不同齦下菌斑清除方式對齦溝液中細(xì)胞凋亡因子、炎癥因子及MMPs/TIMPs平衡的影響

張莉 李衛(wèi)民

慢性牙周炎約占牙周炎患者的95%以上，由牙齦炎過渡所致，主要病理表現(xiàn)包括牙周袋形成、牙槽骨吸收，晚期可出現(xiàn)牙齒松動及移位，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。齦下菌斑形成是牙周疾病發(fā)生的重要基礎(chǔ)[3]，及時清除齦下菌斑、抑制菌斑所致牙周炎癥，是目前慢性牙周炎治療的可靠方法，但具體操作方法的選擇仍存在爭議。手器刮治是齦下菌斑清除的傳統(tǒng)方式，操作便捷但是術(shù)后殘留菌斑發(fā)生率較高[4]。噴砂刮治屬于新型菌斑清除方式，具有高效、菌斑清除徹底等優(yōu)勢[5]。為了選擇慢性牙周炎齦下菌斑清除的最優(yōu)方式，本研究將2 種治療方法用于臨床慢性牙周炎患者中，從牙周組織細(xì)胞凋亡、齦溝液(GCF)炎癥反應(yīng)及基質(zhì)金屬蛋白酶/組織金屬蛋白酶抑制劑(MMPs/TIMPs)平衡等方面探討其應(yīng)用價值差異。

1 資料與方法

1.1 病例資料

2015-01～2017-01間在本院接受治療的慢性牙周炎患者128 例，患者本人或者家屬簽署知情同意書。按照隨機(jī)數(shù)表法將入組患者分為手器刮治組、噴砂組各64 例，手器刮治組中男性33 例、女性31 例，年齡36～74 歲， 平均(49.26±8.13) 歲； 噴砂組中男性34 例、 女性30 例， 年齡34～75 歲，平均(49.17±7.95) 歲。 2 組患者基線資料組間比較，P>0.05。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 入組及排除標(biāo)準(zhǔn)

入組標(biāo)準(zhǔn)：①接受基礎(chǔ)治療≥1月； ②口內(nèi)左右2 個象限內(nèi)有探診深度3～6 mm的牙位； ③全程配合治療及檢查，無中途自主離組，數(shù)據(jù)獲取完整。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①伴齦下修復(fù)體，或者Ⅱ度以上根分叉病變；②剩余牙槽骨高度<1/3； ③合并其他組織臟器感染性疾病；④合并嚴(yán)重自身免疫性疾病。

1.3 治療方法

手器刮治組患者接受手器刮治治療，采用Gracey刮治器、刮治深度為工作端無肉眼可見袋內(nèi)齦下菌斑。噴砂組患者接受噴砂刮治，在齦下噴砂機(jī)操作下將甘氨酸粉末的壓力設(shè)置為中檔(保證齦下工作端與牙長軸平行)，放置齦下工作端于牙周袋中(稍有抵抗感為宜)，對遠(yuǎn)、近、頰、舌4 個牙面進(jìn)行噴砂(持續(xù)時間約為5 s)，期間保證齦下工作端不移出牙周袋。

1.4 齦溝液標(biāo)本獲取

治療前、治療后7 d，均獲取2 組患者的齦溝液標(biāo)本，具體步驟如下：將裁剪為10 mm×2 mm的濾紙條放置在齦下菌斑對應(yīng)位置， 30 s后取出并放入無菌EP管中、凍存于-70 ℃深低溫環(huán)境下。檢測時將濾紙放入pH值為7.5的緩沖液中，震蕩離心(4 ℃、10 000 r/min、 10 min)，采集上清液。

1.5 凋亡分子表達(dá)

采用熒光定量PCR法測定齦溝液標(biāo)本中凋亡分子Bcl-2、 Bax、 Caspase-3的表達(dá)量。具體步驟如下：裂解細(xì)胞→4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取無色水相上層→異丙醇沉淀其中總RNA→清洗RNA沉淀、室溫空氣干燥→測定RNA純度及濃度→反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成樣品cDNA→熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增目標(biāo)基因。設(shè)置手器刮治組治療前齦溝液中凋亡分子的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值100，計算不同時間點、不同組內(nèi)相同凋亡分子的表達(dá)量。

1.6 炎癥反應(yīng)、MMPs/TIMPs平衡

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定齦溝液標(biāo)本中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等炎癥因子的含量；采用ELISA測定標(biāo)本液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、 金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 凋亡分子表達(dá)

治療前， 2 組患者齦溝液中凋亡分子Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 治療后7 d， 2 組患者齦溝液中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量高于治療前， Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量低于治療前，且噴砂組患者齦溝液中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量高于手器刮治組，Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量低于手器刮治組(P<0.05)(表1)。

2.2 炎癥因子

治療前， 2 組患者齦溝液中炎癥因子hs-CRP、IL-6、IL-10含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后7 d， 2 組患者齦溝液中hs-CRP、 IL-6的含量低于治療前，IL-10的含量高于治療前，且噴砂組患者齦溝液中hs-CRP、IL-6的含量低于手器刮治組患者，IL-10的含量高于手器刮治組患者(P<0.05)(表2)。

Tab 1 Comparison of apoptotic molecular expression in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64,

注： 與組內(nèi)治療前比較， ①P<0.05

2.3 MMPs/TIMPs平衡

治療前， 2 組患者齦溝液中MMP-2、 MMP-8、 MMP-13、 TIMP-1含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； 治療后7 d， 2 組患者齦溝液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量低于治療前，TIMP-1的含量高于治療前，且噴砂組患者齦溝液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量低于手器刮治組患者，TIMP-1的含量高于手器刮治組患者(P<0.05)(表3)。

Tab 2 Comparison of inflammatory factors in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64,

注：與組內(nèi)治療前比較， ①P<0.05

Tab 3 Comparison of MMPs/TIMPs factor contents in GCF between 2 groups before and after treatment (n=64, ng/ml，

注： 與組內(nèi)治療前比較， ①P<0.05

3 討 論

齦下菌斑是導(dǎo)致慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，菌斑中細(xì)菌定植數(shù)量及毒力可直接造成牙周炎癥發(fā)生、牙槽骨吸收及功能破壞，故清除齦下菌斑是慢性牙周炎治療的可靠方法[6]。手器刮治是臨床應(yīng)用時間較久的傳統(tǒng)治療手段，在刮治過程中只能做到與牙面點、線接觸，故在清除菌斑的徹底性方面存在隱患。噴砂刮治利用新型甘氨酸噴砂技術(shù)，將直徑<25 μm、莫氏硬度為2的甘氨酸粉末及3 個互呈120°夾角的噴砂工作尖共同作用于菌斑表面，在不損傷牙體硬組織的前提下徹底清除根面及牙周袋壁的菌斑[7]。本次研究亦將其分別用于慢性牙周炎患者的治療，從牙周組織中細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及MMPs/TIMPs平衡等微觀方面判斷臨床應(yīng)用效果差異。

已經(jīng)有研究證實，牙菌斑中的多種致病菌可引起牙槽骨中的成骨細(xì)胞增殖能力降低、細(xì)胞凋亡活性增加，說明細(xì)胞凋亡與牙周炎的發(fā)生存在密切聯(lián)系[8-9]。牙菌斑的清除可解除致病菌對牙周組織細(xì)胞活性的干擾，菌班清除有效性與細(xì)胞凋亡活性直接相關(guān)。Bcl-2是具有阻斷程序化細(xì)胞死亡功能的主要分子，有助于延長細(xì)胞存在，在牙周炎病灶組織中存在Bcl-2的表達(dá)量減[10]。Bax、Caspase-3均屬于凋亡執(zhí)行分子，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用并加速細(xì)胞程序性死亡[11]。本次研究發(fā)現(xiàn)： 2 組患者治療后齦溝液中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量均增加，Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量均減少，說明兩種菌斑清除方式均可不同程度抑制牙周組織的細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步與手器刮治組比較，噴砂組治療后齦溝液中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量較高，Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá)量較低，說明噴砂組可更為有效的逆轉(zhuǎn)牙周組織的抗凋亡/促凋亡失衡，間接說明噴砂組可更為有效的清除齦下菌斑。

齦下菌斑中的致病菌作用于牙周組織并導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，大量炎癥因子分泌于齦溝液中，其具體含量可客觀反映牙周炎嚴(yán)重程度[12-13]。hs-CRP是最為典型、敏感度極高的炎癥因子，在慢性牙周炎早期即可被檢測到分泌增加，且進(jìn)一步促使IL-6等促炎因子分泌，形成局部炎癥級聯(lián)反應(yīng)[14]。IL-10是具有抗炎作用的典型因子，具有抑制炎癥反應(yīng)持續(xù)擴(kuò)大的作用，當(dāng)機(jī)體促炎因子大量分泌時IL-10被大量消耗并呈低水平，而當(dāng)牙周炎癥控制時局部抗炎能力增加、IL-10含量上升[15]。本次研究發(fā)現(xiàn)： 2 組患者治療后齦溝液中hs-CRP、IL-6的含量降低，IL-10的含量增加，說明兩種菌斑清除方式應(yīng)用后齦溝液中的炎癥反應(yīng)程度均減輕；進(jìn)一步與手器刮治組比較，噴砂組治療后齦溝液中hs-CRP、IL-6的含量較低，IL-10的含量較高，證實噴砂刮治可更為有效的抑制慢性牙周炎患者的牙周局部炎癥程度，這與該方式清除齦下菌斑的徹底性直接相關(guān)。

有研究指出基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的過表達(dá)是促使慢性牙周炎進(jìn)展的重要因素，MMP-2、MMP-8、MMP-13作為其主要亞型，已經(jīng)在不同研究中被證實高表達(dá)于齦溝液中，參與牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞的破壞[16-17]。TIMP-1可特異性抑制MMPs的作用，當(dāng)其表達(dá)減少時對MMP-2、MMP-8、MMP-13等的抑制能力降低，導(dǎo)致牙周組織持續(xù)損害發(fā)生[18]。本次研究發(fā)現(xiàn)：與治療前比較，兩組患者治療后齦溝液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量均降低，TIMP-1的含量增加，說明不同齦下菌斑去除方式均可不同程度逆轉(zhuǎn)MMPs/TIMPs失衡狀態(tài)；進(jìn)一步與手器刮治組比較，噴砂組治療后齦溝液中MMP-2、MMP-8、MMP-13的含量較低，TIMP-1的含量較高，說明噴砂刮治可更為有效的協(xié)調(diào)慢性牙周炎患者的牙周MMPs/TIMPs平衡，間接證實噴砂刮治清除齦下菌斑的高效性。

綜上所述， 傳統(tǒng)手器刮治及噴砂刮治均可用于慢性牙周炎患者的齦下菌斑清除，但是噴砂刮治法可更為有效的恢復(fù)牙周組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、逆轉(zhuǎn)疾病侵襲性，更具有可行性及高效性，值得在臨床推廣應(yīng)用。