多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在食源性致病菌檢測上的應(yīng)用研究進(jìn)展

張明娟，王娟，袁磊，肖昭競，龍梅，李根容

(重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶，400020)

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全是關(guān)乎人民健康與國計民生的重大問題，近年來，由食源性致病微生物引起的食物中毒已經(jīng)成為了全球共同關(guān)注的食品安全問題，根據(jù)世界衛(wèi)生組織提供的數(shù)據(jù)，全球食源性疾病患者總?cè)藬?shù)數(shù)以億計，平均每年都會發(fā)生上億的腹瀉病例，超過300萬的5歲以下兒童因此喪命，其中超過70%的腹瀉是由生物源性污染食品造成[1]。因此，加強(qiáng)食品中致病微生物監(jiān)測，以應(yīng)對食品安全突發(fā)事件，已成為各國政府和國際相關(guān)組織所面臨的迫切任務(wù)。

1 我國現(xiàn)行食源性致病菌檢測方法

目前，我國開展食源性致病菌檢測主要依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，包括細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生化鑒定等過程，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)主要是GB 4789系列[2-19]和GB 8538[20]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測受微生物生長情況影響較大，并且其檢測周期長，一般需要4～7 d，操作也繁瑣復(fù)雜，十分耗時耗力，已不能滿足我國公共衛(wèi)生突發(fā)事件應(yīng)急檢測的需要。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展十分迅速，致病菌檢測標(biāo)準(zhǔn)在制定中從傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿由飳W(xué)方法，查閱目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，在致病菌檢測中主要利用的分子生物學(xué)技術(shù)為傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)[4，10]、實時熒光定量PCR技術(shù)[18，21-22]、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)[23-24]、數(shù)字微滴PCR技術(shù)[25]、飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight，MALDI-TOF)技術(shù)[26]等，具體如表1所示。

分析其標(biāo)準(zhǔn)類別，發(fā)現(xiàn)使用分子生物學(xué)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)基本都是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)，而使用范圍最廣的國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 4789和GB 8538，還是以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，僅在2017年實施的GB 4789.6—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》、GB 4789.12—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》中用到傳統(tǒng)PCR技術(shù)，GB 4789.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 諾如病毒檢驗》中用到實時熒光定量PCR技術(shù)。這主要是由于實時熒光定量PCR技術(shù)、數(shù)字微滴PCR技術(shù)、MALDI-TOF技術(shù)對實驗室人員、儀器要求較高，檢測成本也較高，限制了其在實驗室大范圍普及使用，而LAMP技術(shù)雖對儀器要求較低，但引物設(shè)計較為困難，往往需要設(shè)計幾對GC含量合適，打分較高的優(yōu)質(zhì)引物組，在序列條件不是特別好的情況下，較難實現(xiàn)，大范圍使用也存在困難。強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)中目前僅有GB 4789.42—2016利用實時熒光定量PCR技術(shù)，主要是因為病毒檢測對實驗室能力要求較高，具有這一能力的實驗室在人員、儀器配置上本來就處于國內(nèi)較高水平。而傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比于熒光定量PCR、數(shù)字微滴PCR等技術(shù)，操作簡單，檢測成本也較低，這也是近年來國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)逐漸使用這一技術(shù)的原因。

表1 利用分子生物學(xué)方法原理的部分標(biāo)準(zhǔn)

傳統(tǒng)PCR技術(shù)又可分為多重PCR技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)，與常規(guī)PCR技術(shù)相比，多重PCR技術(shù)同時選擇多個高度保守的基因序列設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，可提高特異性減少假陽性，由于加入多對特異性引物，即可同時在一個反應(yīng)體系中擴(kuò)增出多條目的 DNA 片段，實現(xiàn)了一次性檢測多個基因的目的，可大大節(jié)省時間、費(fèi)用成本，從而在檢測應(yīng)用上具有很好的發(fā)展前景。

2 多重PCR技術(shù)原理

多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是在常規(guī) PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與常規(guī) PCR相同，通過模板 DNA 與引物之間的變性、退火和延伸3個步驟為1個循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA 片段為下次循環(huán)的模板[27]，區(qū)別在于多重PCR技術(shù)在同一個反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，分別擴(kuò)增不同的模板，得到不同的目的片段。

從1988年CHAMBERLIAN等[28]首次提出多重PCR至今，其已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如臨床混合感染的鑒別[29]、病毒檢測[30]、病原微生物檢測[31]、微生物耐藥性檢測[32]等。

3 多重PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，多重PCR在食源性致病菌檢測的應(yīng)用上主要分為兩個方面：同時檢測單一致病菌的不同基因和同時檢測不同致病菌基因。

3.1 同時檢測單一致病菌不同基因的應(yīng)用

單一致病菌的檢測主要是對于一些血清型比較復(fù)雜或者具有多個毒力基因的致病菌，如沙門氏菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭菌、志賀氏菌屬、阪崎腸桿菌等。

由于沙門氏菌屬具有多種血清型，若僅用單對引物對沙門氏菌進(jìn)行檢測，往往不夠準(zhǔn)確，LIM等[33]利用多重PCR技術(shù)，用鼠傷寒沙門氏菌的rfbJ、fljC、fljB基因設(shè)計3對特異引物對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明僅有鼠傷寒沙門氏菌出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，其他的沙門氏菌型和非沙門氏菌均未檢出，3對引物和PCR體系對鼠傷寒沙門氏菌具有很好的特異性。

產(chǎn)氣莢膜梭菌可以分為5型，分別具有不同的毒素組合，用單一的引物對很難避免漏檢情況，李偉杰等[34]利用產(chǎn)氣夾莫菌α、β、ε和ι毒素基因設(shè)計并合成4對特異性引物，通過PCR體系優(yōu)化，建立了一種快速鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型的多重PCR方法，產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D和 E型參考菌株均擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，而其他菌均未擴(kuò)增出條帶，該方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測研究具有很好的參考價值。

為提高志賀氏菌耐藥性和毒性檢測的時效，王倩等[35]根據(jù)福氏志賀菌耐藥性基因gyrA，parC及毒力致病性基因ipaH，分別設(shè)計了3對引物，實現(xiàn)了對福氏志賀菌喹諾酮耐藥決定區(qū)基因、毒力基因的同時檢測。

樓秀芹等[36]分別以阪崎腸桿菌ITS序列、16S rDNA和ompA基因為靶基因，選擇3對引物，對阪崎腸桿菌進(jìn)行多重PCR檢測，檢測靈敏度和特異性均能達(dá)到國標(biāo)方法，但與國標(biāo)方法相比，極大節(jié)約檢驗時間。黎明等[37]以阪崎腸桿菌基因組16SrRNA-23rRNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因和外膜蛋白A(ompA)基因為靶標(biāo)選擇引物，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，該研究結(jié)果顯示，所建立的體系可用于食品中阪崎腸桿菌的檢測。

目前利用多重PCR技術(shù)檢測單一致病菌的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)查閱到2個：SN/T 2565—2010 《食品中志賀氏菌分群檢測 MPCR-DHPLC法》，該標(biāo)準(zhǔn)利用志賀氏菌的ipaH、prpB、wzzB、SHT基因設(shè)計了1對志賀氏菌屬的特異引物和4對志賀氏菌不同血清種的引物，在利用變性高效液相色譜分析法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可同時達(dá)到檢測志賀氏菌屬和區(qū)分志賀氏菌屬中的福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌的目的。SN/T 4603—2016《出口食品及水體中產(chǎn)毒副溶血性弧菌常見致病基因檢測方法 多重PCR及多重實時熒光PCR法》中第一法利用副溶血性弧菌的gyrase、tdh和trh致病基因設(shè)計引物，根據(jù)特異擴(kuò)增條帶的有無，判定樣品中是否含有副溶血性弧菌及產(chǎn)毒副溶血性弧菌。

3.2 同時檢測不同致病菌基因的應(yīng)用

同時檢測不同致病菌基因在食源性致病菌檢測上應(yīng)用也較多，陳偉[38]通過設(shè)計6對特異性引物、DNA 提取方法優(yōu)化、退火溫度和 Mg2+濃度等PCR主要反應(yīng)條件優(yōu)化，分別建立了沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌O157：H7和單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的2個多重PCR檢測體系，其特異性和靈敏度較高，靈敏度達(dá)到皮克(pg)級。郭倩倩[39]根據(jù)沙門氏菌invA、單核細(xì)胞增生李斯特菌的iap、金黃色葡萄球菌的nuc和副溶血性弧菌的tdh分別設(shè)計4對特異性引物，獲得了水產(chǎn)品中致病菌的多重 PCR 檢測。李聰?shù)萚31]以蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌gyrB、nuc、ipaHIII、SiiA設(shè)計的4個引物對，建立了多重PCR方法，該方法具有良好的特異性和靈敏性，可應(yīng)用于食品中蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌的檢測。

目前利用多重PCR技術(shù)同時檢測不同致病菌基因的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有DB22/T 1828—2013《農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測》，DB22/T 1676—2012《凍鮮魷魚多種致病菌的測定 多重PCR法》，以及2020年7月1日實施的SN/T 5225—2019《進(jìn)出口食品中五種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法 多重PCR法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口食品中腸致病性大腸埃希氏菌(EnteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)，腸出血性大腸埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC，又稱產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌)，腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli,ETEC)，腸侵襲性大腸埃希氏菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)，腸集聚性大腸埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)5種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法。

3.3 多重PCR技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用

一些科研機(jī)構(gòu)和公司也在開發(fā)多種食源性致病菌PCR檢測試劑盒，這些試劑盒的使用，可以大大提高食源性致病菌檢測效率。其中使用較多的有5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒，該試劑盒是根據(jù)GB 4789.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》設(shè)計，并在標(biāo)準(zhǔn)中允許使用的商品化試劑盒，該種試劑盒中包含的5種致瀉性大腸桿菌(EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC)含有11種毒力基因，針對這11種毒力基因，設(shè)計11對特異引物，與樣本中基因組的相應(yīng)靶位點特異性結(jié)合，PCR反應(yīng)后，不同類型的樣本產(chǎn)生不同的擴(kuò)增片段，從而達(dá)到對5種致瀉性大腸桿菌快速分型檢測的目的，該試劑盒也與上文中提及的SN/T 5225—2019 《進(jìn)出口食品中五種致瀉大腸埃希氏菌快速檢測方法 多重PCR法》標(biāo)準(zhǔn)原理一致。

另外，還有針對克羅諾桿菌屬檢測的試劑盒研究，周楊等[40]通過篩選獲取克羅諾桿菌的16SrDNA和ompA基因的保守序列，開發(fā)了食品中克羅諾桿菌屬雙重PCR檢測試劑盒，實驗表明該試劑盒滿足各項性能需求，便于對食品中克羅諾桿菌的快速檢測。

在專利申請上，南京美寧康誠生物科技有限公司[41]公開發(fā)明專利《11種腸道致病菌核酸多重PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用》，該專利包括11種腸道致病菌的引物，有霍亂弧菌O1群、霍亂弧菌O139群、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸黏附性大腸埃希氏菌(EAEC)、產(chǎn)毒素大腸埃希氏菌(ETEC)和大腸埃希菌O157:H7的引物，該專利的方法可直接應(yīng)用于腦炎病原體樣本進(jìn)行檢測。北京卓誠惠生生物科技有限公司[42]公開發(fā)明專利《十四種食源性致病菌多重PCR檢測引物組和試劑盒》，該專利試劑盒包含了沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、霍亂弧菌、大腸埃希氏菌O157、嗜水氣單胞菌和陽性內(nèi)對照的引物對。

4 多重PCR檢測應(yīng)用的技術(shù)要點

綜上，多重PCR技術(shù)具有通量高，節(jié)省時間和成本的優(yōu)點，其研究較多，但在各檢驗機(jī)構(gòu)實際開展檢測的應(yīng)用并不多，僅查閱到5個相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，商業(yè)化應(yīng)用也較少，目前僅有5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒應(yīng)用較好，雖有相關(guān)的專利申請，但真正用于市場上銷售，檢驗機(jī)構(gòu)可以使用的試劑盒也不多，這主要是由于多重PCR檢測中存在以下技術(shù)難點：(1)PCR體系和PCR條件比常規(guī)PCR較嚴(yán)苛，需要不斷摸索和優(yōu)化，多重PCR體系實驗穩(wěn)定性還有待提高；(2)多重PCR體系中同時存在多對引物和多種DNA模板，引物和引物之間，引物和模板之間容易互相干擾，如果引物設(shè)計不當(dāng)、PCR體系中各種物質(zhì)濃度選擇不當(dāng)、PCR條件不合適等因素中有一個不合適，都可以引起擴(kuò)增失敗或者特異性、靈敏度降低，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。

因此，在應(yīng)用多重PCR技術(shù)時，必須有嚴(yán)密的實驗計劃，首先從引物設(shè)計開始，就必須考慮引物之間的干擾、互補(bǔ)，PCR產(chǎn)物條帶大小，各對引物的退火溫度差異等問題；其次是PCR體系優(yōu)化，其中引物濃度、DNA模板濃度、Mg2+濃度等重要影響因素需有適合的實驗方案來進(jìn)行優(yōu)化；最后PCR條件中的退火溫度也需要不斷進(jìn)行實驗優(yōu)化。

5 前景與展望

多重 PCR 技術(shù)的應(yīng)用雖然受到技術(shù)難點的制約，但其在食源性致病菌檢測中具有的高通量性、成本節(jié)約性優(yōu)勢，在實際檢測中具有很好的發(fā)展前景，結(jié)合現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，多重PCR技術(shù)未來的研究可主要集中在以下幾個方面：(1)多重PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測時，一般需要12～24 h的前增菌，這一步嚴(yán)重影響了多重PCR檢測效率，因此后期研究中可以結(jié)合目標(biāo)菌的富集技術(shù)，以提高檢測效率，如有研究者開始研究磁珠富集[43]和雙抗體富集技術(shù)[44]等；(2)在實際檢測中，應(yīng)不斷增加多重PCR體系中引物對數(shù)量，以達(dá)到更高的檢測通量，并加強(qiáng)研究與食源性致病菌檢測標(biāo)準(zhǔn)或國家抽檢要求相一致的菌種，以提高多重PCR技術(shù)在實際檢測中的應(yīng)用；(3)隨著多重PCR體系中引物對的增加，PCR產(chǎn)物條帶數(shù)的不斷增加，為后續(xù)產(chǎn)物分離帶來了難點，因此多重PCR技術(shù)也可以結(jié)合除電泳技術(shù)以外的產(chǎn)物分離檢測技術(shù)，如結(jié)合現(xiàn)有發(fā)展比較成熟的液相、液質(zhì)技術(shù)等。