奧司他韋對流感病毒肺炎模型幼鼠的治療效果及其對血清免疫球蛋白水平的影響

許 斌，任春梅，范貴榮，劉 冰，陶永進(jìn)

(四川綿陽四○四醫(yī)院：1.感染科；2.消化內(nèi)科；3.檢驗科 621000)

小兒肺炎是嬰幼兒時期的常見病，主要特點是多發(fā)并且四季都可能發(fā)生，常見癥狀為發(fā)熱、咳嗽、氣促、呼吸困難及肺部出現(xiàn)啰音等。甲型流感引發(fā)肺炎的發(fā)生率為5%～38%[1]。流感病毒傳染性強(qiáng)，容易變異。奧司他韋屬于一種特異性抑制劑，對神經(jīng)氨酸酶有顯著的抑制效果，可促進(jìn)成熟的流感病毒脫離宿主細(xì)胞，從而抑制流感病毒傳播[2]。免疫球蛋白主要包括抗體免疫球蛋白和膜免疫球蛋白，可與不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性[3]。研究顯示，肺炎的發(fā)病機(jī)制與免疫球蛋白的免疫反應(yīng)存在著密切聯(lián)系[4]。本文主要研究奧司他韋對流感病毒肺炎模型幼鼠的治療效果及其對血清免疫球蛋白(Ig)G、IgM、IgA水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

30只雄性、健康、清潔昆明幼鼠，3～4周齡，平均(3.5±0.3)周，體質(zhì)量12～14 g，平均(13.5±1.5)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，所有幼鼠在無病原菌的清潔籠子里喂養(yǎng)，所飲用的水和食物均經(jīng)過高溫、高壓消毒。甲型流感病毒(H1N1)株A/FM1/47由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院病毒研究所提供，在本院病毒實驗室凍存。奧司他韋(磷酸奧司他韋顆粒，宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每袋15 mg，每盒10袋)；一抗和二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)通過[審批件(2018)倫審第(21)號]。

1.2 方法

1.2.1肺炎模型建立

從30只幼鼠中隨機(jī)選取25只建立病毒性肺炎模型。H1N1解凍之后在9 d齡雞胚的尿囊腔中進(jìn)行接種并培養(yǎng)、傳代。H1N1肺炎模型建立參考文獻(xiàn)[5]，將流感病毒增毒之后的新鮮尿囊液(血凝滴度為1∶1 280)按照10倍系數(shù)稀釋6個濃度，用乙醚麻醉幼鼠后，鼻腔內(nèi)接種H1N1，每只幼鼠接種0.05 mL，連續(xù)觀察幼鼠14 d，幼鼠出現(xiàn)驚厥、昏迷、腹瀉、嚴(yán)重喘息說明建模成功。

1.2.2分組及給藥

將肺炎模型建模成功的16只幼鼠隨機(jī)分為模型組、奧司他韋組，每組各8只，設(shè)立對照組幼鼠5只。奧司他韋組幼鼠均采取灌胃的形式灌注10 mg/kg奧司他韋，每天1次。模型組和對照組幼鼠采用等體積的無菌蒸餾水灌胃，連續(xù)治療5 d。

1.2.3肺功能相關(guān)指標(biāo)檢測

3組幼鼠治療5 d后，采用5 mL 10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，氣管切開后進(jìn)行氣管插管，幼鼠放置在體描箱中，頭保持低位，與呼吸機(jī)管路相連，采用小動物肺功能儀進(jìn)行檢測。外加壓力使幼鼠進(jìn)行深呼吸，給予機(jī)械通氣，檢測肺功能指標(biāo)：50%用力呼氣流量(FEF50)、75%用力呼氣流量(FEF75)、最大呼氣中段流量(MMF)、呼氣峰流速值(PEF)。將幼鼠麻醉后間隔30 min，在手術(shù)臺上固定，抽取股動脈血，保存在肝素鈉抗凝管中，每管2 mL，-20 ℃環(huán)境下保存、待測。處死幼鼠，全肺摘除后稱質(zhì)量，肺系數(shù)=肺濕重/處死時體質(zhì)量×100%。

1.2.4病理形態(tài)學(xué)觀察

處死所有幼鼠后將其肺部組織取出，在10%甲醛溶液中保持48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟處理后，采用蘇木素-伊紅(HE)進(jìn)行染色，在顯微鏡下(×100)觀察幼鼠病理學(xué)特征。

1.2.5雙抗體夾心法檢測血清免疫球蛋白

將抽取的股動脈血3 mL以1 000 r/min離心20 min，分離上層血清，吸附在微量滴板的小孔里進(jìn)行洗滌，加入待測抗原，如果二者是特異的，則會產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，洗去多余抗體，加入與待測抗原呈現(xiàn)出特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使其形成“夾心”現(xiàn)象，加入該酶的底物，如果能看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，則說明在孔壁上存在相對應(yīng)的抗原，從而通過顯色后讀取的具體濃度數(shù)據(jù)計算IgG、IgM及IgA表達(dá)水平。

1.2.6Western blot檢測Notch1、Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)及Notch配體(Jagged1)

將采集到的標(biāo)本使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3遍以上，分離緩沖液，加入細(xì)胞裂解液，裂解35 min，提取總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白水平。每孔取20 μg總蛋白，通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V電泳10 min，將電轉(zhuǎn)膜放在冰浴中轉(zhuǎn)膜，在37 ℃環(huán)境下?lián)u床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST(1∶1 000)稀釋一抗Tubulin(內(nèi)參照)，在4 ℃環(huán)境下孵育過夜、保存；次日用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其在底物溶液中進(jìn)行顯色，分析Notch1、NICD、Jagged1灰度值，目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組幼鼠肺功能指標(biāo)比較

模型組和奧司他韋組FEF50、FEF75、MMF、PEF均低于對照組，肺系數(shù)均高于對照組(P<0.05)；奧司他韋組FEF50、FEF75、MMF、PEF均高于模型組，肺系數(shù)低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.2 各組幼鼠肺組織病理學(xué)觀察

正常幼鼠肺部組織結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肺泡的細(xì)胞壁變寬，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，肺泡間間隔變寬，在肺間質(zhì)和毛細(xì)血管壁之間出現(xiàn)充血，并且出現(xiàn)大量的巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，滲出纖維素樣物，纖維結(jié)締組織出現(xiàn)增生現(xiàn)象；奧司他韋組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，支氣管平滑肌厚度降低，見圖1。

表1各組幼鼠肺功能指標(biāo)比較

圖1 各組幼鼠肺組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.3 各組幼鼠血清免疫球蛋白水平比較

模型組和奧司他韋組血清IgG、IgM及IgA水平均明顯低于對照組(P<0.05)，奧司他韋組血清IgG、IgM及IgA水平均明顯高于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 各組幼鼠血清IgG、IgM及IgA水平 比較

2.4 奧司他韋對肺炎模型幼鼠Notch1、NICD及Jagged1蛋白的影響

模型組和奧司他韋組Notch1、NICD、Jagged1蛋白水平均明顯高于對照組(P<0.05)，奧司他韋組Notch1、NICD、Jagged1蛋白水平均明顯低于模型組(P<0.05)，見表3、圖2。

圖2 Notch1、NICD及Jagged1蛋白Western blot條帶

表3 奧司他韋對肺炎模型幼鼠Notch1、NICD及Jagged1蛋白的影響

續(xù)表3 奧司他韋對肺炎模型幼鼠Notch1、NICD及 Jagged1蛋白的影響

3 討 論

導(dǎo)致病毒性肺炎的原因很多，主要和免疫因素有關(guān)，患兒年齡小，免疫功能低下，容易感染，治療也相對困難[6-7]。小兒流感病毒性肺炎初期的臨床癥狀是突發(fā)高熱、頭痛、全身肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等，與其他病毒性肺炎有明顯的區(qū)別[8]。隨著病情進(jìn)展，嬰幼兒會出現(xiàn)咳嗽、咳痰、吸氣性凹陷、呼吸頻率增加等癥狀[9]。如果嬰幼兒發(fā)生病毒感染后不能及時進(jìn)行治療，會進(jìn)一步發(fā)生繼發(fā)性感染。因此，尋求有效的治療方式對病毒性肺炎患兒至關(guān)重要。本研究主要通過建立流感病毒肺炎幼鼠模型，探討奧司他韋治療流感病毒肺炎的效果。

袁冕等[10]研究顯示，磷酸奧司他韋顆粒在治療兒童病毒性肺炎中效果顯著，可以有效抑制病毒在患兒體內(nèi)傳播。奧司他韋的主要特點是具有較高的特異性，對其他類型的病毒、細(xì)菌及人體中的神經(jīng)氨酸酶沒有抑制效果，而機(jī)體對流感病毒感染后的免疫應(yīng)答不具有抑制作用[11-12]。本研究顯示，與模型組比較，奧司他韋組FEF50、FEF75、MMF、PEF均升高，肺系數(shù)降低，表明奧司他韋可以改善幼鼠肺功能，降低幼鼠的氣管反應(yīng)，有助于幼鼠恢復(fù)。相關(guān)研究顯示，口服奧司他韋腸道易吸收，其通過肝、腸酯酶轉(zhuǎn)化為羧酸奧司他韋，可作用于肺、氣管、支氣管及肺泡中病毒感染處[13-14]。本研究結(jié)果顯示，奧司他韋組幼鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤較模型組明顯改善，表明奧司他韋可以減輕幼鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)，促進(jìn)肺功能恢復(fù)。

免疫球蛋白有激活補(bǔ)體的作用，可與細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，表現(xiàn)出不同的生物學(xué)作用。近年來有研究表明，病毒性肺炎的發(fā)病機(jī)制與免疫球蛋白的免疫反應(yīng)也存在著密切的關(guān)系，其中IgA就是關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的指標(biāo)，活性增強(qiáng)后的輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生大量IgA，可形成免疫復(fù)合物沉積在全身小血管壁上[15]。在患兒發(fā)病的同時，其他免疫指標(biāo)IgM、IgG及IgE等也會發(fā)生不同的特異性反應(yīng)，這些指標(biāo)水平的變化對疾病的診療也具有重要的參考價值[16]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，奧司他韋組IgG、IgM及IgA水平明顯提高，表明奧司他韋可以有效改善幼鼠免疫球蛋白水平，對病毒復(fù)制有干擾作用，影響病毒在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)。

Notch屬于一種高度保守的信號，其主要的受體是Notch1蛋白，在調(diào)控細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，同時在肺炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Notch1蛋白在炎癥、免疫反應(yīng)中，以及微血管的形成中起到重要作用[17]。研究顯示，Notch信號在肺纖維化病變的上皮干細(xì)胞中起決定性作用，Notch1促進(jìn)白細(xì)胞介素分泌，與肺炎的發(fā)病有緊密的聯(lián)系[18]。研究認(rèn)為，通過對Notch信號進(jìn)行干預(yù)，可以減輕肺炎的發(fā)展進(jìn)程，減少肺功能的損傷[19]。Jagged1是Notch信號通路中的最主要的配體，對Notch1信號激活有幫助。NICD是Notch1活性形式的存在，NICD表達(dá)水平可有效反映Jagged1/Notch1的活化情況[20]。肺纖維化的發(fā)生與Notch信號通路有緊密的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，奧司他韋組Notch1、NICD及Jagged1蛋白水平下調(diào)。

綜上所述，奧司他韋有助于激活Notch1/Jagged1通路，促進(jìn)IgG、IgM、IgA水平升高，下調(diào)Notch1、NICD、Jagged1表達(dá)，促進(jìn)幼鼠肺功能恢復(fù)，達(dá)到治療流感病毒性肺炎的作用。