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    miR-218-5p通過靶向LIN28B調(diào)控COPD時氣道上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)*

    2021-01-28 06:03:50任敏李琳梁向清
    西部醫(yī)學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶培養(yǎng)液靶向

    任敏 李琳 梁向清

    (綿陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,四川 綿陽 621000)

    慢性阻塞性肺疾病(COPD,簡稱慢阻肺)是一種以持續(xù)呼吸癥狀、氣道和(或)肺泡異常所致的進(jìn)行性氣流受限為特征的常見疾病,通常由于肺部對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應(yīng)引起[1-2]。慢阻肺可增加罹患心血管疾病風(fēng)險,已成為導(dǎo)致全球人類死亡的第四大原因[3-4]。目前,β2激動劑和長效抗膽堿能藥物對慢阻肺具有一定治療作用,但其效果并不理想。因此,探索慢阻肺發(fā)展的分子機制、尋找有效的治療策略是臨床亟待解決的重大課題。微小RNA(miRNA)是一種進(jìn)化較保守的內(nèi)源性非編碼RNA,其通過調(diào)控靶基因表達(dá)在多種人類疾病中發(fā)揮重要作用。大量研究證實,miRNA表達(dá)失調(diào)與慢阻肺發(fā)生發(fā)展密不可分[5-6]。Conickx G等[7]證實miR-218-5p在慢阻肺患者支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)降低,其表達(dá)水平與氣道阻塞密切相關(guān),高表達(dá)miR-218-5p對香煙煙霧所致炎癥和慢阻肺具有保護作用。然而miR-218-5p的直接靶點及其在慢阻肺中的作用機制仍有待進(jìn)一步研究。生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-218-5p可直接與lin28b的3′非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)結(jié)合,該基因常在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中過度表達(dá),并與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[8-9]。因此,本研究探討miR-218-5p在香煙煙霧提取物(Cigarette smoke extract,CSE)誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用和分子機制,以期為慢阻肺的靶向分子治療提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 人肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B購于南京科佰生物公司;RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司;Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶購于美國Life Technologies公司;芙蓉王香煙(烤煙型10 mg)購于湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司;人白細(xì)胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司;miR-218-5p模擬物(miR-218-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、LIN28B小干擾RNA(si-LIN28B)及其陰性對照(si-NC)、LIN28B過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-LIN28B)及其陰性對照(pcDNA-NC)、實驗引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供;放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液、聚偏氟乙烯膜購于上海碧云天生物技術(shù)研究所;兔源LIN28B、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)、β連環(huán)蛋白(β-actin)單抗以及山羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。

    1.2 香煙煙霧提取物(CSE)制備 采用30 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液對10根卷煙進(jìn)行冒煙實驗。將得到的懸浮液經(jīng)過濾滅菌,并確定為100%的CSE溶液。利用RPMI-1640培養(yǎng)液將CSE溶液稀釋至2.5%,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 實驗分組和處理 BEAS-2B細(xì)胞復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,制成細(xì)胞懸液后,置于37 ℃、含5% CO2、濕潤的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng),每隔2~3 d換培養(yǎng)液1次,當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%~90%融合時進(jìn)行實驗干預(yù)。將BEAS-2B細(xì)胞分為正常對照組(NC組即正常培養(yǎng)的細(xì)胞)、CSE組(采用2.5% CSE溶液處理BEAS-2B細(xì)胞)、miR-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-218-5p+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics)、si-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LIN28B+CSE組(轉(zhuǎn)染si-LIN28B)、miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics+pcDNA-NC)和miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics+pcDNA-LIN28B),進(jìn)行2.5%CSE溶液干預(yù)處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。

    1.4 RNA提取和實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用TRIzol試劑從各組BEAS-2B細(xì)胞中提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶將其轉(zhuǎn)化為cDNA,在ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR。分別以U6和β-actin為內(nèi)源性對照,2-ΔΔCT法計算miR-218-5p和LIN28B的相對表達(dá)水平。miR-218-5p上游引物:5′-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3′,下游引物:5′-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

    1.5 Western blot檢測LIN28B和Cleaved-caspase-3的表達(dá) 用RIPA緩沖液制備總蛋白樣品,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,隨后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h;用抗LIN28B抗體、抗Cleaved-caspase-3抗體4 ℃條件下孵育過夜;在室溫下與相應(yīng)的二抗孵育1 h;用增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影;以目標(biāo)蛋白和β-actin蛋白灰度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用0.25%的胰酶消化后,室溫下離心收集各組BEAS-2B細(xì)胞。預(yù)冷1×PBS洗滌細(xì)胞。加入300 μL的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后,避光室溫孵育15 min;加入5 μL的PI染色5 min,補加200 μL的1×結(jié)合緩沖液,混勻后上機檢測。

    1.7 ELISA法檢測IL-6和TGF-β1表達(dá)水平 BEAS-2B細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TGF-β1的表達(dá)水平。

    1.8 雙熒光素酶報告實驗 含有miR-218-5p相關(guān)結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒(WT-LIN28B)、含有miR-218-5p相關(guān)結(jié)合位點突變序列的突變型熒光素酶報告質(zhì)粒(MUT-LIN28B)構(gòu)建由上海吉瑪制藥有限公司提供。將MUT-LIN28B或WT-LIN28B分別與miR-218-5p mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染BEAS-2B,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

    2 結(jié)果

    2.1 CSE對氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B中miR-218-5p和LIN28B表達(dá)的影響 與NC組比較,CSE組氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B中miR-218-5p(0.40±0.04 vs 1.00±0.10)的表達(dá)顯著降低,LIN28B在mRNA(2.76±0.28 vs 1.01±0.10)和蛋白(0.86±0.09 vs 0.34±0.03)水平的表達(dá)顯著升高(P<0.05),見圖1、圖2。

    圖1 Western blot檢測LIN28B的蛋白表達(dá)量Figure 1 Western blot detects the expression of LIN28B protein

    圖2 RT-qPCR檢測miR-218-5p和LIN28B mRNA表達(dá)水平Figure 2 RT-qPCR detects expression levels of miR-218-5p and LIN28B mRNA注:1.NC組;2.CSE組。miR-218-5p 140bp;LIN28B mRNA 180bp

    2.2 過表達(dá)miR-218-5p對CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與NC組比較,CSE組BEAS-2B細(xì)胞凋亡率顯著增加,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加,IL-6和TGF-β1表達(dá)顯著增加,miR-218-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-NC+CSE組比較,miR-218-5p+CSE組BEAS-2B細(xì)胞miR-218-5p表達(dá)顯著增加,細(xì)胞凋亡率顯著降低,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低,IL-6和TGF-β1表達(dá)顯著降低(P<0.05),見表1、圖3、圖4。

    圖3 過表達(dá)miR-218-5p對CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Figure 3 Effect of overexpressing miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors注:A.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;B.Western Blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

    圖4 RT-qPCR檢測miR-218-5p表達(dá)水平Figure 4 RT-qPCR detects the expression level of miR-218-5p注:1.NC組;2.CSE組;3.miR-NC+CSE組;4.miR-218-5p+CSE組

    表1 過表達(dá)miR-218-5p對CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 1 Effect of overexpressing miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

    2.3 低表達(dá)LIN28B對CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與si-NC+CSE組比較,si-LIN28B+CSE組BEAS-2B細(xì)胞LIN28B表達(dá)顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著降低,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低,IL-6和TGF-β1表達(dá)顯著降低(均P<0.05),見表2、圖5。

    表2 低表達(dá)LIN28B對CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 2 Effect of low expression of LIN28B on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

    圖5 Western Blot檢測LIN28B、Cleaved-caspase-3表達(dá)Figure 5 Western Blot detects the expression of LIN28B,Cleaved-caspase-3

    2.4 miR-218-5p靶向LIN28B starbase預(yù)測顯示miR-218-5p與LIN28B之間存在部分連續(xù)互補結(jié)合位點(見圖6A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,與miR-NC和WT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組比較,miR-218-5p mimics和WT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與miR-NC和MUT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組比較,miR-218-5p mimics和MUTT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)(見表3)。Western blot檢測顯示,與miR-NC比較,miR-218-5p BEAS-2B細(xì)胞LIN28B蛋白(0.18±0.02 vs 0.39±0.04)表達(dá)顯著降低(P<0.05);與anti-miR-NC比較,anti-miR-218-5p BEAS-2B細(xì)胞LIN28B蛋白(0.68±0.07 vs 0.35±0.03)表達(dá)顯著升高(P<0.05)(見圖6B)。以上結(jié)果表明miR-218-5p靶向LIN28B并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

    圖6 miR-218-5p靶向調(diào)控LIN28B表達(dá)Figure 6 miR-218-5p targets to regulate LIN28B expression注:A.starbase對miR-218-5p和LIN28B結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖;B.Western Blot檢測LIN28B蛋白表達(dá)量

    表3 miR-NC或miR-218-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測Table 3 Dual luciferase activity detection after co-transfection of BEAR-2B cells with miR-NC or miR-218-5p and reporter plasmid

    2.5 高表達(dá)LIN28B可以逆轉(zhuǎn)miR-218-5p對CSE誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE組比較,miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE組BEAS-2B細(xì)胞LIN28B蛋白表達(dá)顯著增加,細(xì)胞凋亡率顯著增加,Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加,IL-6和TGF-β1表達(dá)顯著增加(均P<0.05),見表4、圖7。

    表4 高表達(dá)LIN28B可以逆轉(zhuǎn)miR-218-5p對CSE誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 4 High expression of LIN28B reverses the effect of miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

    圖7 Western Blot檢測LIN28B、Cleaved-caspase-3表達(dá)Figure 7 Western Blot detects the expression of LIN28B,Cleaned-caspase-3

    3 討論

    目前,全球慢阻肺發(fā)病率呈上漲態(tài)勢,尤其在發(fā)展中國家。有報道指出,我國40歲以上人群慢阻肺發(fā)病率高達(dá)13.7%,嚴(yán)重危害人民生命健康和生活質(zhì)量[10]。因此,研究慢阻肺發(fā)展機制,優(yōu)化治療方案迫在眉睫。近年來,新的證據(jù)表明miRNA在慢阻肺中起著至關(guān)重要的作用[11-14]。Du等[15]研究顯示miR-181c在慢阻肺患者肺組織中明顯降低,高表達(dá)miR-181c表達(dá)可抑制中性粒細(xì)胞浸潤、活性氧生成和炎性因子分泌,降低CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),而抑制miR-181c表達(dá)則產(chǎn)生相反作用。Gu等[16]報道m(xù)iR-145-5p高表達(dá)可抑制慢阻肺患者氣道重塑和炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)CSE誘導(dǎo)后BEAS-2B細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)顯著降低,過表達(dá)miR-218-5p可減輕CSE誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡。CSE干預(yù)后BEAS-2B細(xì)胞上清液中IL-6和TGF-β1水平升高,而過表達(dá)miR-218-5p可降低炎性因子IL-6和TGF-β1水平,與miR-218-5p對慢阻肺的保護作用一致[7,17]。此外,在納米SiO2誘導(dǎo)的肺損傷中也發(fā)現(xiàn)miR-145-5p表達(dá)譜改變[18]。Cleaved-caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生的最終效應(yīng)因子,CSE誘導(dǎo)后BEAS-2B細(xì)胞Cleaved-caspase-3表達(dá)顯著增加,而過表達(dá)miR-218-5p可降低Cleaved-caspase-3表達(dá)水平,提示miR-218-5p可能通過調(diào)控Cleaved-caspase-3表達(dá)引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞增殖和凋亡失衡進(jìn)而參與慢阻肺進(jìn)展。

    Lin28b是一種進(jìn)化高度保守的RNA結(jié)合蛋白,其與Lin28蛋白家族成員Lin28a具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。然而Lin28b主要存在于細(xì)胞核中,而Lin28a只存在于細(xì)胞質(zhì)中。自從在肝癌中發(fā)現(xiàn)Lin28b過表達(dá)后,在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Lin28b也存在過表達(dá)現(xiàn)象,且與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的誘導(dǎo)有關(guān),通過let-7依賴性和非依賴性機制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[19-23]。此外,有研究報道通過下調(diào)Lin28b還可有效抑制肺部炎性損傷[24]。于是本研究推測Lin28b可能與慢阻肺相關(guān)。CSE誘導(dǎo)后BEAS-2B細(xì)胞中Lin28b的表達(dá)顯著增加,與miR-218-5p表達(dá)趨勢相反。抑制Lin28b可減輕CSE誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡,并降低Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1水平。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-218-5p通過直接靶向Lin28b mRNA的3′-UTR來調(diào)控Lin28b的表達(dá)。miR-218-5p的下調(diào)促進(jìn)Lin28b的表達(dá),而miR-218-5p上調(diào)則抑制Lin28b表達(dá)。此外,恢復(fù)實驗顯示過表達(dá)Lin28b可逆轉(zhuǎn)miR-218-5p過表達(dá)對CSE誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡和炎性因子的影響。

    4 結(jié)論

    miR-218-5p通過靶向Lin28b可減輕CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞凋亡,降低炎性因子IL-6和TGF-β1的表達(dá)水平。因此,靶向miR-218-5p/Lin28b軸的調(diào)節(jié)有望為慢阻肺的治療提供新的方向。

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