花粉的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別研究

符致秋，劉剛*，安冉，歐全宏，楊衛(wèi)梅，李建美，時(shí)有明

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011)

1 引言

雪松是世界四大觀賞樹之一，原產(chǎn)于喜馬拉雅山地區(qū)，具有較強(qiáng)的防塵和減噪能力。雪松不僅具有觀賞價(jià)值，也具有抗腫瘤、抗氧化、抗褐變、抗驚厥、抗菌和抗病毒等多種藥理活性[1,2]。雪松花粉含有多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，如20種氨基酸、15種維生素、類黃酮、不飽和脂肪酸和單糖等[3]。雪松花粉可為食品、保健食品和藥品提供優(yōu)質(zhì)原料[4]。

蜂花粉也含有蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、脂質(zhì)、糖類和其他的營養(yǎng)物質(zhì)，但與雪松花粉不同，雪松花粉還可以作為醫(yī)療用藥治療前列腺增生、抗衰老、抗疲勞、補(bǔ)血和增強(qiáng)免疫力等。而雪松花粉特有的營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值使其價(jià)格昂貴，蜂花粉相對(duì)便宜。蜂花粉的顏色與雪松花粉的顏色都為黃色或者淡黃色，外觀上不易于區(qū)分。所以有些商家會(huì)在雪松花粉中摻雜蜂花粉用于售賣獲取高額利潤。

傳統(tǒng)的花粉分類通常是用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡來識(shí)別，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征 (顆粒的大小、形狀、表面、孔徑)進(jìn)行鑒定[5,6]。也有其它方法用于花粉分類，如Dias等人用電子舌數(shù)據(jù)和化學(xué)計(jì)量工具相結(jié)合鑒定單花和多花蜂蜜中主要花粉的相對(duì)豐度[7]；Moore等人利用MALDI-ToF質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)孢粉素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[8]；Kiselev等人用光譜分辨檢測與閃光燈激勵(lì)相結(jié)合，提出了一種基于氙燈激勵(lì)和光譜分辨熒光采集的新型光學(xué)氣溶膠粒子探測器，對(duì)三種天然花粉進(jìn)行研究[9]；王謙等人分析了蜂花粉和松花粉兩者營養(yǎng)成分的差異性，兩者營養(yǎng)成分的種類大致相同，但含量差異大，蜂花粉中還原糖含量較高，而松花粉中膳食纖維含量較高[10]。以上這些方法對(duì)花粉的區(qū)分，其實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，有的耗時(shí)費(fèi)力且成本高，并且對(duì)操作人員的要求比較高。

光譜法具有簡單快速的特點(diǎn)，如O′Connor等人用熒光光譜結(jié)合主成分分析對(duì)8種花粉和5種真菌孢子進(jìn)行研究，能有效地區(qū)分各種花粉[11]。紅外光譜也用于花粉研究，如，徐小蘭[12]等人運(yùn)用FTIR光譜和二維相關(guān)紅外光譜對(duì)花粉進(jìn)行了分類；Zimmermann等人用FTIR對(duì)真菌孢子和植物花粉分類及估計(jì)其形態(tài)特征，測量出主要的空氣變應(yīng)原植物[13]，他們也用紅外顯微光譜對(duì)松科花粉和其他種類花粉的識(shí)別[14]，也對(duì)單個(gè)花粉粒的無散射FTIR顯微測量，討論了花粉粒的化學(xué)特征和光譜數(shù)據(jù)中形態(tài)參數(shù)的提取[15]，Zimmermann等人還用紅外光譜對(duì)43種不同的松屬植物花粉樣品進(jìn)行了比較研究，分析出振動(dòng)光譜與花粉粒形態(tài)、生物化學(xué)和分類學(xué)之間具有明顯的相關(guān)性[16]；Elena等人建立了6種致敏花粉粒的FT-IR參考光譜數(shù)據(jù)庫[17]；Erzsebet等人用FTIR光譜對(duì)非洲紫堇屬15個(gè)基因型的花粉進(jìn)行了綜合研究[18]。也有其他研究者用紅外光譜結(jié)合其他工具對(duì)花粉進(jìn)行研究，如結(jié)合熒光光譜[19]、化學(xué)計(jì)量[20]、無監(jiān)督與監(jiān)督多元統(tǒng)計(jì)方法[21]和掃描電子顯微鏡[22]等。紅外光譜法雖然能簡單快速得鑒別花粉，但紅外光譜容易受到環(huán)境中水分和二氧化碳的影響。

拉曼光譜不受環(huán)境中水分和二氧化碳的影響，運(yùn)用拉曼光譜對(duì)花粉的研究也比較多，Ivleva等人采用顯微拉曼對(duì)豚草、白樺、英國櫟、歐洲椴樹等過敏相關(guān)花粉進(jìn)行了化學(xué)表征，結(jié)合主成分分析和層次聚類分析對(duì)不同花粉種間鑒別[23]；Guedes等人建立34種花粉的拉曼光譜庫，并對(duì)該數(shù)據(jù)庫在空氣樣品中檢測和鑒定花粉的適用性進(jìn)行測試[24]；Wang等人用光敏掃描拉曼光譜系統(tǒng)研究空氣中單個(gè)花粉/孢子顆粒的拉曼光譜[25]；Franziska等人用拉曼光譜結(jié)合高效薄層色譜法研究了不同樹種的花粉粒中類胡蘿卜素成分[26]。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)作為一種高靈敏度的光譜分析方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快、操作簡單以及可以實(shí)現(xiàn)無損檢測的特點(diǎn)，適合在食品安全快速檢測領(lǐng)域[27]。本文利用掃描電子顯微鏡對(duì)雪松花粉和七種蜂花粉進(jìn)行形貌觀察，用表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)雪松花粉和七種蜂花粉進(jìn)行鑒別研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：拉曼光譜儀(ANDOR SR-500型，英國)；掃描電子顯微鏡(FEI Quanta250型，荷蘭)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2600型，日本島津公司)；智力磁力攪拌器(ZNCL-DLT250ML*四聯(lián)，上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司)；高速離心機(jī)(TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)；優(yōu)普系列超純水器(UPT-I-20T，四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

拉曼測試條件：選用785 nm激光激發(fā)，熱電冷卻的iDUS 416 CCD檢測器，采集光譜范圍200～3500 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描時(shí)間為40 s，累加5次，到達(dá)樣品上的功率約為6.4 mW。

實(shí)驗(yàn)試劑：硝酸銀(99.8%，上海旭達(dá)精細(xì)化工廠)，檸檬酸鈉(99.0%，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，結(jié)晶紫(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)中所用到的水均為超純水，水電阻率為17～18 MΩ·cm。

2.2 銀納米顆粒的制備

參考Lemma等人[28]的方法，用檸檬酸鈉還原硝酸銀制備銀納米顆粒。實(shí)驗(yàn)前均用稀硝酸浸泡實(shí)驗(yàn)相關(guān)的玻璃儀器，再用去離子水清洗，放干燥箱內(nèi)烘干待用。銀納米顆粒的制備：稱取硝酸銀17 mg，用去離子水定容到100 mL，再將硝酸銀溶液置于燒瓶中，在磁力攪拌器上不斷攪拌并加熱直至沸騰。然后迅速加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉水溶液，保持溶液沸騰，持續(xù)攪拌60 min，然后冷卻至室溫。將得到的銀溶膠納米顆粒溶液轉(zhuǎn)移入離心管中，然后將離心管放進(jìn)高速離心機(jī)中離心(5000 rad/min) 30分鐘，之后去除上清液，再加入去離子水，放到超聲波中震蕩，得到最終的銀納米顆粒放到4℃的冰箱中保存待用。檢測前將所得銀納米顆粒滴加到硅片上，在真空干燥箱中干燥，之后于掃描電子顯微鏡中掃描得到電鏡圖，觀察銀納米顆粒的形狀及大小。銀納米顆粒大小統(tǒng)計(jì)采用Nano Measurer 1.2軟件。

2.3 樣品獲取與實(shí)驗(yàn)操作

雪松花粉的獲取：采摘雪松的花穗，曬干，過篩除去雜質(zhì)再收集雪松花粉。七種蜂花粉的獲?。阂婺覆莘浠ǚ?、油菜蜂花粉、茶花蜂花粉、荷花蜂花粉、玫瑰蜂花粉、蕎麥蜂花粉和五味子蜂花粉，這些七種蜂花粉均購買于慈蜂堂(黑龍江小慈生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司)

實(shí)驗(yàn)操作：把銀溶膠溶液滴加到硅片上，放入真空干燥箱烘干(45℃)，然后置于激光顯微拉曼光譜儀的物鏡視野下，采集基底的拉曼光譜，作為空白組。取少量的雪松花粉置于硅片上，使用蓋玻片將粉末壓平再進(jìn)行拉曼光譜掃描，作為對(duì)照組。花粉SERS的采集，取少量花粉置于硅片上再滴加適量銀納米顆粒溶液，將其烘干(45℃)成糊狀后壓平再進(jìn)行掃描。每種光譜的采集均換三個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行采集，每次采集兩次。實(shí)驗(yàn)采集到的所有拉曼光譜數(shù)據(jù)均采用Origin8.6軟件處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 銀納米顆粒的增強(qiáng)作用

圖1(a)為檸檬酸鈉還原硝酸銀制備的銀納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖，所得的銀納米顆粒無銀納米棒出現(xiàn)，大小為不均勻的納米顆粒。圖1(b)為銀納米顆粒的大小尺寸分布統(tǒng)計(jì)圖，粒徑主要在100～140 nm之間。

圖1 銀納米顆粒的SEM(a)與尺寸分布圖(b)Fig.1 SEM (a) and size distribution profile (b) of silver nanoparticles

用結(jié)晶紫作為探針分子，檢驗(yàn)基底的增強(qiáng)效果。結(jié)果如圖2，圖2(a)為10-4mol/L結(jié)晶紫的拉曼光譜圖，在520 cm-1出現(xiàn)拉曼信號(hào)，主要是來自襯底硅片單晶硅的拉曼振動(dòng)峰，在其它范圍沒有出現(xiàn)拉曼信號(hào)；圖2(b)為濃度為10-4mol/L結(jié)晶紫的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖增，從圖中可以看出，銀納米顆粒對(duì)結(jié)晶紫的表面增強(qiáng)效果明顯。

圖2 結(jié)晶紫的拉曼光譜(a)和(b)表面增強(qiáng)拉曼光譜圖Fig.2 Normal Raman (a) and SERS (b) of crystal violet

3.2 八種花粉的SEM圖

用SEM觀察蜂花粉與雪松花粉在比例尺為50 μm的情況下的外形結(jié)構(gòu)，如圖3所示，益母草蜂花粉接近圓形，表層有三條發(fā)芽溝；油菜蜂花粉、蕎麥蜂花粉和五味子蜂花粉三者非常相似，呈現(xiàn)橢圓形，表面有精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只有一條發(fā)芽溝；茶花蜂花粉形態(tài)與益母草蜂花粉相似，表層有三條發(fā)芽溝；荷花蜂花粉近似圓形，表層光滑，有一條發(fā)芽溝；玫瑰蜂花粉體型較小，近似梭形，表層光滑，有三條發(fā)芽溝；雪松花粉形狀近似圓形，體型較大，表面光滑，有一條發(fā)芽溝。

圖3 八種花粉的SEM圖Fig.3 SEM images of eight kinds of pollen

圖4為雪松花粉與銀納米顆粒結(jié)合的SEM圖，從圖4(a)明顯可看出，銀納米顆粒不均勻地附著在每個(gè)花粉粒子表面，有部分區(qū)域附著的銀納米顆粒相對(duì)多。

3.3 雪松花粉的拉曼光譜圖

圖5為雪松花粉在1800-450 cm-1范圍內(nèi)的SERS圖，圖5(a)為銀納米顆粒的拉曼光譜，在此范圍內(nèi)，銀納米顆粒的拉曼光譜顯示微弱的拉曼信號(hào)。圖4(b)為雪松花粉的拉曼光譜圖，可以看出在1702、1513、1382、1243、1011、793 cm-1等位出現(xiàn)了微弱的拉曼信號(hào)，只有在1680 cm-1附近拉曼信號(hào)較強(qiáng)，拉曼光譜除了在1680 cm-1處信號(hào)較強(qiáng)，其它位置的信號(hào)都比較弱。圖5(c)為雪松花粉的SERS圖，在1701、1657、1572、1522、1397、1293、1208、810、565 cm-1等現(xiàn)了明顯的拉曼信號(hào)。

圖4 雪松花粉與銀納米顆?；旌系腟EM圖Fig.4 SEM images of Pinus massoniana Lamb pollens and its mixture with silver nanoparticles

圖5 (a)銀納米顆粒背景的拉曼光譜；(b)雪松花粉拉曼光譜；(c)雪松花粉SERS光譜Fig.5 (a) Raman spectrum of silver nanoparticles;(b) Raman spectrum of Pinus massoniana Lamb pollen;(c) SERS of Pinus massoniana Lamb pollen

在1657 cm-1附近是C=O雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，在1572 cm-1附近的強(qiáng)帶主要是花粉拉曼光譜的共同特征，對(duì)應(yīng)于苯丙氨酸和酪氨酸[29]。在1397 cm-1處是CN的伸縮振動(dòng)和CH3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在1446 cm-1附近是CH3的反對(duì)稱振動(dòng)峰。在1293 cm-1及1011 cm-1處存在的2個(gè)苯丙氨酸殘基的振動(dòng)峰，以上振動(dòng)峰是蛋白質(zhì)的振動(dòng)峰。在1522 cm-1處主要是C=C的伸縮振動(dòng)峰；在1500-1200 cm-1區(qū)間有幾個(gè)較寬的振動(dòng)峰，這主要是C-H 鍵的變形振動(dòng)。810 cm-1處主要是C-C鍵和C-O鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，為多糖類的振動(dòng)峰。在1446 cm-1，1397 cm-1及1382 cm-1處的振動(dòng)峰，屬于不飽和脂肪族鏈中CH2/CH3的變形振動(dòng)峰，由長鏈脂肪酸分子中的甲基、亞甲基產(chǎn)生的。

3.4 雪松花粉與蜂花粉的表面增強(qiáng)拉曼光譜的比較

圖6為雪松花粉與七種蜂花粉在800～450 cm-1范圍的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖。圖6(a)為茶花蜂花粉的SERS圖，從圖中可以看出茶花蜂花粉在1584、1526、1158、1130、1005和749 cm-1出現(xiàn)了明顯的拉曼信號(hào)峰；圖6(b)為荷花蜂花粉的SERS圖，從圖中可以看出荷花蜂花粉分別在1629、1489、1462和895 cm-1出現(xiàn)了較強(qiáng)的拉曼信號(hào)峰，雖然出現(xiàn)的拉曼信號(hào)較少，但比較明顯；圖6(c)為玫瑰蜂花粉的SERS圖，圖中顯示玫瑰蜂花粉的拉曼信號(hào)在1651、1608、1578、1439、1362、1244、1177、818、581、521和419 cm-1處，出現(xiàn)的拉曼信號(hào)較多；圖6(d)為蕎麥蜂花粉的SRES圖，圖中顯示蕎麥蜂花粉的的拉曼信號(hào)主要在1626、1605、1439、1298和1167 cm-1處；圖6(e)為五味子蜂花粉的SERS圖，五味子蜂花粉的拉曼信號(hào)主要在1605、1526和1158 cm-1附近；圖6(f)為益母草蜂花粉的SERS圖，益母草蜂花粉的拉曼信號(hào)主要在1662和1460 cm-1附近；圖6(g)為油菜蜂花粉的SERS圖，油菜蜂花粉的拉曼信號(hào)主要在1602和1167 cm-1處，拉曼信號(hào)較少；圖6(h)為雪松花粉的SERS圖，雪松花粉的拉曼信號(hào)主要在1701、1657、1572、1404、1292、1208、1084、810和565 cm-1附近，拉曼信號(hào)較多。從圖6中可以看出雪松花粉與蜂花粉拉曼峰的個(gè)數(shù)、位置以及強(qiáng)度不同，并且雪松花粉的拉曼信號(hào)較多且清晰。拉曼光譜的差異表明不同花粉間成分的差異，根據(jù)表面增強(qiáng)拉曼光譜可以簡單快速鑒別雪松花粉和蜂花粉。

圖6 八種花粉在1800-400 cm-1范圍內(nèi)表面增強(qiáng)拉曼光譜：(a)茶花蜂花粉；(b)荷花蜂花粉；(c)玫瑰蜂花粉；(d)蕎麥蜂花粉；(e)五味子蜂花粉；(f)益母草蜂花粉；(g)油菜蜂花粉；(h)雪松花粉Fig.6 SERS of eight kinds of pollen in the range of 1800-400 cm-1:(a) camellia pollen;(b) lotus pollen;(c)rose pollen;(d) buckwheat pollen;(e) schisandra pollen;(f) motherwort pollen;(g) rape pollen;(h) Pinus massoniana lamb pollen

3.5 蜂花粉拉曼光譜的比較

如圖3所示，SEM的結(jié)果顯示出油菜蜂花粉、蕎麥蜂花粉與五味子蜂花粉的形貌特征非常相似，在顯微電鏡下不易區(qū)分油菜蜂花粉、蕎麥蜂花粉和五味子蜂花粉這三種蜂花粉。用1800-1000 cm-1范圍內(nèi)的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別這三種蜂花粉，從圖6中可以看出油菜蜂花粉的SERS拉曼峰較少，信號(hào)主要出現(xiàn)在1602和1167 cm-1附近，1602 cm-1附近出現(xiàn)最強(qiáng)峰；蕎麥蜂花粉的SRES圖顯示拉曼峰主要在1626、1605、1439、1298和1167 cm-1附近，最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1605 cm-1附近，1439 cm-1附近的拉曼峰歸屬為孢粉素油脂中C-H2的彎曲振動(dòng)，1298 cm-1附近的拉曼峰歸屬為C-H和N-H的彎曲振動(dòng)，可知道蕎麥蜂花粉與其他兩種種蜂花粉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和外壁主要成分都不同，把1439和1298 cm-1作為蕎麥蜂花粉區(qū)分其他兩種蜂花粉的特征峰；五味子蜂花粉的拉曼信號(hào)顯示出1605、1526和1158 cm-1三處明顯的峰，1526 cm-1為在三種蜂花粉中五味子蜂花粉特有的峰，則1526 cm-1附近的峰可以為五味子蜂花粉區(qū)分油菜和蕎麥蜂花粉拉曼主要特征峰。顯微電鏡不能區(qū)分油菜、蕎麥與五味子蜂花粉，因此表面增強(qiáng)拉曼光譜可以簡單快速區(qū)分油菜、蕎麥與五味子蜂花粉。

益母草蜂花粉與茶花蜂花粉的形貌特征也非常相似(圖3)，在掃描電子顯微鏡下不能區(qū)分二者。運(yùn)用表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別此二者。圖6可以看出二者的拉曼信號(hào)峰差別較大，從益母草蜂花粉的SERS圖可知，益母草蜂花粉的拉曼信號(hào)峰主要在1662和1460 cm-1附近出現(xiàn)兩個(gè)強(qiáng)度接近的峰；而從茶花蜂花粉的SERS可以看出，茶花蜂花粉在1582、1526、1158、1130、1005和749 cm-1附近出現(xiàn)六個(gè)明顯的拉曼信號(hào)峰，并且在1526和1158 cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)很強(qiáng)的拉曼峰。因此用表面增強(qiáng)拉曼光譜可以簡單快速的區(qū)分形貌特征相似的益母草蜂花粉與茶花蜂花粉。

4 結(jié)論

本文用掃描電子顯微鏡對(duì)雪松花粉和七種蜂花粉進(jìn)行形貌觀察，觀察出油菜蜂花粉、蕎麥蜂花粉和五味子蜂花粉三者形態(tài)差異微小，茶花蜂花粉與益母草蜂花粉形態(tài)差異微小，用掃描電子顯微鏡難于區(qū)分這幾種峰花粉。通過銀納米粒子可以有效地增強(qiáng)花粉的拉曼信號(hào)，雪松花粉主要特征峰出現(xiàn)在1701、1657、1572、1522、1397、1293、1208、810和565 cm-1附近；油菜蜂花粉主要征峰在1602和1167 cm-1附近；蕎麥蜂花粉主要特征峰在1439和1298 cm-1附近；五味子蜂花粉特征峰在1605、1526和1158 cm-1附近；益母草蜂花粉主要特征峰在1662和1460 cm-1附近；茶花蜂花粉在1582、1526、1158、1130、1005和749 cm-1附近出現(xiàn)六個(gè)明顯的拉曼特征峰。由于花粉表面增強(qiáng)拉曼光譜的特征峰位置和強(qiáng)度顯示出明顯的差異。因此，表面增強(qiáng)拉曼光譜可以簡單快速的鑒別各類花粉。