中度退化草地補(bǔ)播10年后土壤微生物特征研究

趙文，尹亞麗,2，李世雄,2*，劉燕，劉晶晶，張如秀

1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)/三江源區(qū)高寒草地生態(tài)教育部重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省西寧市湟源縣畜牧獸醫(yī)站，青海 湟源 812100

草地是中國重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)，也是分布最廣泛，物種最豐富的植被類型，在涵養(yǎng)水源、水土保持和物質(zhì)循環(huán)等方面發(fā)揮著重要作用（肖桐等，2013；Katherine et al.，2019）。高寒草甸是草地生態(tài)系統(tǒng)的組成部分，其牧草資源不僅對當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)和民族經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有不可代替的作用，也對高寒地區(qū)風(fēng)沙、水蝕、鹽堿、內(nèi)澇、地下水位變化、土壤侵蝕、土地資源的流失等自然災(zāi)害的發(fā)生具有一定的屏障作用（趙春紅等，2013）。近幾十年，三江源區(qū)高寒草甸發(fā)生不同程度的退化，部分草地退化嚴(yán)重，形成黑土灘退化草地（馬玉壽等，2002）。國內(nèi)生態(tài)學(xué)者長期致力于草地退化研究，并依據(jù)退化程度制定了重度退化草地翻耕建植人工草地、中度退化草地免耕補(bǔ)播施肥、輕度退化草地圍封禁牧等為主的分類恢復(fù)措施（閆曉紅等，2020）。其中，免耕補(bǔ)播利用牧草施肥和補(bǔ)播的聯(lián)合機(jī)組作業(yè)，通過劃破草皮，增加了土壤透水、通氣性，促進(jìn)牧草生長、發(fā)育及土壤有機(jī)質(zhì)分解，為植物提供更多營養(yǎng)物質(zhì)（李小龍等，2020）。同時減輕對原生草地植被的破壞，在草群中補(bǔ)播優(yōu)質(zhì)牧草，以提高草地生產(chǎn)力（孫磊等，2009），但草甸退化一經(jīng)出現(xiàn)，恢復(fù)將是一個漫長的過程（張騫等，2019）。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，參與碳、氮循環(huán)，有機(jī)化合物分解，能量傳輸、運送等多種過程，對維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和可持續(xù)性方面有重要的作用（Slaughter et al.，2015）。以Biolog微孔板碳源利用為基礎(chǔ)的分析是微生物群落代謝功能多樣性的一種簡單、快速的方法，對不同環(huán)境中微生物群落功能多樣性信息具有重要意義（刁嬋等，2019）。從微生物的層面探究草地退化及恢復(fù)過程中的問題，可清晰明確草地退化及其恢復(fù)機(jī)理。補(bǔ)播做為一種草地改良措施，其目的主要為增加退化草地植被中的優(yōu)良牧草；而補(bǔ)播對草地土壤微生物的影響滯后于對植被的影響。張建貴等（2017）研究表明補(bǔ)播+圍欄半年的退化高寒草甸比圍欄封育的效果更好，能夠大幅度提高土壤微生物數(shù)量；李曉娜等（2019）研究了補(bǔ)播1年的荒灘地，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)播顯著改善了土壤物理性質(zhì)，并對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；姚鳳嬌等（2015）研究表明，補(bǔ)播草地顯著提高了土壤0—10 cm土層中真菌、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，并隨著修復(fù)年限的增加而呈現(xiàn)增加趨勢。但大多數(shù)研究針對的是短周期補(bǔ)播，短期補(bǔ)播可能會對草地生產(chǎn)力和微生物區(qū)系產(chǎn)生積極影響，課題組成員研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)播短期內(nèi)顯著提高了中度退化草地的生產(chǎn)力（楊增增等，2018）。然而，補(bǔ)播對中度退化草地是否產(chǎn)生長遠(yuǎn)的影響仍為未知。本研究選擇研究補(bǔ)播較長時間（10 a）的中度退化草地，擬揭示補(bǔ)播年限對中度退化高寒草地的土壤微生物的影響，以期對中度退化草地恢復(fù)管理提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 試驗地區(qū)與方法

1.1 試驗區(qū)概況

研究區(qū)位于青藏高原腹地的青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮(zhèn)（34°27′56.9″N ，100°13′56.9″W，海拔3740 m左右）。該地區(qū)為高原大陸性氣候，高寒缺氧，日照時間短，太陽輻射強(qiáng)且晝夜溫差大。1967—2017年平均氣溫在-3.4—3.0 ℃之間，最高氣溫為 26.6 ℃，最低氣溫-34.9 ℃，最大溫差22.4 ℃，最冷月和最熱月平均溫度分別為-12.6 ℃和9.7 ℃，全年無絕對無霜期（洪卓華等，2018）。降水集中在5—9月，年降水量513—542 mm，年蒸發(fā)量為1160 mm。牧草生長季為 156 d，高寒草甸是該地區(qū)主要的草地類型，未退化高寒草甸優(yōu)勢種為高山嵩草（Kobresia pygmeae），主要的伴生種有為垂穗披堿草（Elymus nutans）、美麗風(fēng)毛菊（Saussurea superba）等。

1.2 試驗方法

參照馬玉壽等（2008）的退化草地分類標(biāo)準(zhǔn)，2006年在青海省果洛州大武鎮(zhèn)用免耕補(bǔ)播聯(lián)合作業(yè)機(jī)對中度退化草地進(jìn)行免耕補(bǔ)播處理。選擇適宜草種是保證補(bǔ)播效果的關(guān)鍵。本課題組經(jīng)多年馴化選育的根莖型鄉(xiāng)土草種——青海草地早熟禾（Poa pratensisL.）不僅具有適口性好、耐牧的特點，同時可快速形成草皮層，是高寒地區(qū)退化草地快速恢復(fù)的優(yōu)良牧草（楊慧茹，2012）。研究表明補(bǔ)播早熟禾第二年的草地植被蓋度、生物量、禾草的比例顯著增加（李苗，2016）。因此，選擇優(yōu)質(zhì)禾草青海草地早熟禾為補(bǔ)播草種，播種量 3.75 kg·hm-2；并施用尿素（150 kg·hm-2），補(bǔ)播總面積約20 hm2。自補(bǔ)播后未進(jìn)行后續(xù)改良，返青期（4—6月）完全禁牧，冬季放牧利用（每年12月至次年4月）。

2017年8月，選擇補(bǔ)播10年及相鄰的未補(bǔ)播的中度退化草地各10 hm2（表1）作為試驗樣地，在補(bǔ)播草地及未補(bǔ)播草地（對照）各選擇植被均勻、具有代表性的區(qū)域設(shè)置10 m×20 m試驗小區(qū)，小區(qū)間隔100 m，4次重復(fù)。在每小區(qū)隨機(jī)選取4個面積為50 cm×50 cm的樣方，對植被群落特征進(jìn)行調(diào)查。采用蛇形取樣法，以直徑3.5 cm的土鉆在各小區(qū)采集0—10 cm和10—20 cm土樣，每小區(qū)5—8鉆分層混合為1個土樣，過2 mm篩，撿除枯物、石粒及植物根系等，封裝在自封袋，夾棉塞，冰盒取回4 ℃保存，一周內(nèi)分析測試微生物生物量碳、氮、群落多樣性及碳源利用（黨雯等，2015）。

1.3 微生物群落多樣性分析方法

采用Biolog-Eco分析土壤微生物6類碳源利用能力。

（1）AWCD為平均每孔顏色變化率（average well change devolopment），是表征土壤微生物活性和多樣性的一個重要指標(biāo)，其值可以反映微生物對單一碳源的利用能力，計算式為（金映虹等，2017）：

式中，C為31孔反映孔在590 nm下的吸光值；R為對照孔吸光值；n為碳源種類數(shù)31；C-R的值均大于或等于0，C-R小于0的計算中將其記為0。

（2）選擇Shannon多樣性指數(shù)（H指數(shù)）估算群落多樣性：

式中，Pi為每個孔吸光度/所有吸光度之和。

（3）Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D指數(shù)），反映了群落中最常見的物種，可評估微生物群落優(yōu)勢度：

式中，Pi為每個孔吸光度/所有吸光度之和。

表1 試驗樣地Table 1 Introduction of test site

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；運用SPSS 20.0對各個試驗小區(qū)的植被地上、地下生物量、微生物生物量及微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，顯著水平α=0.05，表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；運用SigmaPlot 14.0作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 補(bǔ)播草地植被生物量變化特征

對補(bǔ)播 10年后和中度退化草地植被地上、地下生物量進(jìn)行分析，補(bǔ)播 10年后和中度退化草地植被地下生物量分別為 19.61 kg·m-3和 20.12 kg·m-3，地上生物量分別為 200.95 g·m-2和 136.05 g·m-2，但是在95%置信區(qū)間補(bǔ)播10年后和中度退化草地間均無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

2.2 土壤微生物量特征

對補(bǔ)播 10年和中度退化草地不同土層土壤微生物量碳、氮進(jìn)行分析，0—10 cm土層的微生物量碳、氮均高于10—20 cm土層（圖2），即0—20 cm的土層中，75%以上的土壤微生物分布在0—10 cm土層中。而微生物量氮在0—10 cm和10—20 cm表現(xiàn)為補(bǔ)播 10年草地顯著高于中度退化草地（P＜0.05）；微生物量碳在0—10 cm和10—20 cm土層均表現(xiàn)為補(bǔ)播 10年草地最高，但與中度退化草地?zé)o顯著差異（P＞0.05）。

2.3 土壤微生物群落多樣性

研究發(fā)現(xiàn)，0—10 cm和10—20 cm土層補(bǔ)播10年草地AWCD大于中度退化草地（圖3），微生物碳源利用率隨培養(yǎng)時間逐漸升高。0—10 cm土層補(bǔ)播10年和中度退化在培養(yǎng)1—4 d，AWCD增長迅速，4 d后增長速率變緩。獨立樣本t檢驗分析顯示，培養(yǎng)第7天補(bǔ)播10年和中度退化草地AWCD無顯著差異（P＞0.05）（表2）。10—20 cm土層中中度退化和補(bǔ)播 10年草地的碳源利用率隨時間呈現(xiàn)線性增長，且培養(yǎng)第7天時補(bǔ)播10年草地AWCD顯著高于中度退化草地（P＜0.05）。

圖1 草地植被地上（Ba）、地下生物量（Bu）Fig. 1 Effects of reseeding on above (Ba) and underground (Bu) biomass of degraded grassland vegetation

圖2 土壤微生物生物量碳、氮的分布特征Fig. 2 Distribution characteristics of soil microbial biomass carbon and nitrogen

圖3 土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）Fig. 3 Average color change rate of soil microorganisms (AWCD)

表2 培養(yǎng)第7天土壤微生物多樣性指數(shù)Table 2 Soil microbial diversity index at day 7 of cultivation

對補(bǔ)播10年草地和中度退化草地的H和D進(jìn)行分析（圖4），0—10 cm和10—20 cm的土層補(bǔ)播10年草地H和D略高于中度退化草地，且H和D隨培養(yǎng)時間逐漸升高。0—10 cm土層中補(bǔ)播10年和中度退化草地的H指數(shù)在培養(yǎng)1—3 d增長迅速，培養(yǎng)3 d后增長速率變緩，培養(yǎng)5 d趨于平緩，培養(yǎng)7 d兩處理無顯著差異（P＞0.05）（表2）；10—20 cm的土層中補(bǔ)播10年和中度退化草地H指數(shù)在培養(yǎng)1—3 d增長較為迅速，培養(yǎng)3 d后增長速率變緩，且培養(yǎng)7 d補(bǔ)播10年草地顯著高于中度退化草地（P＜0.05）。0—10 cm土層中補(bǔ)播10年和中度退化草地D指數(shù)在培養(yǎng)1—3 d增長迅速，培養(yǎng) 3 d趨于平緩，培養(yǎng) 7 d兩處理無顯著差異（P＞0.05）；10—20 cm土層中補(bǔ)播10年和中度退化草地D指數(shù)在培養(yǎng)1—2 d增長迅速，培養(yǎng)2 d后增長速率變緩并趨于平衡，培養(yǎng)7 d兩處理無顯著差異（P＜0.05）。

2.4 土壤微生物對6類碳源利用能力分析

圖4 土壤微生物Shannon指數(shù)（H）及Simpson指數(shù)（D）Fig. 4 Shannon (H) and Simpson index (D) of soil microorganisms

圖5 草地土壤微生物對6類碳源利用率Fig. 5 Utilization rate of 6 types of carbon sources by soil microorganisms

培養(yǎng)7 d，中度退化草地和補(bǔ)播10年草地6大類碳源利用能力表現(xiàn)差異（圖5）。0—10 cm中度退化草地土壤碳源利用表現(xiàn)為氨基酸＞單糖類＞胺類＞酯類＞酸類＞醇類的利用，補(bǔ)播 10年草地單糖類＞氨基酸＞酯類＞胺類＞醇類＞酸類，其中補(bǔ)播 10年草地單糖利用占比顯著高于中度退化草地；其他碳源利用變化差異不顯著。10—20 cm中度退化草地中碳源利用表現(xiàn)為氨基酸＞胺類＞酯類＞單糖＞酸類＞醇類，補(bǔ)播10年后草地氨基酸＞酯類＞胺類＞酸類＞醇類＞單糖，其中單糖和酯類利用占比差異顯著，補(bǔ)播 10年草地單糖利用占比顯著高于中度退化草地，而酯類顯著低于中度退化草地。

2.5 微生物對六類碳源利用特征分析

本試驗選取補(bǔ)播10年和中度退化草地0—10 cm土層作進(jìn)一步的碳源選擇利用分析。補(bǔ)播 10年草地碳源利用數(shù)據(jù)提取2個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到93.41%，其中第一軸主成分（PCA1）方差貢獻(xiàn)率為66.83%，第二主成分（PCA2）的方差貢獻(xiàn)率為26.58%（圖6A）；而中度退化草地第一、二累計方差貢獻(xiàn)為97.87%（圖6B），這說明未退化草地對碳源選擇利用較集中和穩(wěn)定。六類碳源的主成分矩陣顯示（表 3、4），不同處理微生物群落在兩個培養(yǎng)期對碳源選擇利用以氨基酸類為主導(dǎo)碳源。

表3 補(bǔ)播10年草地0—10 cm土壤微生物對6類碳源利用主成分矩陣Table 3 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland after 10 years of reseeding

表4 未補(bǔ)播草地0—10 cm土壤微生物對6類碳源的主成分矩陣Table 4 Component matrix of the six type of carbon sources by 0-10 cm soil microorganisms in grassland of never reseeded

2.6 補(bǔ)播草地土壤微生物生物量與群落多樣性的相關(guān)性分析

土壤微生物平均顏色變化率（AWCD）與微生物生物量碳呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表 5），與微生物生物量氮呈極顯著正相關(guān)（P＜0.05）；多樣性H和D指數(shù)與微生物生物量碳、氮都呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其中微生物量氮與多樣性D指數(shù)相關(guān)系數(shù)最大。

圖6 中度退化（A）、補(bǔ)播10年草地（B）微生物對6類碳源代謝的主成分圖Fig. 6 Principal component analysis of 6 types of carbon sources by microorganisms in moderately degraded grassland (A) and grassland after 10 years of reseeding (B)

表5 土壤微生物AWCD、H指數(shù)、D指數(shù)和微生物生物量碳、氮相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficients of soil microorganism AWCD, H index and D index with microbial biomass carbon, nitrogen

3 討論

補(bǔ)播以近自然的措施在短期內(nèi)顯著提高草地生產(chǎn)力，石鋒（2009）對草地碳庫研究指出，補(bǔ)播會顯著影響草地碳庫，具體表現(xiàn)在對土壤質(zhì)量的改善和地上生物量的增加。本研究發(fā)現(xiàn)在中度退化高寒草甸補(bǔ)播青海草地早熟禾 10年對植被地上、下生物量無顯著影響（P＞0.05），這可能與補(bǔ)播周期有關(guān)，補(bǔ)播初期新增加的物種還未得到完全生長，有些種子還處于萌發(fā)的狀態(tài)，隨著補(bǔ)播年限的增加，草地生產(chǎn)力達(dá)到最大值，之后隨著管理水平等的降低草地生產(chǎn)力會逐漸降低。另一方面，補(bǔ)播草地不同于天然草地，其生態(tài)和生產(chǎn)功能難以長時間維持平衡，同時補(bǔ)播使禾草增加，影響了原生植被種間競爭關(guān)系，使得總物種數(shù)減少，草地可食牧草比例增加（陳子萱等，2011）。有研究指出補(bǔ)播 2年后植被地上生物量顯著高于退化草地（孫磊等，2012），2—4年內(nèi)補(bǔ)播草地的地上生物量會達(dá)到最大（李希來等，2018），而此后由于環(huán)境因素和種間競爭等關(guān)系復(fù)雜，群落可能出現(xiàn)演替不確定性。

微生物生物量被稱為活的有機(jī)質(zhì)，其大小是判定土壤肥力高低及其變化的重要依據(jù)，可作為非穩(wěn)定性有機(jī)碳的指示器反映有效養(yǎng)分的狀況和生物活性的變化（Rui et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)播10年后，微生物量碳與未補(bǔ)播草地?zé)o顯著差異，表明補(bǔ)播 10年后補(bǔ)播措施的影響基本消失。補(bǔ)播后微生物的數(shù)量及其多樣性可能是短期內(nèi)增加（3—5年），隨著管理水平等措施的下降微生物區(qū)系也出現(xiàn)下降的趨勢。姬萬忠等（2016）在天祝對補(bǔ)播3年的退化高寒草甸的研究發(fā)現(xiàn)，與沒有補(bǔ)播的草地相比，補(bǔ)播草地土壤微生物量C和N分別增加了23.50%和50.78%，說明補(bǔ)播初期對退化草地土壤微生物有一定的影響。邵建飛（2009）研究指出，補(bǔ)播3年的草地土壤微生物生物量C、N含量顯著高于補(bǔ)播6年草地，建議3—4年后再次進(jìn)行補(bǔ)播。因此補(bǔ)播草地的微生物生物量在 1—3年是增加的趨勢，但是隨著補(bǔ)播年限的增加補(bǔ)播影響會減弱甚至消失。

微生物群落的 AWCD既反映了微生物對碳源的整體利用水平，也可以衡量31種碳源利用程度，能夠簡便分析出微生物群落碳源利用的動力學(xué)特征（陳喜蓉等，2017）。本研究中補(bǔ)播和中度退化草地 AWCD均隨培養(yǎng)時間呈緩慢上升趨勢。這說明試驗樣地缺乏有效的碳源營養(yǎng)物質(zhì)，樣地整體呈現(xiàn)退化的狀態(tài)，微生物群落處于較低代謝活力的狀態(tài)（馮?，|等，2016），單一碳源就能夠激發(fā)處理土樣中微生物代謝活力，并慢慢趨于平緩。而本研究的主要目的是比較分析補(bǔ)播和中度退化草地的微生物，補(bǔ)播和中度退化草地0—10 cm土壤微生物對碳源利用能力差異不顯著，補(bǔ)播 10年后對中度退化草地土壤微生物區(qū)系的擾動影響基本消失。相關(guān)性分析顯示AWCD與微生物生物量C、N極顯著正相關(guān)，說明環(huán)境中碳源越豐度越有利于土壤微生物生物量的積累，土壤微生物碳氮磷存在明顯的“Redfield Ratio”效應(yīng)，即土壤微生物生物量的化學(xué)計量比是嚴(yán)格定義的，微生物生物量養(yǎng)分比率存在動態(tài)平衡控制（Cory et al.，2007），土壤微生物通過調(diào)節(jié)自身生理特性來應(yīng)對環(huán)境變化（Allison et al.，2010），即微生物生物量C∶N達(dá)到一定的比例后才能進(jìn)行碳氮的轉(zhuǎn)化循環(huán)。H和D指數(shù)用來估算種群多樣性高低和微生物群落的優(yōu)勢度（柳炳俊等，2020）。本研究中補(bǔ)播草地的微生物多樣性和均勻度均高于中度退化草地，但差異并不顯著（P＞0.05），尤其是0—10 cm土層未表現(xiàn)任何差異，而微生物的80%集中在近表層（0—10 cm土層）（趙文等，2020）?？傮w上，微生物的區(qū)系并沒有在補(bǔ)播10年后發(fā)生改變，這與陳子萱等（2011）的研究一致，認(rèn)為補(bǔ)播只是改良措施的一種，不會對草地的退化有本質(zhì)的改變，也不能使得退化草地得到恢復(fù)或逆向演替，只是一種短期內(nèi)提高草地生產(chǎn)力的措施。同時土壤碳源是影響土壤微生物群落動態(tài)的重要因素，可根據(jù)土壤微生物對不同類型碳源的相對利用程度，反映微生物的代謝功能類群（張紅等，2014；趙輕舟等，2018）。本研究碳源利用顯示，中度退化草地補(bǔ)播后碳源利用發(fā)生改變，單個碳源利用能力在兩草地間無顯著差異（P＞0.05），進(jìn)一步碳源利用主成分分析顯示，補(bǔ)播和中度退化草地近表層土壤微生物主要利用氨基酸類碳源，進(jìn)一步說明補(bǔ)播10年后，補(bǔ)播效果逐漸消失。

4 結(jié)論

在中度退化草地進(jìn)行補(bǔ)播恢復(fù)措施，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)播10年后草地的植被上和地下生物量、微生物生物量碳、土壤微生物多樣性指數(shù)AWCD、H指數(shù)、D指數(shù)和碳源利用能力與未補(bǔ)播草地差異不顯著（P＞0.05）。即補(bǔ)播10年后草地與未補(bǔ)播草地基本一致，補(bǔ)播效果消失。