基于酶輔助靶標循環(huán)的適體傳感器靈敏檢測中藥中黃曲霉毒素B1

吳 昊，吳 軍，王洪勇，劉婭靈，韓國慶， 李文超，施青云，鄒 霈,2*

(1.國家衛(wèi)健委核醫(yī)學重點實驗室 江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室 江蘇省原子醫(yī)學研究所，江蘇 無錫 214063；2.南京醫(yī)科大學 藥學院，江蘇 南京 211166)

黃曲霉毒素(AFT)是一類由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的帶有雙呋喃環(huán)和香豆素結構的毒素[1]，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，是目前已知致癌性最強的天然毒素[2]，1993年被國際癌癥研究機構(IARC)劃定為1類致癌物[3]。中藥材在生產、加工、貯藏、運輸等過程中，受溫度或濕度的變化極易發(fā)生霉變而污染黃曲霉毒素。《中國藥典》2020版收載了24種中藥材中黃曲霉毒素殘留的限量檢測，規(guī)定其中AFB1的含量不得高于5 μg/kg。通過文獻調研發(fā)現(xiàn)中藥材或中藥飲片中受黃曲霉毒素污染的情況十分普遍。楊美華等[4]檢測了14種中藥材的29批樣品，發(fā)現(xiàn)被AFB1污染的有12批，含量最高達32.18 μg/kg。沈緊治等[5]對35種中藥飲片中AFB1的含量進行測定，結果有17種中藥飲片被AFB1污染。趙祥升等[6]整理并分析了2000年以來中藥中AFB1檢測呈陽性結果的文獻，統(tǒng)計顯示149種中藥的1 168批樣品中檢出AFB1，陽性樣品超標率達52.40%。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS)[9]等。這些方法定量準確、靈敏度高、抗干擾性強，但成本高昂、操作繁瑣、費時耗力，不利于中藥中黃曲霉毒素的快速檢測，難以普及[10]。近年新發(fā)展起來的核酸信號放大技術，無論在儀器要求還是實際操作方面，均比傳統(tǒng)檢測技術有了長足的進步，不僅擺脫了對精良設備的依賴，操作上也更為簡單方便。酶輔助靶標循環(huán)信號放大技術是基于核酸內切酶/核酸外切酶水解方式的差異性與核酸適配體技術、酶切循環(huán)效應、納米技術、熒光標記技術等相結合，發(fā)展而成的一種等溫核酸信號放大技術[11]。它具有反應條件溫和、信號放大效率高、能在恒溫條件下進行等優(yōu)點。酶輔助靶標循環(huán)信號放大技術結合熒光[12]、比色[13]、化學發(fā)光[14]和電化學發(fā)光[15]等檢測技術可以實現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測。

G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶是一種由富含鳥嘌呤堿基G的核酸四鏈體和氯化血紅素(Hemin)形成的生物催化DNA酶[16]。它具有類似辣根過氧化物酶(HRP)的活性，可以在氯化血紅素作用下催化H2O2介導的多種底物的氧化，如3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)[17]。與其他DNA酶或蛋白酶相比，G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶因具有制備成本較低、不易水解、易于修飾以及熱穩(wěn)定性較高等明顯優(yōu)勢[18]，被廣泛用于核酸[19]、蛋白質[20]、金屬離子[21]和小分子[22]的高靈敏檢測。

本文結合酶輔助靶標循環(huán)信號放大技術和G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶，構建了一種簡單、靈敏、低成本的免標記化學發(fā)光適體傳感器。利用適體特異性結合目標AFB1，核酸外切酶I (Exo I)特異性地剪切單鏈DNA的特性[23]，所構建的酶輔助靶標循環(huán)信號放大策略實現(xiàn)了目標AFB1的循環(huán)再利用，極大地提高了適體傳感器的檢測靈敏度。同時，G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶被巧妙地編碼到發(fā)夾探針中用作化學發(fā)光的信號分子，避免了發(fā)夾探針的熒光標記和化學修飾。該適體傳感器制備成本低，操作簡單，對AFB1的檢測靈敏度高、線性范圍寬，并成功地應用于中藥材樣品中AFB1的測定，顯示了良好的應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SpectraMax M5e多功能酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；PHSJ-3F型精密酸度計(上海雷磁儀器有限公司)；Eppendorf 5417R小型臺式冷凍型離心機(艾本德中國有限公司)；HS3120D超聲波清洗器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)購自中國廣州分析測試中心科力技術開發(fā)公司；DEPC處理水和核酸外切酶I(Exo I)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；10×NEBuffer 3.1購自紐英倫生物技術(北京)有限公司；三(羥甲基-1)氨基甲烷(Tris)、2-(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基)乙磺酸(HEPES)、3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾)、氯化血紅素和H2O2購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；當歸、黨參和黃芪購自無錫市中醫(yī)院。本文所用寡核苷酸由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其序列(見圖1A)的顏色與圖1B中的顏色相同。

1.2 發(fā)夾探針H1、H2和適體探針H1-S1的制備

發(fā)夾探針H1和H2：將寡核苷酸H1和H2的粉末以12 000 r/min離心5 min，分別加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.4)配成10 μmol/L標準儲備液。將H1和H2的儲備液分別加熱至95 ℃，保持10 min后，緩慢冷卻至室溫以形成發(fā)夾結構，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

適體探針H1-S1：將寡核苷酸S1的粉末以12 000 r/min離心5 min，加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液配成10 μmol/L標準儲備液。將50 μL 10 μmol/L H1和50 μL 10 μmol/L S1混合，37 ℃孵育30 min，待H1和S1充分雜交后得到適體探針H1-S1的標準儲備液，濃度為5 μmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核酸外切酶I輔助的靶標循環(huán)

將8 μL 1 μmol/L適體探針H1-S1、1 μL一定濃度的AFB1和1 μL 10 U/μL核酸外切酶I依次加入40 μL 1×NEBuffer 3.1緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA，pH 7.9)中，37 ℃孵育60 min。然后，將反應液加熱至80 ℃，保持15 min使核酸外切酶I失活，自然冷卻至室溫。再加入10 μL 1 μmol/L發(fā)夾探針H2和40 μL 1×NEBuffer 3.1緩沖液，37 ℃孵育30 min，自然冷卻后得到酶輔助靶標循環(huán)的反應產物。

1.4 G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶的制備及化學發(fā)光檢測

將10 μL 2 μmol/L氯化血紅素和40 μL 25 mmol/L HEPES緩沖液(200 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl，1%二甲基亞砜，pH 7.4) 加入上述反應產物中，室溫孵育60 min以形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。然后加入25 μL 1 mmol/L魯米諾和25 μL 1 mmol/L H2O2，最終體積為200 μL。使用SpectraMax M5e多功能酶標儀記錄各樣品溶液的化學發(fā)光信號強度，檢測步長設為2 nm，收集380 ～510 nm范圍內的化學發(fā)光光譜，最大發(fā)射波長為418 nm。

2 結果與討論

2.1 傳感器的檢測原理

圖1B為基于酶輔助靶標循環(huán)的適體傳感器檢測AFB1的原理圖。如圖所示，該適體傳感器主要由適體探針H1-S1、發(fā)夾探針H2、核酸外切酶I、氯化血紅素、魯米諾和H2O2組成。適體探針H1-S1和發(fā)夾探針H2均含有一段G-四鏈體序列(共18個堿基)，一部分位于發(fā)夾的環(huán)狀區(qū)(12個堿基)，另一部分位于發(fā)夾的莖稈區(qū)(6個堿基)。當適體探針和發(fā)夾探針未打開時，該段序列不能折疊成G-四鏈體結構，因而不能結合氯化血紅素形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。

當體系中不存在目標AFB1時，適體探針H1-S1和核酸外切酶I兩者穩(wěn)定共存，彼此不發(fā)生相互作用。這是因為適體探針H1-S1的末端是完全匹配的雙鏈結構，而核酸外切酶I是單鏈特異性外切酶，不分解雙鏈DNA。將核酸外切酶I滅活后，加入發(fā)夾探針H2，適體探針H1-S1的末端因完全匹配的雙鏈結構同樣不會和H2發(fā)生作用，使得兩個探針在體系中共存。由于適體探針和發(fā)夾探針未打開，加入氯化血紅素不會形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶，整個體系的化學發(fā)光信號可忽略不計。當體系中存在目標AFB1時，由于適體和靶標間的高親和性，適體序列S1從適體探針H1-S1上脫離并與AFB1結合形成復合物AFB1-S1，適體探針H1-S1變?yōu)榘l(fā)夾探針H1。核酸外切酶I具有從3′-5′方向降解單鏈DNA的外切酶活性，能識別復合物AFB1-S1并逐步催化降解適體序列S1，釋放出目標AFB1[24]。釋放的AFB1可以結合一個新的適體探針形成復合物，接著再次被核酸外切酶I剪切后釋放，不斷循環(huán)參與結合/剪切反應，構成酶輔助的靶標循環(huán)(Cycle)。在靶標不斷循環(huán)的過程中，生成了大量的發(fā)夾探針H1。這些發(fā)夾探針具有單鏈的3′-末段支臂，同樣被核酸外切酶I剪切，而單鏈的5′-末段支臂未被剪切得以保留。核酸外切酶I滅火處理后，加入發(fā)夾探針H2與帶有5′-末段單鏈支臂的發(fā)夾探針H1結合，生成復合物H1-H2。兩個探針的發(fā)夾結構被打開，暴露出完整的G-四鏈體序列。G-四鏈體序列進一步折疊成G-四鏈體結構，并結合氯化血紅素形成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。這些DNA酶可以催化氧化魯米諾-H2O2化學發(fā)光體系，產生化學發(fā)光信號，從而實現(xiàn)AFB1的放大檢測。

圖1 3種核苷酸的序列(A)以及基于酶輔助靶標循環(huán)的適體傳感器檢測AFB1的原理圖(B)Fig.1 Sequences of three oligonucleotides(A) ,and schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor based on enzyme-assisted target recycling(B)

2.2 傳感器的信號放大效果

為了驗證酶輔助靶標循環(huán)策略的信號放大效果，在適體傳感器的設計上移除了核酸外切酶I，從而構建了無信號放大的適體傳感器(圖2)。如圖2A所示，該適體傳感器主要由適體探針H1-S1、發(fā)夾探針H2、氯化血紅素、魯米諾和H2O2組成。同樣地，當不存在目標AFB1時，兩個探針在體系中穩(wěn)定共存，彼此不發(fā)生相互作用。

圖2 無信號放大的適體傳感器檢測AFB1的原理圖(A)，以及無信號放大的適體傳感器和酶輔助 靶標循環(huán)的適體傳感器對同一濃度AFB1的化學發(fā)光響應圖(B)Fig.2 Schematic diagram of AFB1 detection by aptasensor without signal amplification (A),and chemiluminescence responses of the aptasensor without signal amplification and the aptasensor with enzyme-assisted target recycling to the same concentration of AFB1 (B)

當存在目標AFB1時，適體序列S1和目標AFB1結合形成復合物AFB1-S1并從適體探針H1-S1上脫離，適體探針H1-S1變?yōu)榘l(fā)夾探針H1，并進一步與發(fā)夾探針H2進行雜交形成復合物H1-H2，導致發(fā)夾結構被打開并暴露出完整的G-四鏈體序列。G-四鏈體序列進一步折疊成G-四鏈體結構，并結合氯化血紅素生成G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶。這些DNA酶催化氧化魯米諾-H2O2化學發(fā)光體系，產生化學發(fā)光信號。圖2B是無信號放大的適體傳感器和酶輔助靶標循環(huán)的適體傳感器對同一濃度AFB1(100 ng/mL)的化學發(fā)光響應圖。在無目標AFB1的情況下，兩種傳感器均顯示出較低的化學發(fā)光響應(曲線a和b)。這說明適體探針H1-S1在溶液中既不會被核酸外切酶I剪切，也不會和發(fā)夾探針H2雜交。加入目標AFB1后，無信號放大的傳感器可檢測到1個明顯的化學發(fā)光信號(曲線c)。據文獻報道，在生物傳感器構建過程中引入信號放大策略可顯著提高檢測靈敏度[25]。正如預期，采用酶輔助靶標循環(huán)信號放大策略構建的適體傳感器的化學發(fā)光信號(曲線d)明顯強于無信號放大的適體傳感器，信號增強了74.43%，表明所構建的適體傳感器具有良好的信號放大效果。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 適體探針H1-S1濃度的優(yōu)化考察了不同濃度(20、30、40、50、60 nmol/L)適體探針H1-S1對AFB1檢測的影響。結果顯示，在適體探針濃度為40 nmol/L時，體系的化學發(fā)光強度比值I/I0最大，其中I和I0分別表示存在和不存在AFB1時的化學發(fā)光強度(λem=418 nm)。因此選擇適體探針H1-S1的最佳濃度為40 nmol/L。

2.3.2 核酸外切酶I用量的優(yōu)化考察了不同核酸外切酶I用量(6、8、10、12、14 U)對AFB1檢測的影響。結果顯示，隨著核酸外切酶I用量的增加，體系的化學發(fā)光強度逐漸增加，但變化不大?？紤]到核酸外切酶I的性價比，選擇核酸外切酶I的最佳用量為10 U。

2.3.3 靶標循環(huán)反應時間的優(yōu)化考察了不同靶標循環(huán)反應時間(40、50、60、70、80 min)對AFB1檢測的影響。結果顯示，隨著反應時間的增加，體系的化學發(fā)光強度迅速增加然后趨于平緩，60 min后進入平臺期。因此選擇靶標循環(huán)反應時間為60 min。

2.3.4 適體探針H2濃度的優(yōu)化考察了不同濃度(30、40、50、60、70 nmol/L)發(fā)夾探針H2對AFB1檢測的影響。結果顯示，加入50 nmol/L發(fā)夾探針H2時，體系的化學發(fā)光強度比值最大。因此選擇發(fā)夾探針H2的最佳濃度為50 nmol/L。

2.4 黃曲霉毒素B1的檢測

為了考察所構建適體傳感器的檢測性能，在最佳實驗條件下，測試了該適體傳感器對不同質量濃度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL) AFB1的化學發(fā)光響應。如圖3A所示，隨著目標AFB1質量濃度在0～100 ng/mL范圍內增加，其化學發(fā)光強度也相應增加。從圖3B可以看出，化學發(fā)光強度與AFB1質量濃度呈指數對應的關系。此外，由插圖可見，當AFB1質量濃度在0.001～100 ng/mL范圍內時，化學發(fā)光強度(I)與AFB1質量濃度的對數(lgC)呈良好的線性關系，其線性方程為I=42 952+10 888lgC，相關系數(r2)為0.995 5。以3倍信噪比(S/N=3)計算得到AFB1的檢出限為0.93 pg/mL。

2.5 特異性實驗

特異性是衡量傳感器性能的重要指標。選擇黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)作為潛在的干擾物質(圖4A為其化學結構式)，考察了適體傳感器的特異性。由圖4B可見，ZEN和OTA的化學發(fā)光信號和空白(Blank) 的化學發(fā)光信號無明顯差異。AFB2、AFG1、AFM1與AFB1的分子結構相似，雖然同屬于黃曲霉毒素家族，但其化學發(fā)光信號強度僅略高于ZEN和OTA，而目標AFB1的化學發(fā)光信號明顯增強。結果表明所構建的適體傳感器對AFB1具有良好的特異性。進一步使用無信號放大的適體傳感器對同濃度的干擾物質進行特異性實驗。通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，采用信號放大策略的適體傳感器的IAFB1/IAFB2比值顯著高于無信號放大的適體傳感器的比值，表現(xiàn)出更為優(yōu)良的特異性。這是因為在適體本身高特異性的基礎上，信號放大策略可以進一步放大同家族成員間的差異，導致IAFB1/IAFB2比值升高。因此，該適體傳感器的優(yōu)良特異性可歸因于適體和靶標分子間的高特異性與酶輔助靶標循環(huán)策略的高信號放大效率。

2.6 中藥材樣品中AFB1的檢測

選取當歸、黨參和黃芪3種中藥材作為實際樣品，采用標準加入法進行回收率實驗，以評估適體傳感器對實際樣品的檢測能力。準確稱取2 g中藥材樣品，加入5 mL甲醇-水(體積比6∶4)萃取液，浸泡60 min后超聲處理45 min，然后將混合物以3 000 r/min離心5min。提取1 mL上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，用1×NEBuffer 3.1緩沖液定容至10 mL。將3種質量濃度水平(1、10、100 ng/mL)的AFB1加標至稀釋的樣品溶液中進行回收率實驗，每個質量濃度平行測定3次。計算得AFB1的回收率為93.7%～107%，相對標準偏差(RSD)為3.7%～6.4%，表明所構建的適體傳感器可用于中藥材樣品中AFB1的檢測。

3 結 論

本文基于酶輔助靶標循環(huán)信號放大策略成功構建了一種用于AFB1高靈敏檢測的適體傳感器。所設計的適體探針和發(fā)夾探針，以G-四鏈體/氯化血紅素DNA酶為信號分子，無需任何化學修飾和熒光標記，制備成本低。整個反應在等溫均一的溶液中進行，無需復雜的分離程序和耗時的熱循環(huán)，操作簡單。該適體傳感器對AFB1的檢測靈敏度高、線性范圍寬、特異性好，并成功地應用于中藥材樣品中AFB1的測定。