不同作物輪作對谷田土壤酶活性和土壤細菌群落的影響

孫倩，吳宏亮*，陳阜，康建宏

1. 寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2. 中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作制度重點實驗室，北京 100193

在生產(chǎn)上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，作物輪作能減輕連作障礙，平衡土壤養(yǎng)分，有利于作物生長和提高產(chǎn)量，并對土壤微生物和酶活性具有重要影響（吳鳳芝等，2007；Anna et al.，1999）。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對維持土壤功能、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定等具有重要作用（鄭良永等，2005）。土壤酶活性是評價土壤肥力、土壤微生物活性的重要參數(shù)，其參與土壤中各種生物化學過程，可為植物的生長提供氮源、磷素等（董艷等，2009）。Alvey et al.（2003）對谷物/作物輪作下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，認為種植制度對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大，而植物種類和取樣時間的影響不大；輪作可以明顯改變細菌群落的組成。吳宏亮等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，輪作能夠提高砂田土壤微生物多樣性指數(shù)，改善微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。鄧玉清等（2018）研究了輪作對番茄連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性及養(yǎng)分的影響，發(fā)現(xiàn)番茄與秋葵或花生輪作均可提高土壤微生物多樣性，提高土壤酶活性，有利于維持土壤生態(tài)環(huán)境。牛倩云等（2018）研究發(fā)現(xiàn)輪作改變了土壤理化性質(zhì)、酶活性和根際土壤細菌多樣性指數(shù)，并且提高了部分有益功能菌的豐度。

目前，關(guān)于作物輪作能夠緩解連作障礙的研究報道較多（Tan et al.，2016；李銳等，2015），但針對谷子等雜糧作物的相關(guān)研究卻很少。因此，本研究設置谷子→黑豆、谷子→籽粒莧、谷子→藜麥和谷子連作4種處理，分別分析各作物成熟期根際土壤酶活性、細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，旨在全面深入地了解谷子連作及輪作后土壤酶活性和微生物群落的變化，以期為揭示谷子連作障礙及采取合適的輪作措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于寧夏吳忠市同心縣王團鎮(zhèn)，該區(qū)域?qū)賹幭闹胁扛珊祹?，典型的中溫帶干旱、半干旱大陸性氣候，干旱少雨，海?1370 m，無霜期 120—218 d，年降水量150—300 mm，多集中在7—8月，年蒸發(fā)量在2325 mm左右，年平均氣溫8.6 ℃，≥10 ℃的積溫約3000 ℃。該區(qū)土壤類型為砂壤土。試驗地土壤基本理化性質(zhì)為：pH：8.76，有機質(zhì)：12.66 g·kg-1，全氮：0.66 g·kg-1，速效鉀：440.39 mg·kg-1，速效磷：1.00 mg·kg-1。

1.2 試驗材料

供試谷子（Setaria italica）品種為“豫谷18號”，黑豆（Glycine max）品種為“寧黑1號”，籽粒莧（Amaranthus hybridusL.）品種為“旱雷神”，藜麥（Chenopodium quinoa）品種為“蒙藜1號”。

1.3 試驗設計

試驗采用單因素隨機區(qū)組試驗設計，共設4個處理，分別為：谷子→黑豆（MRG）、谷子→籽粒莧（MRA）和谷子→藜麥（MRQ）和谷子連作（CK），每個處理5次重復，小區(qū)面積25.6 m2，小區(qū)間用田埂隔開，不同小區(qū)的管理方式相同。

1.4 土壤樣品的采集

于2018年10月作物成熟收獲時進行采集。每小區(qū)選取3個采樣點，同時選取長勢一致的作物3株，然后挖取作物的整個根部，先去掉大塊土和附著土，用刷子刷取根毛上的土，即為根際土，將每樣點3株作物的根際土混勻作為該樣點的根際土。將取得的根際土裝入無菌自封袋，于冰盒保存帶回實驗室，迅速過2 mm網(wǎng)篩，一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)土壤微生物測定，另一部分自然風干，用于土壤酶活性的測定。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 土壤酶活性的測定方法

土壤過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法；土壤脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；土壤蔗糖酶活性的測定采用3, 5-二硝基水楊酸比色法；土壤堿性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法（關(guān)松蔭，1986）。

1.5.2 土壤總DNA的提取及16S rRNA擴增測序

使用快速 DNA旋轉(zhuǎn)提取試劑盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA）提取樣本基因組總DNA，并用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分別測定提取的 DNA的量和質(zhì)量。采用 ABI 2720型PCR擴增儀，選取細菌16S rRNA基因V3—V4區(qū)進行PCR擴增，擴增選用前引物（5′-GTGCC AGCMGCCGCGG-3′）和后引物（5′-CCGTCAATTC MTTTRAGTTT-3′）合成的引物，進行PCR擴增。反應體系：q5反應緩沖液（5×5）5 μL，q5高保真GC緩沖液（5倍）5 μL，q5高保真DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.25 μL，dntps（脫氧核糖核酸）（2.5 mm）2 μL，正向和反向引物（10 μm）各 1 μL、DNA模板2 μL和ddH2O 8.75 μL。擴增參數(shù)：98 ℃下的初始變性15 s，然后是25個循環(huán)，包括98 ℃15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最終延伸5 min 72 ℃，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。擴增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收目的片段送至上海派森諾科技股份有限公司進行測序。

1.5.3 序列分析

對 Illumina的測序結(jié)果進行分析，首先運用QIIME（Caporaso et al.，2010）軟件對測序的疑問序列進行過濾、檢查并剔除嵌合體序列。通過以下標準過濾質(zhì)量序列：長度＜150 bp的序列，含有模糊堿基的序列以及含有大于 8 bp的單核苷酸重復序列。使用 QIIME軟件，在 97%序列相似度下對操作分類單元進行聚類，并制作 Venn圖；利用QIIME中的OTU數(shù)據(jù)計算Chao1指數(shù)（Chao，1984；Dawid，1993）、Shannon 指數(shù)（Shannon，1948）和Simpson指數(shù)（Simpson，1949）等OTU水平的α多樣性指數(shù)，并生成OTU水平稀釋曲線。利用R軟件對細菌門和屬進行聚類，并制作柱狀圖和熱圖。使用PICRUSt菌群代謝功能預測分析對各處理的細菌功能進行預測，并繪制成柱狀圖。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010對土壤酶數(shù)據(jù)進行處理和作圖，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較（Duncan新復極差法），顯著性水平設為P＜0.05。使用Canoco 4.5軟件對土壤酶活性和細菌群落進行多元分析。用Person相關(guān)分析檢驗土壤細菌多樣性指數(shù)與土壤酶活性之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果分析

2.1 作物輪作對土壤酶活性的影響

由圖1可知，與連作相比，輪作下過氧化氫酶、脲酶和堿性磷酸酶活性均升高，除MRG處理的蔗糖酶活性低于連作外，其余兩種輪作模式下的蔗糖酶活性也升高。過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性在MRQ處理最高，MRG和MRA次之，CK最低。CK處理的過氧化氫酶活性分別比 MRQ、MRG、MRA降低了8.02%、5.2%、4.38%，且與MRQ呈顯著性差異（P＜0.05）；CK 處理的堿性磷酸酶活性分別比MRQ、MRG、MRA降低了10.34%、1.65%、1.08%，但CK與MRG和MRA間的差異不顯著，但與MRQ間差異顯著（P＜0.05）。脲酶活性的表現(xiàn)與過氧化氫酶活性相同，CK處理分別比MRQ、MRG、MRA降低了7.03%、6.12%、6.12%，但差異不顯著。蔗糖酶活性也表現(xiàn)為MRQ處理最高，MRG和MRA次之，CK最低；CK處理分別比MRA、MRQ降低了 16.78%、10.27%，比 MRG提高了8.61%；其中，MRA與MRG和CK間的差異達顯著水平。

圖1 不同輪作式下的土壤酶活性Fig. 1 Soil enzyme activity under different rotation patterns

2.2 作物輪作對土壤細菌群落的影響

2.2.1 作物輪作下根際土壤細菌16S rRNA 的V3—V4區(qū)原始數(shù)據(jù)分析

利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對細菌基因V3—V4區(qū)測序，共得到有效序列720015條，谷子→黑豆（MRG）、谷子→籽粒莧（MRA）、谷子→藜麥（MRQ）、谷子連作（CK）各處理所獲得的細菌有效序列分別有33675、34108、32722、43498條，平均長度在405—435 bp之間。稀釋曲線用來反映該測序深度是否合理、能否真實的反映樣品中細菌物種的豐富度。由圖2可知，各曲線均趨于平坦，表明該測序深度合理，測序結(jié)果可以用來分析細菌群落結(jié)構(gòu)。

2.2.2 作物輪作下根際土壤細菌OTUs數(shù)

圖2 稀釋曲線Fig. 2 Dilution curve

圖3 根際土壤細菌OTUs數(shù)Venn圖Fig. 3 Venn diagram of bacterial OTUs in rhizosphere soil

在 97%序列相似度下對各處理土壤細菌的OTU進行歸并和劃分，并利用R軟件繪制Venn圖，結(jié)果可以很清楚的展示各處理共有和特有的 OTU數(shù)，并可直觀的展示各處理 OTU的重疊情況。由圖 3可知，谷子→黑豆（MRG）、谷子→籽粒莧（MRA）、谷子→藜麥（MRQ）、谷子連作（CK）共獲得了10185個OTU，各處理分別獲得了5616、5713、5561、6492個OTU，各處理共有2614個OTU，谷子→黑豆（MRG）、谷子→籽粒莧（MRA）、谷子→藜麥（MRQ）、谷子連作（CK）特有的OTU數(shù)為 864、787、846、1254，其余均為樣本兩兩共有的。

2.2.3 作物輪作下土壤細菌多樣性和豐富度分析

Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)是反映微生物群落的多樣性指數(shù)，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)是反映微生物群落的豐富度指數(shù)。表1為各輪作處理下土壤細菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)。從表中可知，除MRQ輪作處理的細菌多樣性指數(shù)低于連作外，其余兩種輪作處理的多樣性指數(shù)均高于連作；3種輪作處理的細菌豐富度指數(shù)均低與連作。與連作相比，MRG、MRA處理的多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）分別提高了0.04%、0.34%和0.04%、0.21%；MRQ處理的多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）降低了0.02%、0.57%；MRG、MRA、MRQ處理的豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)）分別降低了 12.98%、18.40%和 15.90%、18.96% 、35.84%和40.66%。由于輪作后群落中優(yōu)勢種數(shù)量（比例）的下降，導致多樣性指數(shù)增加，由此可以推斷，輪作可以顯著降低細菌群落豐富度指數(shù)，而增加了多樣性指數(shù)。

2.2.4 作物輪作下土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分析

門水平下各處理的細菌群落結(jié)構(gòu)顯示（圖4），相對豐度大于1%的門類有7門，分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和 Saccharibacteria。其中，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）為優(yōu)勢菌門，在各處理中的占比達74.86%—81.68%。與連作相比，變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門的相對豐度增加，分別增加了 4.78%—18.71%、0.91%—27.40%、25.09%—85.71%和 11.28%—37.74%，而放線菌門相對豐度降低，分別降低了8.45%—30.99%。

圖4 門水平的細菌群落組成及豐度Fig. 4 Bacterial community composition and abundance at phylum level

表1 各輪作處理下土壤細菌多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial diversity index of soil under different rotation treatments

圖5 屬水平的細菌群落組成Fig. 5 Bacterial community composition at genus level

將相對豐度大于 1%的細菌屬進行聚類，發(fā)現(xiàn)各處理中優(yōu)勢細菌類群發(fā)生改變。由圖 5可知，MRA和MRG處理聚為一支，CK和MRQ聚為一支，說明MRA與MRG、CK與MRQ相似的優(yōu)勢細菌屬較多。CK與MRQ處理共有的優(yōu)勢屬有擬諾卡氏菌屬Nocardioides、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、倫茨氏菌屬Lentzea、Pseudarthrobacter、鏈霉菌屬Streptomyces、Saccharothrix、Kribbella、Iamia和Aeromicrobium；MRA與MRG處理共有的優(yōu)勢均屬有鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、擬諾卡氏菌屬Nocardioides、Haliangium和Aeromicrobium。各處理共有的優(yōu)勢均屬有鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（2.25%—3.11%）、擬諾卡氏菌屬Nocardioides（1.65%—4.12%）和Aeromicrobium（1.05%—1.37%）。

2.2.5 PICRUSt菌群代謝功能預測分析

根據(jù) PICRUSt預測的各處理根際土壤菌群代謝功能（圖6），共發(fā)現(xiàn)12種主要的二級基因功能代謝通路（相對豐度＞1%）。從圖可知，碳水化合物和氨基酸代謝顯著高于其他代謝通路（P＜0.05）。其次，發(fā)現(xiàn)輪作處理提高了聚糖生物合成代謝和酶家族代謝通路。

2.3 土壤酶活性與土壤細菌群落和多樣性的相關(guān)性分析

2.3.1 土壤酶活性與細菌屬的冗余分析

為進一步研究不同處理下土壤酶活性和細菌群落之間的相關(guān)關(guān)系，將土壤酶與土壤細菌屬類群作冗余分析（RDA）。冗余分析（RDA）結(jié)果顯示（圖7），第一排序軸貢獻率為65.4%，第二排序軸貢獻率為 26.9%，排序軸能在超過 92.3%%的累計貢獻率上解釋土壤細菌群落與土壤酶活性之間的關(guān)系。從圖中可知，相同處理的點分布較為集中，而不同處理的點分布較為分散。此外，還可知，4種酶活性與多數(shù)細菌屬呈正相關(guān)，說明它們受酶活性的影響較大。

圖6 輪作模式下作物根際土壤菌群代謝功能預測Fig. 6 Prediction of microbial metabolism in rhizosphere soil under crop rotation

圖7 土壤細菌屬和土壤酶活性的多元分析Fig. 7 Multivariate analysis of soil bacteria and soil enzyme activities

2.3.2 土壤酶活性與細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的相關(guān)性分析

為進一步了解不同處理下土壤酶活性和細菌多樣性和豐富度之間的相關(guān)關(guān)系，將土壤酶與土壤細菌屬類群作相關(guān)分析（表 2）。由表可知，過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性與細菌多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）和豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)）均呈負相關(guān)關(guān)系；其中，與ACE指數(shù)的相關(guān)性達顯著水平。脲酶活性與多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）均呈正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。蔗糖酶僅與Shannon指數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)性也不顯著。

表2 土壤細菌多樣性指數(shù)與土壤酶活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between soil bacterial diversity index and soil enzyme activity

3 討論

土壤酶活性反映了土壤中各種生物化學過程的強度和方向，與土壤微生物數(shù)量、全氮含量、有機質(zhì)含量等密切相關(guān)。研究顯示，輪作有利于土壤微生物的繁殖，增加微生物數(shù)量，增強代謝能力，使土壤維持較高的微生物活性與多樣性，增加土壤肥力水平，提高土壤酶活性（張成君等，2020）。本研究結(jié)果顯示，輪作提高了土壤過氧化氫酶、土壤磷酸酶和脲酶的活性，只是影響效果不顯著，這與曾玲玲等（2008）的研究結(jié)果相似。

輪作改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高了土壤微生物多樣性。本研究結(jié)果顯示，與谷子連作相比，谷子→黑豆和谷子→籽粒莧輪作下細菌多樣性指數(shù)升高，各輪作處理的細菌豐富度指數(shù)均降低，分析其原因可能是優(yōu)勢菌門（屬）比例的降低而導致的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）為各處理的優(yōu)勢菌門，這與Edward et al.（2015）在水稻、Niu et al.（2017）在玉米及曹鵬熙等（2020）在冰川棘豆上的研究結(jié)果相類似。在屬水平上，各處理的優(yōu)勢菌屬存在差異，其中以 MRA與 MRG較為相似，CK與MRQ處理較為相似；鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、擬諾卡氏菌屬Nocardioides和Aeromicrobium是各處理共有的優(yōu)勢屬。土壤細菌群落的這些變化歸因于不同作物根系分泌物的差異，因為根系分泌物是植物與根際微生物相互溝通的媒介，不同作物的根際分泌物的種類不同，而微生物的生長又會受到這些分泌物的影響，從而導致微生物的生長和多樣性發(fā)生變化，進而影響微生物群落結(jié)構(gòu)的變化（Hu et al.，2018）。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受多種因素的影響，包括土壤化學組成、土壤類型、植被類型、人類活動、氣候條件等（楊瑞紅等，2016；Zhao et al.，2010；Archer et al.，2019）。劉岳燕等（2006）和李華等（2014）認為土壤微生物多樣性受土壤酶活性的影響很大。本研究對土壤細菌群落與土壤酶活性的冗余分析表明，排序軸能在超過92.3%的累計貢獻率上解釋細菌群落結(jié)構(gòu)與酶活性的關(guān)系；其次，本研究中的4種土壤酶活性與多數(shù)細菌屬呈正相關(guān)關(guān)系，僅與少數(shù)細菌屬呈負相關(guān)關(guān)系，這說明細菌群落受土壤酶活性的影響較大。這與前人的研究結(jié)果一致（于高波等，2011）。通過對土壤細菌多樣性和酶活性進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性與細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈負相關(guān)關(guān)系，其中與 ACE指數(shù)呈顯著性負相關(guān)，這說明過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性對某些細菌的生長繁殖有抑制作用。而脲酶和蔗糖酶與細菌多樣性指數(shù)呈正相關(guān)，這說明脲酶和蔗糖酶活性的增強會促進某些細菌的繁殖，這是因為脲酶是參與氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，脲酶活性的增強會提高土壤氮素肥力，從而影響了微生物群落結(jié)構(gòu)（彭有才等，2009）；蔗糖酶能夠促進有機物質(zhì)的分解，為微生物的生長提供充足的養(yǎng)料，從而促進微生物的繁殖（楊陽等，2011）。

土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)受多種因素的共同影響，本試驗只研究了土壤酶活性對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，并且針對的是輪作一茬的作物，因此建議持續(xù)進行試驗，觀察輪作倒茬的效果。研究顯示土壤養(yǎng)分是土壤微生物生長的主要能量來源，被認為是調(diào)控土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素（羅達等，2017；楚海燕等，2019），因此建議后續(xù)結(jié)合土壤理化性狀、作物根系分泌物等進行研究。

4 結(jié)論

作物輪作對土壤酶活性、根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性等均產(chǎn)生影響。與連作相比，除谷子→黑豆輪作模式下的蔗糖酶活性略有降低外，其余輪作模式下的土壤酶活性均增大，其中，以谷子→藜麥處理增加最明顯。與連作相比，輪作改變了作物根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，改變了細菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)，過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性對細菌豐富度指數(shù)的影響較大。細菌豐富度指數(shù)表現(xiàn)為連作處理高于輪作處理，由于其中優(yōu)勢種數(shù)量（比例）的降低使得細菌多樣性指數(shù)以谷子→黑豆、谷子→籽粒莧處理高于連作，因此推薦其為較好的輪作作物。