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    益肺散結(jié)方對肺纖維化大鼠模型自噬及PI3K-AKT-mTOR通路的影響

    2021-01-28 06:03:50韓欣丁曉玲余濤包蕊王馨
    西部醫(yī)學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:貨號肺纖維化肺泡

    韓欣 丁曉玲 余濤 包蕊 王馨

    (青海省婦幼保健院藥劑科,青海 西寧 810007)

    肺纖維化( PF) 是指因肺泡損傷、成纖維細(xì)胞增殖、肺泡細(xì)胞外基質(zhì)破壞及過度沉積等多種原因?qū)е碌囊环N肺間質(zhì)性疾病,可使患者產(chǎn)生呼吸困難、干咳、肺功能通氣障礙、呼吸衰竭等癥狀[1-3]。PF發(fā)病率和死亡率逐年升高,嚴(yán)重威脅患者生命健康[4-5]。PF發(fā)病機制復(fù)雜,有研究[6]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與PF的發(fā)生發(fā)展程密切相關(guān)。磷脂酰-3激酶(Phosphatidyl-3 kinase,PI3K)/ 蛋白激酶B ( Protein kinase B,Akt)/雷帕霉素靶分子(Rapamycin target molecule,mTOR)信號通路參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程[7],故調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路表達(dá),激活肺組織細(xì)胞自噬,可緩解PF進程。近來有研究[8-9]發(fā)現(xiàn),益肺散結(jié)方對肺癌有較好的療效,且方中黃芪對PF也有一定的治療效果,故本研究推測益肺散結(jié)方可能對PF也有較好的療效,并建立大鼠PF模型,探討益肺散結(jié)方對大鼠PF過程中PI3K/Akt/mTOR通路和細(xì)胞自噬的影響,以期為中藥方劑益肺散結(jié)方新療效的開發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物 選取清潔級同遺傳背景的SD大鼠50 只,體重 200~220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵) 2018-0002,動物質(zhì)量合格證號為省科委2000A027。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:自然光照,自由飲食、飲水,溫度25 ℃,相對濕度50%,鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意,實驗遵循3R原則。

    1.2 主要試劑及儀器 益肺散結(jié)方組成(黃芪30 g、麥冬15 g、沙參15 g、薏苡仁30 g、杏仁10 g、浙貝母10 g、皂角10 g、莪術(shù)15 g、金蕎麥 30 g、白花蛇舌草30 g)常規(guī)煎藥,藥液濃縮至生藥含量為5.0 g/mL;博萊霉素(Bleomycin,BLM)購自美國英杰生命技術(shù)有限公司(貨號:R250-01);組織蛋白酶D (cathepsin D,Cat-D)購自美國伯豪生物BD公司(貨號:DXT-610800);泛素和LC3結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-andLC3-binding protein p62,p62)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號:bs-2951R-2);自噬相關(guān)蛋白beclin-1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號:bs-1501P);ɑ-平滑肌動蛋白( ɑ-smooth actin,ɑ-SMA)購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號:YI634-LCE);微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3-Ⅱ)/LC3-I 購自北京索萊寶科技有限公司(貨號:K000467P);羥脯氨酸elisa試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(貨號:LM-13650-EB);HE染色試劑盒購自上海生物公司(貨號:G1120);馬松(Masson) 染色試劑盒購自愛必信(上海)生物科技有限公司(貨號:abs9347);p-PI3K/PI3K抗體(貨號:FNAB06243,購自武漢菲恩科技生物有限公司);Akt抗體(貨號:ab8805,購自美國Abcam);p-mTOR/mTOR抗體(貨號:ab2732,購自美國Abcam);蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號P0027上海碧云天公司)等。手動輪轉(zhuǎn)式切片機(型號RM2125RTS,德國Leica公司);光學(xué)顯微鏡(型號SMZ745,日本尼康公司);酶標(biāo)儀(型號XElx800,美國Perkin Elmer公司);蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD,美國Bio-Rad公司);凝膠成像儀(型號:GIS-500,Miulab公司)等。

    1.3 方法

    1.3.1 大鼠PF模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[9]構(gòu)建PF模型,具體操作方法為:隨機取40只大鼠,用3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后,固定大鼠,并用開口器固定口腔,拉出舌頭后,用壓舌板壓住舌腹,行氣管插管并緩慢注入博萊霉素(溶于0.9%的氯化鈉注射液)5 mg/kg,0.3 mL,然后將大鼠直立,沿身體縱軸旋轉(zhuǎn)3 min即可。將造模成功的大鼠分為PF組、益肺散結(jié)方低(7.5 g/kg)、中(15 g/kg)、高(30 g/kg)劑量組,每組10只;另取10只大鼠,除行插管后緩慢注入0.9%的氯化鈉注射液0.3 mL外,其余操作同模型組,將其作為對照組。造模結(jié)束后2 h開始給藥,益肺散結(jié)方參照文獻(xiàn)[8]以生理鹽水配置為含生藥量0.75、1.50、3.00 g/mL的混懸液,各處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥,對照組與PF組灌胃給予生理鹽水,各組連續(xù)給藥21 d,1次/d。

    1.3.2 肺組織標(biāo)本采集 給藥期間觀察大鼠呼吸、毛發(fā)、體態(tài)及行為活動。于末次給藥24 h后,用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后并處死,解剖大鼠,分別摘取大鼠左右兩肺,經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗后,左肺置于10%甲醛中固定以備作病理檢查,右肺迅速置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 肺組織HE染色法檢測病理組織形態(tài)及炎癥水平 取1.2.2中的左肺,進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。將切片進行二甲苯脫蠟,梯度酒精水化后,用蘇木精-伊紅染色 5 min,1%鹽酸酒精分化 10 s,蒸餾水漂洗2 min,梯度酒精脫水2 min,二甲苯透明處理,中性光學(xué)樹脂封片后,置于光鏡下觀察分析肺組織結(jié)構(gòu)。隨機選取5個視野,參照文獻(xiàn)[10]用單盲法觀察肺泡炎癥并計分:0分,肺泡透亮、結(jié)構(gòu)清晰、間隔正常;1~2分,肺泡結(jié)構(gòu)稍紊亂、間隔增生增寬,且有少量炎性細(xì)胞浸潤,病變范圍占全肺20%;3~5分,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、間隔明顯增寬,炎性細(xì)胞浸潤較多,病變范圍占全肺20%~50%;6~8分,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡融合、間隔顯著增寬,炎性細(xì)胞大量浸潤,成纖維細(xì)胞增生,膠原纖維大量沉積,病變范圍占全肺20%~50%。每組5個樣本分別評分,取平均值。

    1.3.4 肺組織馬松( Masson) 染色法檢測膠原增殖程度 取1.2.3項下每組切片,用二甲苯脫蠟2次,15 min/次,用高濃度到低濃度酒精脫水,溫水漂洗后按Masson試劑盒說明書操作。置于顯微鏡下觀察,隨機選取5個視野,參照文獻(xiàn)[10]用單盲法觀察肺纖維化程度并計分:0分,肺泡結(jié)構(gòu)清晰、間隔正常,無腫脹;1~2分,肺泡輕微腫脹、有少量纖維化出現(xiàn);3~4分,肺泡壁增大,出現(xiàn)小面積纖維灶;5~6分,纖維化區(qū)域增大,出現(xiàn)連續(xù)的纖維灶;7~8分:肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著,纖維灶融合,出現(xiàn)連續(xù)大片的纖維灶;9~10分:肺泡空隙消失,肺泡腔充斥大量纖維,肺完全纖維化,每組5個樣本分別評分,取平均值。

    1.3.5 羥脯氨酸試劑盒測定膠原蛋白含量 取1.2.2中的右肺,于4 ℃冰箱中解凍后,取100 g勻漿,參照文獻(xiàn)[12]取按堿性水解法裂解組織,離心后取上層清液1 mL,按羥脯氨酸試劑盒說明書進行測定。

    1.3.6 Western blot法檢測肺組織通路蛋白p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR及自噬相關(guān)蛋白 beclin-1、p62 、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白的表達(dá) 取1.2.2中-80 ℃保存的右肺組織,于4 ℃冰箱中解凍后,剪取0.5 g,用組織勻漿器勻漿、離心分離后,取上層清液,用蛋白裂解液裂解離心后提取蛋白,用BCA試劑盒檢測蛋白總濃度,取50 μg蛋白上樣,進行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng),TBST溶液清洗后,加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST溶液清洗3次后,加入一抗(p-PI3K、PI3K、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、LC3-I,β-actin(內(nèi)參)抗體,稀釋倍數(shù)分別為1∶1000,1∶1000,1∶1000,1∶1000,1∶2000,1∶1000,1∶2000,1∶2000,1∶2000,1∶2000,1∶2000,4℃搖床室溫孵育過夜,TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2000),37 ℃搖床室溫孵育1 h,TBST清洗3次后,采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠一般行為觀察 對照組大鼠毛色光潔,呼吸、飲食正常,活動良好。PF組大鼠隨時間延長,呼吸喘促、毛色粗糙、飲食減少、形體消瘦、精神萎靡,鼠爪和鼠尾出現(xiàn)紫紺。益肺散結(jié)方各劑量組呼吸喘促次數(shù)減少、飲食量均明顯好于PF組。

    2.2 大鼠肺組織病理損傷程度及炎性評分檢測 對照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰正常。與對照組比較,PF組大鼠肺組織可見肺泡融合、間隔顯著增寬,炎性細(xì)胞大量浸潤,且有成纖維細(xì)胞增生堆積擠,炎性評分增高(P<0.05);與PF組大鼠比較,益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠炎性細(xì)胞浸潤減少,肺泡結(jié)構(gòu)稍紊亂,炎性評分降低(P<0.05);益肺散結(jié)方各劑量組隨劑量增加,炎性浸潤及評分降低(P<0.05),見圖1、表1。

    圖1 HE染色檢測大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 1 HE staining to detect the pathological damage of rat lung tissue

    表1 各組大鼠炎性程度評分和纖維化程度評分比較Table 1 Comparison of inflammatory degree score and fibrosis degree score of rats in each group

    2.3 大鼠肺組織纖維化程度評分檢測 對照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常。與對照組比較,PF組大鼠肺組織可見肺泡結(jié)構(gòu)粘連、閉合,有大量膠原組織增殖,且纖維化程度評分增高(P<0.05)。與PF組大鼠比較,益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠,肺泡結(jié)構(gòu)少量殘存,膠原纖維增殖減少,纖維化程度評分降低(P<0.05)。益肺散結(jié)方各劑量組隨劑量增加、膠原組織增殖減少及纖維化程度評分降低(P<0.05),見圖2、表1。

    圖2 Masson染色檢測大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 2 Pathological damage of lung tissue detected by Masson staining

    2.4 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量的影響 與對照組相比,PF組大鼠肺組織纖維蛋白含量升高(P<0.05)。與PF組相比,益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織纖維蛋白含量降低(P<0.05),益肺散結(jié)方各劑量組纖維蛋白含量降低呈劑量依賴性(P<0.05),見表2。

    表2 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量結(jié)果表Table 2 Results of fibrin content in lung tissue of rats in each group

    2.5 各組大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白 beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I表達(dá)的影響 與對照組相比,PF組大鼠p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)升高(P<0.05),beclin-1和LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白表達(dá)下降(P<0.05);與PF組相比,益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低(P<0.05),beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)升高(P<0.05);益肺散結(jié)方各劑量組p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低、beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)升高呈劑量依賴性(P<0.05),見圖3、表3。

    表3 各組大鼠beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白相對表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of beclin-1,p62,ɑ-SMA,LC3-Ⅱ / LC3-I protein of rats in each group

    2.6 各大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)水平 與對照組相比,PF組大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與PF組相比,益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)降低(P<0.05);益肺散結(jié)方各劑量組蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(P<0.05),見圖3、表4。

    圖3 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure 3 Western blot of protein expression in lung tissue of rats in each group注:A.對照組;B.PF組;C.劑方低劑量組;D.劑方中劑量組;E.劑方高劑量組。圖A.大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)免疫印跡圖;圖B.大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白免疫印跡圖

    表4 各組大鼠肺組織通路蛋白p-PI3k/PI3k、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)水平Table 4 The relative expression levels of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR protein

    3 討論

    PF確切發(fā)病機制不明,對于PF的治療尚無特效藥物[11]。西醫(yī)研究發(fā)現(xiàn),成纖細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)在肺組織的過度沉積是PF的主要病理表現(xiàn)[10]。中醫(yī)將PF歸屬為肺痹、肺痿、喘證等,且多以益氣養(yǎng)陰、祛痰、止咳等方法治療[12]。中醫(yī)單方、驗方、成藥等在緩解PF患者癥狀、延緩患者生存方面具有其獨特的優(yōu)勢[13]。文獻(xiàn)報導(dǎo),運用益氣養(yǎng)陰、散結(jié)化瘀方法及中藥黃芪提取物在治療PF方面有較好效果[14],而中醫(yī)驗方益肺散結(jié)方具有益氣養(yǎng)陰、化痰止咳功效,方中黃芪又為君藥,故本研究推測益肺散結(jié)方也可能治療PF,并建立大鼠PF模型對此進行驗證,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,PF組大鼠毛發(fā)稀疏,呼吸困難加重,HE及Masson 染色顯示肺組織炎性及膠原增殖程度等病理損傷評分升高,且羥脯氨酸試劑盒檢測膠原蛋白含量也明顯升高,提示大鼠PF造模成功。而給予益肺散結(jié)方低、中、高劑量治療后發(fā)現(xiàn),大鼠呼吸困難現(xiàn)象緩解,肺組織炎性損傷、膠原增殖及含量也均比PF組降低,且益肺散結(jié)方各劑量組上述指標(biāo)降低效果呈劑量依賴性增強,表明益肺散結(jié)方可降低PF大鼠肺組織膠原蛋白含量,緩解肺纖維化進程。

    細(xì)胞自噬能夠提高肺泡細(xì)胞生存能力,延緩PF進程[6]。Beclin1是自噬體形成過程中的重要分子[15]。LC3-II/LC3-I 比值大小可評估自噬水平的高低[16]。p62 參與泛素蛋白酶系統(tǒng)和自噬蛋白降解過程[17]。自噬缺陷可促進ɑ-SMA蛋白表達(dá)[18]。PI3K/Akt/mTOR參與肺纖維化進程中的自噬過程[7,10]。徐昌君等[10]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可抑制PF模型小鼠肺組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路,提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達(dá),降低ɑ-SMA和p62蛋白表達(dá),增強肺組織細(xì)胞自噬活性,來抑制肺纖維化進程;He等[19]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達(dá),可提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達(dá),降低p62蛋白表達(dá),促進肝癌細(xì)胞的自噬與凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比,PF組大鼠p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達(dá)升高,而自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達(dá)降低、ɑ-SMA和p62表達(dá)升高,提示PF模型大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR信號通路激活,自噬活性下降。而給予益肺散結(jié)方低、中、高劑量治療后發(fā)現(xiàn),大鼠肺組織p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達(dá)降低,自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達(dá)升高、ɑ-SMA和p62表達(dá)降低,且益肺散結(jié)方各劑量組呈劑量依賴性,表明益肺散結(jié)方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達(dá),提高肺組織細(xì)胞自噬活性,緩解肺纖維化進程。這與徐昌君等[10]研究結(jié)果一致,體現(xiàn)了益肺散結(jié)方治療PF的優(yōu)越性。

    4 結(jié)論與啟示

    益肺散結(jié)方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達(dá),提高肺組織細(xì)胞自噬活性,緩解肺纖維化進程,這可能為其作用機制之一。益肺散結(jié)方還可能通過其他途徑改善PF進程,本研究未設(shè)計通路抑制劑進行驗證,有待后續(xù)深入研究。

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