鈷鉻合金經(jīng)有機(jī)硅季銨鹽浸泡后對(duì)白色念珠菌黏附的影響

劉輝明 廉云敏 高嵐 王璞

050000石家莊， 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔修復(fù)科

目前，我國已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)，臨床上因牙齒缺失需要可摘義齒修復(fù)治療的老年患者人數(shù)不斷增加。因長期佩戴義齒而引起義齒性口炎的發(fā)病率也逐漸增高。鈷鉻合金基托具有硬度高、彈性模量大、制作簡便等優(yōu)點(diǎn)以及其價(jià)格優(yōu)勢，目前仍廣泛應(yīng)用于臨床。但由于其不易磨平和拋光，容易積聚細(xì)菌而形成菌斑。因此，本實(shí)驗(yàn)擬用有機(jī)硅季銨鹽浸泡處理鈷鉻合金以提高其表面的抗黏附性，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

鈷鉻合金(登士柏,美國)；二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(山東愛普化學(xué)有限公司)；電熱恒溫干燥箱(101-0S，紹興蘇珀儀器有限公司)；濁度儀(梅里埃公司，法國); 冷熱循環(huán)儀( TC-501-F，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

白色念珠菌 ATCC90028(溫州康泰生物科技有限公司)；沙保羅瓊脂固體培養(yǎng)基(溫州康泰生物科技有限公司)；滅菌1640液體培養(yǎng)基(不含酚紅)(Life Technologies，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作試件 本實(shí)驗(yàn)采用失蠟法制作10 mm×10 mm×1 mm試件。檢查合格后，依次使用200、 360、 400、 600目砂紙逐級(jí)對(duì)試件的6 個(gè)面進(jìn)行打磨，每個(gè)面50 次。然后用滅菌蒸餾水超聲清洗10 min, 而后用95%乙醇超聲清洗10 min(重復(fù)2 次)脫脂，最后用滅菌蒸餾水沖洗，吹干，高溫高壓滅菌后備用。

1.3.2 硅烷膜制備 隨機(jī)選取144 片滅菌試件分為A～F 6 個(gè)不同濃度處理組：A組：1%有機(jī)硅季銨鹽溶液；B組：5%有機(jī)硅季銨鹽溶液；C組：10%有機(jī)硅季銨鹽溶液； D組：30%有機(jī)硅季銨鹽溶液； E組：60%有機(jī)硅季銨鹽溶液；F組：滅菌蒸餾水，即為對(duì)照組。再將各大組隨機(jī)分為4 個(gè)不同處理時(shí)間組，分別為30、 60、 120、 240 min。浸泡處理后，取出試件，漂洗去除試件表面懸浮的溶液，吹干。然后將電熱恒溫干燥箱調(diào)至120 ℃恒溫，將處理后的試件放入恒溫干燥箱中60 min固化成膜[1]后，放入無菌24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中備用。

1.3.3 菌懸液制備 將白色念珠菌ATCC90028復(fù)蘇后，用無菌棉簽挑取菌落，然后用無菌的1640液體培養(yǎng)基稀釋，吹打混勻后，比濁儀調(diào)整，配置成1.5×108CFU/ml的菌懸液備用。比濁前，使用無菌的1640液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照， 調(diào)“0”。

1.3.4 抗黏附性實(shí)驗(yàn) 將A～F 6 組試件分別用1 ml菌懸液浸泡， 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。 取出試件，在滅菌蒸餾水中蕩洗以去除表面未黏附的細(xì)菌。再將試件分別放入1 ml無菌1640液體培養(yǎng)基中，置于快速混勻器上振蕩1 min,比濁儀比濁，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5 抗黏附性長效性實(shí)驗(yàn) 選取30 片滅菌試件，隨機(jī)分成G～K 5 組。G～J組用5%有機(jī)硅季銨鹽浸泡120 min(抗黏附性實(shí)驗(yàn)得出的最佳處理組合)后， 在120 ℃恒溫干燥箱中固化60 min成膜，K組用滅菌蒸餾水浸泡后干燥。將G～J試件進(jìn)行冷熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)，在5 ℃和55 ℃的恒溫水浴中各浸泡30 s， 此為1 次循環(huán)，分別進(jìn)行0、 2 500、 5 000、 10 000 次循環(huán)，K組用蒸餾水浸泡處理。5 組實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間不同，保證實(shí)驗(yàn)同時(shí)結(jié)束。然后將各組試件放入1 ml菌懸液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h， 取出試件， 沖洗后加入1 ml無菌1640液體培養(yǎng)基，置于快速混勻器上振蕩1 min,比濁儀比濁，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。抗黏附性實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析方法，兩兩組間比較采用S-N-K檢驗(yàn)；抗黏附性長效性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間比較采用Dunnett-t法，各實(shí)驗(yàn)組間比較采用S-N-K檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 抗黏附性實(shí)驗(yàn)

對(duì)A～F組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析結(jié)果見表1。 對(duì)不同處理濃度采用S-N-K檢驗(yàn)比較結(jié)果見表2。 由濃度和時(shí)間組合的濁度均值輪廓圖(圖1)顯示：當(dāng)處理濃度為5%，浸泡時(shí)間為120 min時(shí)，濁度值最低，為最佳組合。

2.2 抗黏附性長效性實(shí)驗(yàn)

對(duì)G～K組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布，方差齊(P>0.1)， 使用Dunnett-t檢驗(yàn)和S-N-K檢驗(yàn)分析(表3～4)， 除了G組和H組之間無差異外，其余任意2 組之間均有差異(P<0.05)。由此可見，冷熱循環(huán)次數(shù)對(duì)鈷鉻合金表面抗黏附性有影響， 由冷熱循環(huán)次數(shù)濁度均值輪廓圖(圖2)可見，隨著冷熱循環(huán)次數(shù)增加，鈷鉻合金表面抗黏附性有所減弱。但是，冷熱循環(huán)10 000 次后，鈷鉻合金表面仍具有抗黏附性。

表1 析因設(shè)計(jì)方差分析

表2 不同濃度S-N-K檢驗(yàn) (n=24)

圖1 濃度和時(shí)間組合的濁度均值輪廓圖

(I)循環(huán)次數(shù)(次)(J)循環(huán)次數(shù) (I～J)Sig.0對(duì)照組-0.4530.0002 500對(duì)照組-0.4200.0005 000對(duì)照組-0.3150.00010 000對(duì)照組-0.2380.000

表4 不同循環(huán)次數(shù)S-N-K檢驗(yàn) (n=6)

圖2 冷熱循環(huán)次數(shù)濁度均值輪廓圖

3 討 論

由于患者佩戴義齒后，可摘義齒基托與黏膜之間形成了新的滯留區(qū)，滯留區(qū)內(nèi)唾液流速減慢，流量減少，導(dǎo)致可摘義齒基托組織面菌斑數(shù)增多，菌斑及其產(chǎn)物是造成義齒性口炎的主要因素[2]。白色念珠菌是義齒性口炎的主要致病菌，F(xiàn)enlon等[3]通過采集標(biāo)本培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，炎癥越明顯者，義齒組織面的白色念珠菌陽性率越高，證明了義齒性口炎的發(fā)生與白色念珠菌感染密切相關(guān)。

季銨鹽是一種陽離子表面活性劑，由烴基取代銨離子中4 個(gè)氫原子而生成的化合物，李佳等[4]通過實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過季銨鹽類溶液苯扎氯銨浸泡處理的純鈦具有抗菌性。而有機(jī)硅季銨鹽是一種新型的季銨鹽抗菌劑，是將硅氧烷引入季銨鹽結(jié)構(gòu)中而制得。其經(jīng)過水解產(chǎn)生硅醇基(Si-OH)與金屬(Me)結(jié)合形成一層Me-O-Si-致密的保護(hù)膜的同時(shí)，硅醇基之間脫水縮合又生成硅氧硅鍵(Si-O-Si)，從而極大的提高金屬的表面性能。不僅如此，有機(jī)硅季銨鹽以有機(jī)硅為媒介，使具有殺菌性能的銨陽離子基團(tuán)吸附于細(xì)菌表面，穿透細(xì)胞壁，改變細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如DNA、RNA等泄漏，導(dǎo)致菌體死亡[5-6]，即發(fā)生“接觸死亡”。Nikawa等[7]利用有機(jī)硅季銨鹽浸泡純鈦，研究證實(shí)其通過Ti-O-Si共價(jià)鍵定植在金屬表面，抑制了白色念珠菌和變形鏈球菌附著和生長，而且通過細(xì)胞毒性測試，證明其無明顯細(xì)胞毒性。這也為本實(shí)驗(yàn)利用有機(jī)硅季銨鹽浸泡處理鈷鉻合金提供依據(jù)。

口腔內(nèi)的溫度會(huì)隨著進(jìn)食，喝水，甚至呼吸而發(fā)生變化。冷熱循環(huán)實(shí)驗(yàn)則是通過在體外模擬口腔中的溫度變化，加速材料老化的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)組織ISO/TS11405: 2015闡述，要求進(jìn)行500 次循環(huán)。然而有學(xué)者[8]統(tǒng)計(jì)1998～2013 年193 個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，只有23 個(gè)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照ISO的標(biāo)準(zhǔn)，其余大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的循環(huán)次數(shù)各不相同。 Stewardson等[9]認(rèn)為500 次循環(huán)僅相當(dāng)于口內(nèi)不足2 個(gè)月的時(shí)間。而Gale等[10]假設(shè)每天發(fā)生20～50 次的冷熱循環(huán)， 10 000 次冷熱循環(huán)大約相當(dāng)于臨床使用一年的時(shí)間。這一觀點(diǎn)被許多學(xué)者所接受。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行冷熱循環(huán)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10 000 次冷熱循環(huán)后鈷鉻合金表面硅烷膜仍具有抗黏附性。因此認(rèn)為，鈷鉻合金經(jīng)過有機(jī)硅季銨鹽浸泡處理后，其表面硅烷膜的抗黏附性可以保持1 年時(shí)間。

口腔內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境非常復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)無法完全模擬口腔內(nèi)環(huán)境和患者日常使用情況。所以，義齒在佩戴使用過程中唾液的沖刷作用、食物的摩擦和機(jī)械性清潔等對(duì)鈷鉻合金表面硅烷膜抗黏附性能的影響有待進(jìn)一步研究。雖然，體外研究不能完全模擬臨床使用情況，但是本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)仍然可以為臨床使用有機(jī)硅季銨鹽提高鈷鉻合金表面的抗黏附性提供參考。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下鈷鉻合金經(jīng)過有機(jī)硅季銨鹽浸泡處理后，對(duì)白色念珠菌具有長效抗黏附作用。