熟地黃、枸杞子及其混合提取物對小鼠視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用△

王雪純 張偉 郭雅圖 鞏一博

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)已成為全球第三大常見致盲性眼病，也是發(fā)達(dá)國家老年人不可逆轉(zhuǎn)失明的最常見原因。熟地黃和枸杞子都是我國使用廣泛的中草藥，具有明目的功效，且早已有研究證明兩者均具有抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的特性[1-7]。AMD主要損傷機(jī)制為視網(wǎng)膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]，視網(wǎng)膜光損傷的病理過程與其相似，因此本研究通過建立小鼠光損傷模型模擬AMD視網(wǎng)膜病變[9]，探究熟地黃、枸杞子提取物以及兩種藥物混合提取物對光損傷造成的AMD模型小鼠視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TUNEL法熒光試劑盒(美侖生物技術(shù)有限公司)，熟地黃提取物、枸杞子提取物及二者混合提取物(天津科技大學(xué)提供)，LED燈(深圳市愛圖仕影像器材有限公司)，羅蘭電生理儀(德國羅蘭公司)，Phoenix Micron IV小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像儀(美國Phoenix Research Labs公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本實(shí)驗(yàn)采用34只C57BL/6野生型小鼠(斯貝福生物技術(shù)有限公司)，8周齡，雄性，體質(zhì)量約20 g，隨機(jī)分為對照組(8只)、模型組(8只)、熟地黃組(6只)、枸杞子組(6只)、熟地黃+枸杞子組(6只)；各藥物干預(yù)組連續(xù)灌胃9周，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版，熟地黃、枸杞子分別用水提法濃縮烘干后，粉碎成粉末，生理鹽水混懸灌胃，藥物劑量分別為：熟地黃0.45 g·kg-1·d-1，枸杞子0.46 g·kg-1·d-1，劑量及配伍均對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無害[10-11]。灌胃期間，各組小鼠在昏暗的循環(huán)光(5 lux，12 h開/關(guān))下，保持良好通風(fēng)，溫度維持在22 ℃，灌胃第9周開始進(jìn)行造模[3,12]。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.3 視網(wǎng)膜光損傷模型的建立預(yù)先將模型組、熟地黃組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組小鼠放在有透明隔板的透明塑料箱中，每只小鼠單獨(dú)放置，避免受損不均，裝置上方通風(fēng)良好，將強(qiáng)度為(10 000±500)lux的白光光源放置在光照箱上方30 cm。散瞳后連續(xù)光照7 d，每天光照4 h。7 d光損傷結(jié)束后對小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行各項(xiàng)功能及形態(tài)學(xué)檢查。

1.4 視網(wǎng)膜電圖檢測小鼠視網(wǎng)膜功能各組小鼠暗反應(yīng)12 h后進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢查。各組小鼠給予異氟烷吸入麻醉，散瞳后將其固定于動(dòng)物臺上，連接參考電極于頭部，環(huán)形角膜刺激電極固定于眼球角鞏膜緣處，地極接于尾根部，應(yīng)用羅蘭視網(wǎng)膜電生理儀，記錄暗反應(yīng)下光強(qiáng)度0.01 cds·m-2、3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2及震蕩電位(OPS)波形，并對波幅進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 光學(xué)相干斷層掃描檢測小鼠視網(wǎng)膜各層厚度各組小鼠給予異氟烷吸入麻醉，散瞳后雙眼涂卡波姆眼用凝膠保護(hù)角膜，瞳孔散大后應(yīng)用Phoenix Micron IV小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像儀，活體觀察視網(wǎng)膜各層形態(tài)，光學(xué)相干斷層掃描(OCT)檢測小鼠視網(wǎng)膜各層厚度，判斷其是否存在視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷。

1.6 熒光素眼底血管造影檢查眼底血管滲漏情況OCT檢查結(jié)束后，小鼠保持原位，20 g·L-1熒光素鈉腹腔注射，同樣應(yīng)用Phoenix Micron IV小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像儀觀察視網(wǎng)膜血管的充盈狀態(tài)及滲漏情況，Angio Tool軟件分析動(dòng)靜脈期小血管密度等參數(shù)。

1.7 視網(wǎng)膜病理切片觀察活體檢測結(jié)束后，小鼠吸入適量異氟烷麻醉，取出完整眼球置于眼球固定液中，12 h后切除眼球標(biāo)本上部分角膜，再固定8 h后，標(biāo)本進(jìn)行脫水、包埋、切片，行HE染色及TUNEL免疫熒光和DAPI染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)及凋亡細(xì)胞情況，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)核層(INL)、外核層(ONL)，通過Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.8 血液生物化學(xué)檢測抗氧化能力小鼠予異氟烷吸入麻醉活體取出眼球后，收集1 mL滴落的眼動(dòng)脈血液后，立即頸椎脫臼法處死小鼠。測定血清中其SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)四項(xiàng)指標(biāo)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，再采用LSD法進(jìn)行兩組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 光損傷模型制作利用光損傷模式模擬AMD視網(wǎng)膜病變，在ERG中，暗反應(yīng)下光強(qiáng)度0.01 cds·m-2、3.00 cds·m-2時(shí)模型組b波波幅較對照組分別降低了25.6%、37.3%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。模型組眼底照相中可見視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)層光損傷后變性，OCT圖像中可見對應(yīng)位置Bruch膜物質(zhì)沉積。病理切片HE染色中模型組ONL細(xì)胞明顯有紊亂、密度降低的趨勢，GCL細(xì)胞顯著減少，RPE層呈現(xiàn)萎縮樣改變。TUNEL染色中模型組視網(wǎng)膜總細(xì)胞凋亡率和ONL層細(xì)胞凋亡率均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。以上結(jié)果證明強(qiáng)光照射導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜功能及結(jié)構(gòu)損傷。

2.2 熟地黃、枸杞子提取物能改善光損傷小鼠的視網(wǎng)膜功能暗反應(yīng)下0.01 cds·m-2b波、3.00 cds·m-2b波、10.0 cds·m-2b波波幅在模型組與對照組、各藥物干預(yù)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。0.01 cds·m-2暗反應(yīng)下，枸杞子組、熟地黃+枸杞子組b波和OPS波波幅較模型組均顯著提高；3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2暗反應(yīng)下枸杞子組、熟地黃+枸杞子組的b波較模型組均顯著提高；以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。此外，暗反應(yīng)下熟地黃+枸杞子組的0.01 cds·m-2b波、3.00 cds·m-2b波和OPS波波幅均較熟地黃組顯著提高(均為P<0.05)。3.00 cds·m-2、10.00 cds·m-2暗反應(yīng)下對照組、各藥物干預(yù)組a波均較模型組升高,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。(見圖1、表1)。

圖1 各組ERG波形及波幅 A：各組小鼠ERG暗反應(yīng)下光強(qiáng)度為0.01 cds·m-2 和3.00 cds·m-2 時(shí)b波波形；B：各組小鼠ERG暗反應(yīng)下不同刺激光強(qiáng)度下b波波幅

表1 暗反應(yīng)下不同背景光強(qiáng)度時(shí)各組小鼠ERG波幅

2.3 熟地黃、枸杞子提取物可改善光損傷小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷在模型組小鼠的眼底照相和OCT圖像中觀察到典型的早期AMD特征性表現(xiàn)，如視網(wǎng)膜滲出樣改變和玻璃膜疣樣病變，陽性率為57.0%；在熟地黃組中觀察到相同病變，陽性率為12.5%；而對照組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組中未觀察到此病變(見圖2)。HE染色中模型組ONL結(jié)構(gòu)有明顯紊亂、細(xì)胞密度降低的趨勢，RGC細(xì)胞顯著減少，GCL呈現(xiàn)萎縮樣改變；對照組、熟地黃組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列規(guī)整，細(xì)胞形態(tài)均一，RPE層連續(xù)整齊?？梢娛斓攸S、枸杞子可抑制光損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜ONL變薄(見圖3)。

圖2 各組小鼠眼底照相和OCT圖像 紅色箭頭示視網(wǎng)膜滲出樣改變和玻璃膜疣樣病變。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜病理切片HE染色(×40)

2.4 光損傷未導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜血管損傷滲漏運(yùn)用血管分析軟件Angio Tool進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，各組小鼠視網(wǎng)膜血管面積和分支數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，模型組視網(wǎng)膜受損部位未見熒光素滲漏(見表2、圖4)。

圖4 各組小鼠FFA圖像

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜血管面積和分支數(shù)量

2.5 熟地黃、枸杞子提取物可降低光損傷小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，模型組視網(wǎng)膜全層、GCL、INL、ONL細(xì)胞凋亡率均較對照組顯著升高，熟地黃組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組視網(wǎng)膜全層、GCL、INL、ONL細(xì)胞凋亡率均較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖5、表3)。

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜TUNEL免疫熒光染色檢測細(xì)胞凋亡率

圖5 各組小鼠TUNEL免疫熒光染色和DAPI染色(×20)

2.6 熟地黃、枸杞子提取物可提高光損傷小鼠血清抗氧化能力熟地黃組、枸杞子組和熟地黃+枸杞子組中SOD活性較模型組分別升高了8.93%、16.30%、20.57%，且熟地黃+枸杞子組較熟地黃組升高了11.40%；熟地黃組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組中GSH-Px活性較模型組分別升高了14.44%、20.05%、36.04%，熟地黃+枸杞子組較熟地黃組、枸杞子組分別升高了14.90%、13.40%；熟地黃+枸杞子組中MDA含量較模型組降低了7.60%；以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表4)。

表4 各組間SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較

3 討論

視網(wǎng)膜是感受和傳遞視覺信息的起始部位，是人體中耗氧量最高的組織之一，容易受到強(qiáng)光的影響而造成視覺功能障礙，光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷以光感受器細(xì)胞凋亡、RPE層損傷為特征[13]。AMD是一種視網(wǎng)膜退行性疾病，大量研究證實(shí)，衰老、吸煙及持續(xù)可見光暴露與AMD的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。光暴露是視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的重要因素[8-9,17-18]。小鼠模型和人類AMD發(fā)病基本病理改變類似[19]，且小鼠視網(wǎng)膜與人類周邊視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)大致相同，因此，本研究利用光損傷誘導(dǎo)C57BL/6小鼠視網(wǎng)膜病變模擬AMD視網(wǎng)膜病變[2，9]。

ERG主要用于視網(wǎng)膜功能的分析，其中a波主要來源于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞電位；b波幅度較大，主要與視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞的電活動(dòng)有關(guān)[20]。熟地黃和枸杞子干預(yù)顯著緩解了光損傷造成的功能下降。熟地黃+枸杞子聯(lián)合給藥效果更為顯著，比單獨(dú)應(yīng)用熟地黃效果更優(yōu)。對于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的改變，模型組的眼底照相和OCT檢查結(jié)果符合AMD早期病變[21]，但對照組、說明熟地黃組、枸杞子組、熟地黃+枸杞子組沒有出現(xiàn)類似改變，熟地黃、枸杞子能夠緩解光損傷造成的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變。熒光素鈉能在藍(lán)色光激發(fā)下透過較薄的血管壁呈現(xiàn)綠色熒光，F(xiàn)FA即可顯示視網(wǎng)膜上血管管徑和形態(tài)。模型組2～4 mm小血管面積和血管分支數(shù)無顯著增多，可能原因?yàn)楸狙芯吭炷Ｖ泄庹論p傷時(shí)間較短，只造成了急性損傷，形成早期AMD病變，新生血管未形成，未出現(xiàn)滲出樣改變[22-25]。其中氧化應(yīng)激是AMD發(fā)展的核心，有研究顯示，全身氧化應(yīng)激與視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激均與AMD相關(guān)[26-27]，特征為組織中活性氧(ROS)水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA受損或修飾，使細(xì)胞中Caspase-3、Bax mRNA等表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，降低細(xì)胞生理作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22,24,28-30]。在HE染色中，模型組ONL即光感受器細(xì)胞核層數(shù)明顯減少，細(xì)胞間隙增大、排列紊亂，TUNEL染色結(jié)果同樣顯示模型組ONL細(xì)胞凋亡率明顯升高；RPE層可見駝峰樣隆起，為RPE細(xì)胞代謝障礙產(chǎn)生的異常代謝產(chǎn)物在視網(wǎng)膜上的異常沉積，此為早期AMD的特征性病變，與OCT中病變部位圖像相對應(yīng)，證明RPE結(jié)構(gòu)的破壞[31]。各藥物干預(yù)組與對照組的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列緊密整齊，RPE層結(jié)構(gòu)完整。

有文獻(xiàn)證明[32-33]，視紫紅質(zhì)、類視黃醇會(huì)吸收過量光子，進(jìn)而生成大量氧自由基，細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)中的脂類發(fā)生過氧化連鎖反應(yīng)，形成過多脂質(zhì)過氧化物(如MDA)在組織內(nèi)積累，致使視錐細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，本研究結(jié)果也證實(shí)，光照損傷使小鼠血清MDA含量明顯升高。熟地黃和枸杞子提取物中的多種活性物質(zhì)已被證實(shí)具有抗氧化、抗凋亡等作用[34]；枸杞多糖可防止脂質(zhì)過氧化，通過檢測多種主要內(nèi)源性抗氧化標(biāo)志物的改變得到證實(shí)[1,35-36]；枸杞子中的β-類胡蘿卜素類物質(zhì)是有效的自由基清除劑，葉黃素對視網(wǎng)膜的保護(hù)機(jī)制主要為濾過藍(lán)光和抗氧化損傷[4]。在TUNEL染色中，熟地黃、枸杞子提取物顯著降低視網(wǎng)膜各層細(xì)胞凋亡率，具有延緩細(xì)胞凋亡的作用，維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，熟地黃+枸杞子共同干預(yù)對視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡抑制作用更強(qiáng)。熟地黃和枸杞子有提高抗氧化能力并降低血清MDA的趨勢，熟地黃+枸杞子組趨勢更為顯著，說明熟地黃、枸杞子可通過增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性及降低MDA含量提高全身抗氧化能力，降低視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷，抑制組織中產(chǎn)生大量的ROS所導(dǎo)致碳水化合物、膜中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的修飾和破壞，從而延緩細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明,熟地黃和枸杞子可對光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷有保護(hù)作用，維持視網(wǎng)膜功能，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性，通過提高全身抗氧化能力降低氧化應(yīng)激損傷，延緩視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的凋亡，且兩種藥物同時(shí)服用預(yù)防趨勢更加明顯。熟地黃和枸杞子是我國產(chǎn)量豐富、價(jià)格低廉的中草藥，老年人適量服用這兩種中藥有助于預(yù)防AMD發(fā)生，提高全身抗氧化能力。熟地黃和枸杞子對視網(wǎng)膜損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制尚未完全明了，有待深入研究探討。