基于MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)分析蓮子中代謝物的組織分布

孫成龍，劉 偉，郭蘭萍，王 曉*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省 分析測(cè)試中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014； 3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700)

蓮子為睡蓮科(Nymphaeaceae)植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的成熟種子，性平，味甘，有補(bǔ)脾止瀉、益腎固精、養(yǎng)心安神的功效，主要用于脾虛久瀉、遺精帶下、心悸失眠[1]。目前，已被列入國(guó)家衛(wèi)計(jì)委公布的藥食兩用中藥名單和可用于保健食品的中藥名單。蓮子心為蓮子中間的幼葉及胚根，性寒、味苦，有清心安神、交通心腎、澀精止血的功效，用于治療熱入心包、神昏譫語、心腎不交、失眠遺精和血熱吐血[1-2]。開展對(duì)蓮子及蓮子心化學(xué)成分的研究，對(duì)于闡明其藥效學(xué)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用多種現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)蓮子及蓮子心的化合物進(jìn)行了深入表征。除了藥理作用顯著的生物堿類和黃酮類化合物外，蓮子及蓮子心還含有氨基酸、脂肪酸、糖苷、蛋白質(zhì)等多類化合物[3-5]。目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因靈敏度高、特異性好、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)勢(shì)，已成為藥用植物中化學(xué)成分分析最常用的工具。然而，該技術(shù)的代謝物提取、純化和富集等前處理過程嚴(yán)重破壞了代謝物在組織中的空間分布信息，無法實(shí)現(xiàn)代謝物的原位分析。

基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜成像(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI)作為一種新型的分子影像技術(shù)，能夠直接從組織表面獲得大量已知或未知化合物的含量和空間分布信息[6-11]。目前，MALDI及其相關(guān)質(zhì)譜成像技術(shù)已被成功用于以下方面：①可視化表征植物中代謝物的空間分布特征[12-14]；②探索植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的代謝機(jī)制[15-16]；③揭示植物次生代謝物生成、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯藏的時(shí)-空代謝規(guī)律[17-18]。本研究通過優(yōu)化MALDI基質(zhì)，建立了一種可對(duì)蓮子中化合物進(jìn)行高覆蓋可視化分析的質(zhì)譜成像方法，實(shí)現(xiàn)了蓮子中生物堿類、黃酮類、氨基酸類、脂肪酸類、有機(jī)酸類、膽堿類、磷脂類等多種化合物的組織原位可視化表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Rapiflex MALDI-TOF/TOF型質(zhì)譜成像儀(德國(guó)Bruker公司，配flexAnalysis數(shù)據(jù)處理工作站)，HTX TM-SprayerTM型基質(zhì)噴涂?jī)x(美國(guó)HTX科技公司)，氧化銦錫(ITO)導(dǎo)電載玻片(對(duì)角線電阻約40 Ω，德國(guó)Bruker公司)，真空干燥器(上海越磁電子科技有限公司)，Thermo CryoStar NX50 NOVPD切片機(jī)(美國(guó)熱電公司)，SCiLS Lab 2018b質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)分析軟件(德國(guó)GmbH公司)。

1,5-二羥基苯甲酸(DHB，純度>99.0%)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA，純度>99.0%)、9-氨基吖啶(9-AA，純度>99.5%)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，蓮心堿(純度>99.0%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，棕櫚酸(純度≥97.5%)、蘋果酸(純度≥99.0%)購(gòu)于北京百靈威科技有限公司，1,5-二氨基萘(1,5-DAN，純度≥98.0%)、N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDC，純度≥98.0%)、精氨酸(純度≥99.0%)購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司，乙腈(質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司)，OCT包埋劑(美國(guó)櫻花SAKURA公司)。

1.2 樣品制備

將新鮮蓮子置于冷凍切片機(jī)內(nèi)30 min(-25 ℃)，用OCT包埋劑將冰凍好的蓮子固定于切片機(jī)樣品托上，制作厚度為20 μm的蓮子冰凍組織切片(切片包括蓮子胚芽、胚軸、胚根、子葉及種皮部分)。將制作好的組織切片轉(zhuǎn)移到ITO導(dǎo)電載玻片上，在自制的真空干燥器中抽真空20 min備用。

1.3 基質(zhì)噴涂

精密稱量1,5-DAN 基質(zhì)25 mg，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL乙腈-水(50∶50，體積比)溶液，超聲5 min備用。將真空抽干的蓮子組織切片固定于基質(zhì)噴涂?jī)x中，進(jìn)行基質(zhì)噴涂。噴涂程序設(shè)置：基質(zhì)溶液流速為0.075 mL/min，噴嘴溫度為60 ℃，噴嘴移動(dòng)速度為800 mm/min，噴嘴移動(dòng)行間距為3 mm，噴嘴與樣品間距為3 cm，噴涂循環(huán)次數(shù)為8次，1,5-DAN基質(zhì)在組織切片上的噴涂密度約為0.73 μg/mm2。噴涂完畢的組織切片準(zhǔn)備進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。

1.4 MALDI質(zhì)譜成像分析

將噴涂基質(zhì)的組織切片置于Bruker Rapiflex MALDI-TOF/TOF型質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)譜成像分析。該儀器配備smartbeamTM3D激光，使用波長(zhǎng)為355 nm，采樣頻率為5 000 Hz，激光能量設(shè)置為65%。MALDI質(zhì)譜成像分別在正離子和負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行，檢測(cè)的質(zhì)荷比(m/z)范圍為80～1 000，樣品掃描的空間分辨率為100 μm。MALDI質(zhì)譜數(shù)據(jù)先用Data Analysis 4.0 軟件進(jìn)行初步預(yù)處理，進(jìn)一步采用SCiLS Lab 2018b軟件進(jìn)行質(zhì)譜成像圖構(gòu)建。

2 結(jié)果與討論

2.1 MALDI基質(zhì)的選擇

進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析時(shí)，不同基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的解吸效率有顯著差異，基質(zhì)自身的質(zhì)譜信號(hào)也可能干擾待測(cè)物的分析。因此，基質(zhì)的選擇對(duì)分析物的離子化起著至關(guān)重要的作用。前期研究表明[3-5]，蓮子及蓮子心中含有生物堿類、黃酮類、脂肪酸類、氨基酸類、磷脂類等多種化合物，復(fù)雜的化合物組分對(duì)于MALDI基質(zhì)的選擇提出了挑戰(zhàn)。生物堿類、磷脂類等化合物易在正離子模式下檢出，而黃酮類、脂肪酸類化合物則更適合負(fù)離子模式檢測(cè)。本研究以蓮心堿、精氨酸、棕櫚酸、蘋果酸為代表性代謝物進(jìn)行MALDI基質(zhì)優(yōu)化，配制固定濃度的4種對(duì)照品溶液，將對(duì)照品溶液與不同基質(zhì)溶液按照1∶1的體積比混合均勻，然后滴加到樣品靶板上。干燥后進(jìn)行MALDI-MS分析，提取對(duì)照品的離子強(qiáng)度進(jìn)行比較。在正離子檢測(cè)模式下，對(duì)3種常用基質(zhì)(DHB、CHCA、1,5-DAN)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明以1,5-DAN為基質(zhì)時(shí)分析物的相對(duì)峰強(qiáng)度更高(圖1A)。在負(fù)離子檢測(cè)模式下，對(duì)3種常用基質(zhì)(9-AA、NEDC、1,5-DAN)進(jìn)行了比較，結(jié)果同樣表明以1,5-DAN為基質(zhì)時(shí)分析物的相對(duì)峰強(qiáng)度更高(圖1B)。因此本研究在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下均選擇1,5-DAN作為蓮子MALDI質(zhì)譜成像的基質(zhì)。

2.2 不同種類代謝物在蓮子中的組織分布特征

2.2.1 生物堿類化合物的分布特征蓮子中化學(xué)成分的研究集中于生物堿類化合物，主要包括：以蓮心堿(Liensinine)和異蓮心堿(Isoliensinine)為代表的雙芐基異喹啉類生物堿；以衡州烏藥堿(Coclaurine)和去甲基衡州烏藥堿(Norcoclaurine)為代表的單芐基異喹啉類生物堿；以北美鵝掌楸尼定堿(Lirinidine)和荷葉堿(Nuciferine)為代表的阿樸啡類生物堿。作為蓮子及蓮子心的主要藥效成分，生物堿類化學(xué)物具有顯著的抗心律不齊、降血壓和抗癌作用。生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物，通常在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。在優(yōu)化條件下，將制作好的蓮子組織切片噴涂基質(zhì)后進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。在SCiLS Lab 2018b軟件中靶向提取生物堿類化合物的[M+H]+離子峰進(jìn)行質(zhì)譜成像圖構(gòu)建，其中代表性生物堿類化合物的質(zhì)譜成像圖如圖2所示。結(jié)果表明，雙芐基異喹啉類生物堿：蓮心堿和異蓮心堿([M+H]+，m/z611.3)幾乎只分布于蓮子胚芽中(圖2B)；去甲基蓮心堿(Norisoliensinine，[M+H]+，m/z597.3)同樣主要分布于蓮子胚芽中，但在蓮子子葉中也有少量分布(圖2C)。單芐基異喹啉類生物堿：衡州烏藥堿([M+H]+，m/z286.1，圖2D)和去甲基衡州烏藥堿([M+H]+，m/z272.1，圖2E)主要分布在蓮子胚芽中，在蓮子子葉中也有一定的分布。之前的研究顯示，阿樸啡類生物堿主要集中在荷葉中，在蓮子中的含量較低[1]；本研究結(jié)果表明，阿樸啡類生物堿：包括北美鵝掌楸尼定堿([M+H]+，m/z282.1，圖2F)和荷葉堿([M+H]+，m/z296.2，圖2G)在蓮子胚芽、胚軸和子葉中均有分布。

圖2 蓮子中代表性生物堿類化合物的質(zhì)譜成像圖Fig.2 MS images of representative alkaloids in lotus seed

2.2.2 黃酮類化合物的分布特征黃酮類化合物是蓮子中另一類重要的藥效成分，其具有很強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤活性。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，黃酮類化合物更適合在負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析[17]。本實(shí)驗(yàn)制作了蓮子的相鄰組織切片，在負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析，其中代表性黃酮類化合物的質(zhì)譜成像結(jié)果如圖3A所示。非常值得關(guān)注的是，黃酮類化合物如山萘酚3-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside，[M-H]-，m/z447.1)和槲皮素3-O-半乳糖苷(Quercetin 3-O-galactoside，[M-H]-，m/z463.1)等除了在蓮子胚芽中的含量較高外，還特異地分布在蓮子種皮中。由此推測(cè)，蓮子中黃酮類化合物主要在蓮子胚芽和種皮中合成和貯藏。

圖3 蓮子中代表性黃酮類(A)、氨基酸類(B)、脂肪酸類(C)、有機(jī)酸類(D)、膽堿類(E)、 磷脂類(F)化合物的質(zhì)譜成像圖Fig.3 MS images of representative flavonoids(A)，amino acids(B)，fatty acids(C)，organic acids(D)，cholines(E) and phospholipids(F) in lotus seed

2.2.3 氨基酸類化合物的分布特征氨基酸是植物中一類重要的初生代謝物，在植物生物和非生物脅迫反應(yīng)調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物能量代謝、植物次生代謝物合成等過程中發(fā)揮著極其重要的作用。堿性氨基酸側(cè)鏈常含有堿性化學(xué)基團(tuán)，更適合在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析；而酸性氨基酸側(cè)鏈常含有酸性化學(xué)基團(tuán)，更適合在負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。精氨酸除了作為一種重要的氮素貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供植物再利用外，還是植物合成NO和多胺等信使分子的前體物質(zhì)。本研究表明，蓮子中精氨酸(Arginine，[M+H]+，m/z175.1)主要分布在蓮子子葉的頂部，在蓮子胚軸和胚根部位也有較高的分布(圖3B1)。植物中至少有25%的光合產(chǎn)物儲(chǔ)存在由苯丙氨酸衍化而來的苯丙烷類化合物中。另外，從碳流的角度來看，苯丙氨酸代謝通路是植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)最重要的通路之一。本研究中，MALDI質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)顯示蓮子中苯丙氨酸(Phenylalanine，[M-H]-，m/z164.1)主要分布在蓮子子葉的頂部及外周部，在蓮子胚中的分布較少(圖3B2)。綜上，推測(cè)蓮子子葉的頂部和外周部位是蓮子儲(chǔ)存能量、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫、合成次生代謝物的主要部位。

2.2.4 脂肪酸類化合物的分布特征脂肪酸作為細(xì)胞基本成分之一，具有重要的生理作用。它們既參與細(xì)胞膜的構(gòu)成，又可為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，同時(shí)還是一些信號(hào)分子的前體物質(zhì)。在負(fù)離子檢測(cè)模式下，對(duì)蓮子切片進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。靶向提取代表性脂肪酸的質(zhì)譜成像圖，發(fā)現(xiàn)盡管脂肪酸類化合物在蓮子中的含量非常豐富，但在蓮子種皮、胚芽、胚軸、胚根及子葉等不同組織部位的分布差異不明顯。代表性脂肪酸類化合物棕櫚酸(Palmitic acid，[M-H]-，m/z255.2，圖3C1)和亞油酸(Linoleic acid，[M-H]-，m/z279.2，圖3C2)在蓮子中的組織分布見圖3C，可見其除了在蓮子子葉底部分布稍多之外，在其它組織區(qū)域中無明顯的分布差異。

2.2.5 有機(jī)酸類化合物的分布特征小分子有機(jī)酸是植物中另一類重要的酸性代謝物，它們?cè)谥参锬芰看x、植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。例如，蘋果酸廣泛參與植物的光合作用和呼吸作用；咖啡酸是一種常見的植物酚酸，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保肝等生物活性。代表性有機(jī)酸類化合物的質(zhì)譜成像結(jié)果如圖3D所示，結(jié)果表明蘋果酸(Malic acid，[M-H]-，m/z133.0)在蓮子子葉底部的含量最高，在蓮子子葉中間部位的含量稍低，在蓮子子葉頂部的含量最低(圖3D1)?？Х人?Caffeic acid，[M-H]-，m/z179.0)主要分布在蓮子子葉的四周(圖3D2)。

2.2.6 膽堿類化合物的分布特征膽堿除了是植物甘油磷脂酰膽堿(卵磷脂)合成的重要前體物質(zhì)外，還可提高植物中可溶性糖及游離氨基酸的含量。由于結(jié)構(gòu)中含有季銨基團(tuán)，膽堿類化合物非常適合在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。從代謝通路上，膽堿是甘油磷酸膽堿的代謝產(chǎn)物，在甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域6(GDPD6)的催化下，甘油磷酸膽堿可代謝為膽堿、磷酸和甘油。代表性膽堿類化合物的質(zhì)譜成像結(jié)果如圖3E所示，結(jié)果表明膽堿(Choline，[M]+，m/z104.1)主要分布在蓮子胚芽和子葉的底部(圖3E1)。與之相反，甘油磷酸膽堿(Glycerophosphocholine，[M+H]+，m/z258.1)則更多地分布在蓮子子葉的頂部(圖3E2)。

2.2.7 磷脂類化合物的分布特征磷脂是細(xì)胞生物膜系統(tǒng)的主要組成成分，此外還在植物細(xì)胞能量供應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。其中，甘油磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)結(jié)構(gòu)中含有季銨基團(tuán)，更適合在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析；而甘油磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)更適合在負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行MALDI質(zhì)譜成像分析。本研究制作了相鄰的蓮子組織切片，分別在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下進(jìn)行質(zhì)譜成像分析。代表性磷脂分子的質(zhì)譜成像結(jié)果如圖3F所示，甘油磷脂酰膽堿-C38∶5(PC-38∶5，[M+Na]+，m/z846.5)在蓮子子葉中的含量遠(yuǎn)高于蓮子胚(圖3F1)；甘油磷脂酰乙醇胺-C36∶2(PE-36∶2，[M-H]-，m/z742.5，圖3F2)在蓮子子葉中的含量遠(yuǎn)高于蓮子胚。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化基質(zhì)，本文建立了一種高覆蓋的MALDI質(zhì)譜成像方法，實(shí)現(xiàn)了蓮子中生物堿類、黃酮類、氨基酸類、脂肪酸類、膽堿類、有機(jī)酸類、磷脂類等多種化合物的組織原位可視化表征。不同化合物在蓮子中的分布特征有較大差異，其中：生物堿類化合物集中分布在蓮子胚芽中；黃酮類化合物在蓮子胚芽和種皮中的含量較高；氨基酸類化合物在蓮子子葉中的含量顯著高于蓮子胚；脂肪酸類化合物在蓮子不同組織區(qū)域中的含量分布差異很??；膽堿類化合物在蓮子胚芽和蓮子子葉底部的含量更高，甘油磷酸膽堿在蓮子子葉頂部的含量更高；有機(jī)酸類代謝物和絕大多數(shù)磷脂類化合物在蓮子子葉中的含量高于蓮子胚。本研究首次可視化地表征了不同化合物在蓮子不同組織區(qū)域的空間分布特征，為研究蓮子及蓮子心藥物質(zhì)量、探究蓮子中化合物的時(shí)-空代謝網(wǎng)絡(luò)、揭示蓮子應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的代謝機(jī)制提供了新的技術(shù)支持。