直、腹部朝上固定于解剖盤，剪開胸腔暴露心臟，剪破右心耳，注射器吸取20 mL PBS從左心室進針沖洗血液，隨后立即從同一位置注入40 g·L-1多聚甲醛20 mL，待小鼠全身僵硬后即完成心臟灌注。小心摘取雙側(cè)眼球，PBS中清洗后置于40 g·L-1多聚甲醛中于4 ℃固定24 h。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織切片行HE染色將固定24 h的眼球在PBS中室溫浸洗30 min，行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋過夜，做厚6 μm石蠟切片，40 ℃烤片機烘烤6 h，進行HE染色，中性樹膠封片。每組隨機選取6張切片，400倍光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理，統(tǒng)計視網(wǎng)膜組織每10 μm長度外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)中細胞數(shù)。

1.2.4 視網(wǎng)膜組織切片NeuN免疫組織化學(xué)染色將固定24 h的眼球在PBS中室溫浸洗30 min，行梯度蔗糖脫水，300 g·L-1蔗糖4 ℃脫水過夜，OCT包埋，做厚10 μm冰凍切片，室溫自然干燥后于-20 ℃保存。將凍存的組織切片取出，室溫復(fù)溫30 min，按兔SP試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。每組隨機選取6張切片，400倍光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理，統(tǒng)計視網(wǎng)膜組織每100 μm長度視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)數(shù)。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織鋪片GFAP免疫熒光染色將固定過夜的眼球于體式顯微鏡下小心剝離視網(wǎng)膜組織，于96孔板中PBS浸洗30 min；體積分數(shù)0.3% Trition X-100通透30 min；體積分數(shù)10%山羊血清封閉1 h；加一抗(GFAP)4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min;加二抗室溫避光孵育1 h，將視網(wǎng)膜組織置載玻片上，神經(jīng)纖維層朝上平鋪，向中心處剪4～5個切口，后用甘油PBS封片。每個視網(wǎng)膜組織在距視盤500 μm處選取3個視野拍照，圖像用Image J軟件處理并統(tǒng)計每200 μm×200 μm范圍內(nèi)被激活的Müller細胞數(shù)。

1.2.6 視網(wǎng)膜組織切片Opn1mw、Iba1免疫熒光染色將凍存的冰凍切片取出，室溫復(fù)溫30 min，體積分數(shù)0.3% Trition X-100通透20 min;體積分數(shù)10%山羊血清封閉40 min;加一抗(Opn1mw、Iba1)4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min;滴加二抗室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光復(fù)染8 min，甘油PBS封片。每組隨機選取3張切片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。圖像用Image J軟件處理，觀察視錐細胞外節(jié)段厚度和小膠質(zhì)細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示，采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗進行組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NaIO3對視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化的影響對照組小鼠視網(wǎng)膜RPE層、光感受器細胞外節(jié)段、ONL、INL、神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰，細胞排列密集；各損傷組中NaIO3注射不同時間后小鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，其中損傷7 d組、損傷14 d組小鼠視網(wǎng)膜ONL、INL厚度變薄，細胞數(shù)顯著減少，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)波浪狀，且與外網(wǎng)狀層(OPL)邊界模糊(圖1)。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400，標(biāo)尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組小鼠視網(wǎng)膜中ONL細胞數(shù)均低于對照組，損傷7 d組、損傷14 d組INL細胞數(shù)均低于對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組視網(wǎng)膜中ONL、INL、GCL各層細胞數(shù)比較

2.2 NaIO3對RGC數(shù)的影響NeuN作為神經(jīng)元標(biāo)記物，在本實驗中用來標(biāo)記GCL中的RGC。與對照組相比，損傷3 d組和損傷7 d組GCL中RGC數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，損傷14 d組小鼠每100 μm長度GCL中RGC數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1和圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜NeuN染色結(jié)果(×400，標(biāo)尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

2.3 NaIO3對Müller細胞活化的影響GFAP的表達在視網(wǎng)膜中可作為檢測Müller細胞活化的指標(biāo)，故在本實驗中用GFAP抗體來標(biāo)記Müller細胞。與對照組相比，NaIO3損傷組中每200 μm×200 μm 范圍內(nèi)Müller細胞激活數(shù)量均有所增加(圖3)。損傷3 d組、損傷7 d組、損傷14 d組Müller細胞激活數(shù)量由對照組的(16.96±0.85)個分別增加至(20.42±1.64)個、(24.73±1.91)個、(30.04±3.76)個，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP免疫熒光染色結(jié)果(×200，標(biāo)尺為50 μm) A：對照組；B：損傷3 d組；C：損傷7 d組；D：損傷14 d組。

2.4 NaIO3對小鼠視網(wǎng)膜中視錐細胞和小膠質(zhì)細胞的影響本實驗中Opn1mw抗體和Iba1抗體分別特異性標(biāo)記視網(wǎng)膜中視錐細胞外節(jié)段和小膠質(zhì)細胞。對照組小鼠視網(wǎng)膜中視錐細胞外節(jié)段整齊排列成束狀，經(jīng)NaIO3損傷后隨著損傷時間延長，外節(jié)段排列逐漸紊亂，且外節(jié)段厚度與對照組相比明顯變薄。

對照組中Iba1陽性細胞主要分布于GCL、INL，經(jīng)NaIO3損傷后Iba1陽性細胞分布于整個視網(wǎng)膜，數(shù)量較對照組有所增加，且呈現(xiàn)出一種胞體增大、分支減少的“阿米巴”狀形態(tài)(圖4)。

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜Opn1mw、Iba1染色結(jié)果(×200，標(biāo)尺為50 μm) A、E：對照組；B、F：損傷3 d組；C、G：損傷7 d組；D、H：損傷14 d組。A 、B、C、D為Opn1mw染色結(jié)果；E、F、G、H為Iba1染色結(jié)果。

3 討論

NaIO3作為一種穩(wěn)定的強氧化劑，當(dāng)小鼠體內(nèi)注射劑量最低為20 mg·kg-1時，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)以及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Hmox1表達升高，超氧化物歧化酶(SOD)表達降低[2,6]，并且引起RPE細胞壞死[2,7]，致使脈絡(luò)膜毛細血管萎縮[8]及全視網(wǎng)膜變性[9-10]。NaIO3引起的視網(wǎng)膜變性模型已被多次報道[11-13]，并用于神經(jīng)損傷方面治療的評估[14-15]，高劑量的NaIO3(30～100 mg·kg-1)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性的主要原因是氧化應(yīng)激[2]，在2～12 h 內(nèi)引起RPE細胞發(fā)生碎片化和細胞核丟失[10,16]，隨后對感光細胞外節(jié)段產(chǎn)生影響[9]，但因細胞毒性發(fā)生太快，無法明確識別視網(wǎng)膜損傷的機制[2]。根據(jù)不同的研究目的，NaIO3的給藥方式、濃度和損傷時間也不一致，在本實驗中采取尾靜脈單劑量注射的方式，濃度為35 mg·kg-1[17]，損傷時間梯度為3 d、7 d、14 d，來研究NaIO3對視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NaIO3處理后，小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，與對照組對比，各損傷組中RPE結(jié)構(gòu)被破壞，視網(wǎng)膜光感受器細胞外節(jié)段受損，ONL、INL呈現(xiàn)出波浪狀的結(jié)構(gòu)改變、厚度變薄，并且各層邊界模糊，細胞排列散亂，且這種損傷具有時間依賴性；研究結(jié)果還顯示，NaIO3作用后，ONL、INL每10 μm長度細胞總數(shù)具有顯著的下降趨勢，該結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[2,18]。

視桿細胞和視錐細胞作為視網(wǎng)膜輸入的第一級神經(jīng)元，對視功能具有非常重要的作用。RPE細胞頂部的微絨毛緊密包裹著視桿細胞和視錐細胞的外節(jié)，故注射高劑量NaIO3會引起RPE細胞、視桿細胞和視錐細胞的退化，最終致使ONL和RPE層完全融合[19]。NaIO3在小鼠體內(nèi)所引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)造成光感受器細胞中光傳導(dǎo)基因表達量下降以及光感受器細胞外節(jié)段受損[2,20]。在本研究中，用Opn1mw抗體特異性標(biāo)記視錐細胞外節(jié)段，采用免疫熒光染色技術(shù)即可以觀察視錐細胞外節(jié)段損傷情況。本研究結(jié)果顯示，對照組中由Opn1mw抗體所標(biāo)記的細胞結(jié)構(gòu)呈束狀有規(guī)律排列，結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)NaIO3作用后，隨作用時間延長陽性信號區(qū)域面積逐漸減少、排列混亂且結(jié)合HE染色結(jié)果可知，視錐細胞外節(jié)段長度減少。說明NaIO3能引起視錐細胞結(jié)構(gòu)損傷，且損傷程度具有時間依賴性。

RGC是視網(wǎng)膜中能唯一產(chǎn)生動作電位的神經(jīng)元，其軸突形成視神經(jīng)將視覺信號從視網(wǎng)膜傳到大腦[21]。視網(wǎng)膜在缺氧缺血的情況下所誘發(fā)的氧化應(yīng)激會損傷RGC甚至引起其凋亡[22]。NeuN作為神經(jīng)元標(biāo)記物可用來標(biāo)記視網(wǎng)膜GCL中RGC。本研究采用NeuN免疫組織化學(xué)染色的方式來觀察視網(wǎng)膜中RGC數(shù)的變化，結(jié)果顯示，對照組中GCL細胞排列密集；經(jīng)NaIO3作用后，GCL細胞排列紊亂，其中NaIO3作用14 d 后，RGC數(shù)目減少且與對照組相比有顯著性差異，說明在體內(nèi)環(huán)境下NaIO3會誘發(fā)RGC損傷。

Müller細胞作為視網(wǎng)膜中特有的一種星形膠質(zhì)細胞，在視網(wǎng)膜發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、營養(yǎng)支持等方面發(fā)揮重要作用[23]。視網(wǎng)膜處于病理狀態(tài)時會激活Müller細胞，使其發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)化，激活后的Müller細胞會大量表達GFAP，因此可用GFAP抗體染色來檢測Müller細胞的激活量，從而反映視網(wǎng)膜損傷程度。本研究中，通過視網(wǎng)膜鋪片GFAP免疫熒光染色對Müller細胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化程度進行評估。對視網(wǎng)膜每200 μm × 200 μm 范圍內(nèi)GFAP陽性細胞進行計數(shù)，結(jié)果顯示，與對照組比較，NaIO3作用后單位面積內(nèi)GFAP陽性細胞數(shù)量增加，說明NaIO3能激活Müller細胞。小膠質(zhì)細胞作為腦和視網(wǎng)膜的免疫監(jiān)視器，當(dāng)組織受損后其可通過改變自身形態(tài)轉(zhuǎn)化為吞噬細胞而響應(yīng)組織損傷。利用Iba1可對小膠質(zhì)細胞進行特異性染色，本研究發(fā)現(xiàn)，NaIO3作用后Iba1陽性細胞增多，且細胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)出胞體增大、分支減少的“阿米巴”狀，說明NaIO3作用后能激活小膠質(zhì)細胞。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，小鼠尾靜脈單劑量注射NaIO3會引起小鼠視網(wǎng)膜ONL、INL、GCL的細胞數(shù)減少，同時激活Müller細胞膠質(zhì)化反應(yīng)和小膠質(zhì)細胞，且NaIO3對視網(wǎng)膜的損傷具有時間依賴性。本研究以期為NaIO3誘導(dǎo)SMD動物模型的研究提供更多的實驗數(shù)據(jù)與支持。