活性氧在貝伐單抗誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用△

郝相慧 楊玲玲 周麗 徐海峰

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是指50歲以上人群黃斑部出現(xiàn)玻璃膜疣、地圖狀萎縮(干性或萎縮型)和(或)脈絡(luò)膜新生血管(CNV)及其引起的出血、水腫等(濕性或滲出型)嚴(yán)重?fù)p害視功能的不可逆致盲眼病，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞在視覺活動中所產(chǎn)生的活性氧(ROS)在本病發(fā)生發(fā)展中的作用已得到肯定[1]。目前，干性AMD無有效治療方法，含有抗氧化成分的食品被推薦給患者食用，以減緩病情進(jìn)展[2]；濕性AMD的一線治療方法是玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，以促使CNV萎縮、出血及滲漏停止，從而使視力提高或阻止視力下降；但抗VEGF治療并不能中和促纖維因子，血管生成和組織纖維化因子之間的不平衡導(dǎo)致強(qiáng)烈的成纖維反應(yīng)，新生血管過度纖維化嚴(yán)重影響了抗VEGF治療的遠(yuǎn)期療效[3]。因此，在抗VEGF治療同時如何減輕CNV纖維化引起了廣泛關(guān)注。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗VEGF處理后不但纖維化及炎癥因子的表達(dá)水平發(fā)生變化[4]，ROS水平也明顯升高、抗氧化功能降低[5]，而且在其他組織細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)ROS對腎小管上皮細(xì)胞[6]和晶狀體上皮細(xì)胞[7]的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)具有重要作用，因此我們推測抗VEGF處理后RPE細(xì)胞中ROS水平增高或許也參與了其EMT的發(fā)生，而通過干預(yù)、降低ROS水平或許可以減輕抗VEGF所導(dǎo)致的過度纖維化；另外，RPE細(xì)胞在生理?xiàng)l件下表達(dá)的NADPH氧化酶(NOX)是體內(nèi)器官組織中廣泛存在的一種氧化還原信號的關(guān)鍵酶，參與多種疾病的發(fā)展和進(jìn)程，是體內(nèi)ROS的主要來源；并且有研究證明其亞型具有促進(jìn)肝臟及肺纖維化的作用[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用ROS抑制劑乙酰半胱氨酸(NAC) 和NOX抑制劑二苯基氯化碘鹽(DPI)，以EMT標(biāo)志物緊密連接相關(guān)蛋白閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)為觀察指標(biāo)，探討抑制ROS對抗VEGF治療導(dǎo)致的人RPE細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器ARPE-19細(xì)胞系購于上海賽百慷生物科技有限公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶及6孔板(美國Corning公司)；貝伐單抗(bevacizumab,BEV)(瑞士Genentech公司)；ROS抑制劑NAC、NOX抑制劑DPI(美國MedChemExpress公司)；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、全氟丁基磺酰氟(PFBSF)(美國Sigma公司)；驢血清白蛋白(索萊寶公司)；PCR試劑盒(諾唯贊公司)；Trizol、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美國Invitrogen公司)；兔多抗ZO-1(ab216880)、兔單抗α-SMA(ab32575)、兔多抗FN(ab2413)(美國Abcam公司)；化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)；熒光定量PCR儀、Western blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組ARPE-19細(xì)胞的體外培養(yǎng)及分組：將1×106個細(xì)胞接種于六孔板中，用DMEM/F-12培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.1 U·L-1青霉素和鏈霉素)在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%匯合時，更換為含有體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，并將細(xì)胞分組如下：(1)空白對照組：繼續(xù)培養(yǎng)72 h；(2)BEV組：培養(yǎng)基中加入0.25 g·L-1BEV培養(yǎng)72 h；(3)BEV+NAC組：培養(yǎng)基中加入0.25 g·L-1BEV培養(yǎng)24 h后加入200 μmol·L-1ROS抑制劑NAC，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；(4)BEV+DPI組：培養(yǎng)基中加入0.25 g·L-1BEV，培養(yǎng)24 h后加入1 μmol·L-1NOX抑制劑DPI，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測將ARPE-19細(xì)胞接種到96孔板中，其中含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基。細(xì)胞達(dá)到70%匯合后，BEV組細(xì)胞中加入0.25 g·L-1BEV在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，用DMEM/F-12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA和PFBSF，使其濃度分別為10 μmol·L-1和5 mmol·L-1，加入到96孔板中，將培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，棄去培養(yǎng)板內(nèi)溶液并用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm激光波長下進(jìn)行檢測。每組設(shè)置3個復(fù)孔，用Strata Quest分析軟件對各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。ROS廣泛指代氧來源的自由基和非自由基，其中包括H2O2。

將ARPE-19細(xì)胞接種到6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，并在室溫下用40 g·L-1多聚甲醛固定20 min。PBS洗滌3次后，按不同分組用體積分?jǐn)?shù)0.2%Triton X-100透化細(xì)胞1 min或不透化，再次PBS洗滌3次后，將細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%驢血清白蛋白在37 ℃封閉30 min，并在4 ℃孵育上述抗體過夜。稀釋度如下：兔抗ZO-1為1200，兔單抗α-SMA為1200，兔多抗FN為1200，PBS洗滌后在室溫下將細(xì)胞用FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG(1200)避光孵育1 h，PBS洗滌細(xì)胞并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，使用共聚焦顯微鏡捕獲圖像。每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中ZO-1、α-SMA及FN的mRNA表達(dá)收集各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，按照諾唯贊試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由青島德羅海達(dá)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。ZO-1上游引物：5’-AGGATCCATATCCCGAGGAAA-3’，下游引物：5’-CGAGGTCTCTGCTGGCTTGT-3’，大小為152 bp；α-SMA上游引物：5’-GGTGACGAAGCACAGAGCAA-3’，下游引物：5’-CAGGGTGGGATGCTCTTCAG-3’，大小為151 bp；FN上游引物：5’-GGGACCGTCAGGGAGAAAA-3’，下游引物：5’-CGAGATATTCCTTCTGCCACTGTT-3’，大小為154 bp；GAPDH上游引物：5’-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3’，下游引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’，大小為154 bp。采用ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)，按Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒說明書加入試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，輸出循環(huán)閾值(Ct值)后，依照公式2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot檢測各組細(xì)胞中ZO-1、α-SMA及FN的蛋白表達(dá)將各組細(xì)胞用裂解緩沖液在冰上裂解30 min后收集超聲10 s，4 ℃ 12 000 r·min-1且離心半徑為10 cm的離心機(jī)離心10 min后收集上清，用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。將提取的總蛋白30 μg在上樣緩沖液中煮沸10 min，體積分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜，50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，再次洗膜并使用Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)使蛋白信號可視化。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，使用Image J軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 BEV對ARPE-19細(xì)胞中ROS和H2O2表達(dá)的影響細(xì)胞免疫熒光及Strata Quest軟件分析結(jié)果顯示，空白對照組ARPE-19細(xì)胞中ROS、H2O2生理狀態(tài)下即有少量表達(dá)，加入0.25 g·L-1BEV繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，兩者生成水平均明顯上調(diào)，BEV組ARPE-19細(xì)胞中ROS由18.490±6.029升高至41.830±0.830(t=3.834,P<0.05)，H2O2由20.610±2.529升高至46.860±6.966(t=3.543,P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 免疫熒光檢測空白對照組和BEV組細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2 表達(dá)水平

2.2 BEV對ARPE-19細(xì)胞ZO-1、α-SMA、FN 表達(dá)水平的影響免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，BEV組ARPE-19細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的熒光強(qiáng)度較空白對照組變化顯著，ZO-1明顯降低，而α-SMA和FN則明顯增高(見圖2)。

圖2 免疫熒光觀察空白對照組和BEV組細(xì)胞EMT標(biāo)志物ZO-1、α-SMA、FN表達(dá)的影響

2.3 qRT-PCR和Western blot檢測BEV對ARPE-19細(xì)胞中ZO-1、α-SMA、FN表達(dá)水平的影響B(tài)EV處理ARPE-9細(xì)胞72 h后，與空白對照組相比，BEV組EMT標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。其中，ZO-1 mRNA表達(dá)量降低至0.769±0.039(t=5.970，P<0.01)，α-SMA mRNA、FN mRNA表達(dá)量分別升高至2.755±0.152(t=11.390，P<0.01)、2.341±0.219(t=5.810，P<0.01)；ZO-1蛋白表達(dá)量降低至0.839±0.017(t=9.144，P<0.05),α-SMA蛋白和FN蛋白表達(dá)量分別升高至1.079±0.020(t=12.470,P<0.01)和1.014±0.031(t=7.598,P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

圖3 空白對照組和BEV組中EMT標(biāo)志物ZO-1、α-SMA和FN的蛋白表達(dá)

2.4 免疫熒光化學(xué)染色觀察各組細(xì)胞中ZO-1、α-SMA、FN的表達(dá)水平共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與BEV組相比，BEV+NAC組和BEV+DPI組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物ZO-1熒光強(qiáng)度明顯增高，而間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和FN的熒光強(qiáng)度明顯降低。說明NAC和DPI逆轉(zhuǎn)了BEV導(dǎo)致的上皮標(biāo)志物表達(dá)的降低和間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的升高(見圖4)。

圖4 免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞中EMT標(biāo)志物ZO-1、α-SMA和FN的表達(dá)

2.5 抑制ROS表達(dá)對各組ARPE-19細(xì)胞中ZO-1、α-SMA、FN的mRNA表達(dá)水平影響各組間的ZO-1表達(dá)量相比較，BEV+NAC組高于BEV組(t=3.000，P<0.05),BEV+DPI組高于BEV組(t=6.750，P<0.01)；與單純BEV組相比，NAC與DPI的加入均可以顯著降低α-SMA mRNA表達(dá)量(t=7.910、7.560，均為P<0.01)；FN mRNA表達(dá)量也顯著降低(t=7.360、5.380，均為P<0.01)(見表1)。ROS抑制劑NAC和NOX抑制劑DPI可以顯著改變EMT標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平。

表1 各組ARPE-19細(xì)胞中ZO-1、α-SMA、FN的mRNA表達(dá)比較

2.6 抑制ROS表達(dá)對各組細(xì)胞中ZO-1、α-SMA、FN的蛋白表達(dá)水平影響Western blot檢測結(jié)果顯示，與BEV組相比，BEV+NAC組和BEV+DPI組中各種因子蛋白的表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，ZO-1蛋白相對表達(dá)量升高了0.195±0.010(t=19.020，P<0.01)、0.770±0.175(t=4.408,P<0.05)；α-SMA蛋白相對表達(dá)量降低了0.353±0.098和0.482±0.037(t=3.595、13.200,均為P<0.05)；同時FN的蛋白相對表達(dá)量降低了0.528±0.161和0.612±0.134(t=3.288、4.565,均為P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。

圖5 BEV組、BEV+NAC組及BEV+DPI組中EMT標(biāo)志物ZO-1、α-SMA、FN的蛋白表達(dá)

3 討論

AMD是世界范圍內(nèi)老年人視力不可逆性喪失的首位原因，北京老年人中高達(dá)7.7%的致盲原因?yàn)锳MD[9]，隨著人口老齡化，AMD的發(fā)病率會更高。因此，有效的治療方法無論對患者本人、家庭還是對社會都極其重要。目前，濕性AMD的一線治療方法是抗VEGF治療，大量研究證明了其有效性及安全性[10-12]，然而隨著抗VEGF制劑的廣泛應(yīng)用及隨訪時間延長，抗VEGF治療的副作用也逐漸顯現(xiàn)，CNV的纖維化是最嚴(yán)重的副作用之一。Heier[13]發(fā)現(xiàn)，最早參加抗VEGF治療臨床試驗(yàn)的患者隨訪2～6 a后，超過50%患者因黃斑部嚴(yán)重纖維化而失去此前提高的視力；CATT研究[10]報(bào)道，經(jīng)過2 a抗VEGF治療后，45.3%(480/1059)濕性AMD患眼黃斑部發(fā)生纖維化；一項(xiàng)關(guān)于高度近視CNV的治療結(jié)果顯示，抗VEGF治療1 a后纖維化發(fā)生率為31.9%，并且纖維化的發(fā)生與視力呈顯著負(fù)相關(guān)[14]；在抗VEGF治療過程中，纖維化的發(fā)生是貫徹全程的，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抗VEGF治療3次后就有CNV發(fā)生纖維化[15]，視網(wǎng)膜下纖維組織的存在會導(dǎo)致視細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、功能受損，因而嚴(yán)重影響視力。因此，探討抗VEGF治療后CNV纖維化的機(jī)制、尋找減輕纖維化發(fā)生的方法，對提高新生血管性疾病的療效具有重要的意義。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，BEV處理細(xì)胞后可使ROS和纖維化相關(guān)因子水平升高[4-5]，上述改變均可能影響抗VEGF治療的預(yù)后，但目前沒有滿意的抗纖維化藥物可以使用，而抑制ROS的食品藥品卻隨處可得，因此，本研究進(jìn)一步觀察了ROS與EMT的關(guān)系及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)后EMT的發(fā)生程度。在EMT期間，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間連接，與周圍細(xì)胞解離，并獲得間充質(zhì)樣特征，因此，緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、FN通常被用作評價(jià)EMT的指標(biāo)[16]。本研究亦采取上述因子進(jìn)行EMT評價(jià)，結(jié)果表明，BEV可誘導(dǎo)ROS的高表達(dá)以及RPE細(xì)胞EMT的發(fā)生，而ROS抑制劑及NOX抑制劑均可以減輕上述反應(yīng)，提示抗氧化劑有減輕抗VEGF治療所誘發(fā)的新生血管纖維化的潛在可能。

許多疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激有關(guān)[7,17]，氧化應(yīng)激的產(chǎn)物ROS是氧正常代謝的天然副產(chǎn)物，其包括超氧化物和H2O2，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生增多則會導(dǎo)致細(xì)胞損傷并危害機(jī)體健康[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，臨床使用濃度的BEV可以引起RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為ROS和H2O2表達(dá)水平增強(qiáng)；此外，同濃度的BEV還引起了EMT標(biāo)志物的基因及蛋白的表達(dá)水平增強(qiáng)，與Liu等[19]和Katikireddy等[20]研究發(fā)現(xiàn)ROS參與組織纖維化的結(jié)論相符，提示在RPE細(xì)胞EMT中，ROS也可能起到促進(jìn)作用；另外，NADPH氧化酶(也稱NOX家族蛋白)是調(diào)控ROS產(chǎn)生的重要上游信號[21]，抑制NOX可以間接抑制ROS產(chǎn)生，因此，本研究同時觀察了干預(yù)NOX表達(dá)對RPE細(xì)胞EMT的影響，結(jié)果表明，ROS與NOX抑制劑NAC與DPI均可降低EMT標(biāo)志物的基因及蛋白的表達(dá)水平。ROS促進(jìn)纖維化的機(jī)制尚不完全清楚，考慮與轉(zhuǎn)化生長因子-β的生成有關(guān)[19-20]。影響抗VEGF治療遠(yuǎn)期療效的另一因素是黃斑區(qū)地圖樣萎縮(GA)[10]，雖然與抗VEGF藥物的因果關(guān)系尚不能確立，但GA是晚期干性AMD的表現(xiàn)，而美國年齡相關(guān)性黃斑變性研究組(AREDS)的研究結(jié)果表明，含有多種抗氧化成分配方的保健食品可以預(yù)防GA的發(fā)生、延緩其進(jìn)展[22]，結(jié)合本研究結(jié)果表明，抗氧化食品或許可以減輕抗VEGF治療帶來的副作用，無論是CNV纖維化，還是GA。

綜上所述，抗VEGF制劑可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，進(jìn)而導(dǎo)致EMT的發(fā)生；抑制ROS后可以顯著降低EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平，因而提示抗氧化制劑可能降低抗VEGF治療所誘發(fā)的CNV過度纖維化的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)尚存在局限性，僅觀察到ROS抑制劑和NOX抑制劑處理后RPE細(xì)胞的生物學(xué)行為，并未在動物模型中證實(shí)，因此需要在下一步的研究中選擇日常易得的抗氧化藥物在動物模型中進(jìn)一步證實(shí)。