入侵植物劍葉金雞菊種群遺傳多樣性及克隆多樣性研究

曾建軍，王寧

井岡山大學生命科學學院，江西 吉安 343009

入侵植物因?qū)Νh(huán)境、生物多樣性等造成危害而受到廣泛關(guān)注，入侵機制是入侵生態(tài)學一個非常重要的研究內(nèi)容，其中對繁殖機制的研究有助于揭示外來植物入侵和擴張機理（Burrell et al.，2015；Van et al.，2015）。許多入侵植物同時進行有性繁殖和無性繁殖，其中克隆生長是最主要的無性繁殖方式（Douhovnikoff et al.，2003）。克隆生長不可避免會增加傳粉者在同一克隆內(nèi)訪花頻率，從而導致雌性適合度（如種子產(chǎn)量）下降（田昊等，2018），尤其是克隆構(gòu)型為密集型的植物，其交配系統(tǒng)存在異交向自交進化的選擇壓力（Barrett et al.，2008）。但是，研究表明自然界中仍有許多密集型克隆生長的植物仍保持專性異交特性，克隆植物如何規(guī)避克隆生長帶來的同株異花授粉的影響，從而為異交提供更多的機會？該問題引起越來越多的生態(tài)學家和進化生物學家的關(guān)注（Barrett，2015）。克隆生長通過影響克隆大小、種群克隆結(jié)構(gòu)等方面影響花粉傳播模式，進而影響個體的有性繁殖成功（田昊等，2018）。對種群遺傳多樣性和克隆多樣性，將有助于了解種群更替動態(tài)及繁殖策略（Torimaruet al.，2005；Mandel et al.，2019）。入侵植物在被引入到新的棲息地之后，必須克服一系列的障礙，最重要的一種障礙即為繁殖，其中必定蘊涵著復雜多樣的適應與進化信息，對入侵克隆植物繁殖機制的研究，為揭示克隆生長對有性繁殖的影響提供了很好的研究視角（Garcia et al.，2002；Bai et al.，2013）。

劍葉金雞菊（Coreopsis lanceolata）原產(chǎn)于北美，為菊科金雞菊屬多年生草本克隆植物，1936年作為園林植物引入我國江西廬山（萬慧霖等，2008；許媛等，2009）。劍葉金雞菊具有密集和游擊型克隆生長特性，雖然交配系統(tǒng)為專性異交，但克隆生長并未影響到有性繁殖成功，單株種子產(chǎn)量大（曾建軍等，2010）。正因為適應性、繁殖能力強，劍葉金雞菊逃逸為有害野生雜草，被列為我國主要外來入侵物種之一（徐海根等，2004）。江西廬山屬海拔直落差大的山地環(huán)境，是研究物種入侵與生態(tài)環(huán)境的一個天然的實驗平臺（萬慧霖等，2008），本研究以江西廬山劍葉金雞菊不同海拔（低和高海拔）、不同人為干擾程度（干擾大的公路旁綠化帶和干擾小的荒地）種群為實驗對象，通過AFLP分子標記方法分析種群遺傳多樣性、克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)，調(diào)查不同種群種子結(jié)實率，探討劍葉金雞菊克隆生長對有性繁殖的影響，以期為揭示劍葉金雞菊入侵機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

樣地設(shè)置于江西廬山，地理坐標在 115°50′—116°10′E，29°28′—29°45′N，總面積為 30500 hm2，具典型中亞熱帶季風侯特征和山地氣候特色，年平均氣溫16.7 ℃，年平均降水量約1300 mm（楊道德等，2007）。

1.2 試驗材料與分析方法

1.2.1 供試材料

選擇江西廬山高海拔公路旁綠化帶、高海拔荒地和低海拔荒地共3個劍葉金雞菊種群，各種群的基本情況見表1。將各種群按照50 cm×50 cm劃分的連續(xù)正方形，記錄空間坐標（圖1）對每個點上的個體進行定位取樣，每株取健康幼嫩葉片，放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存?zhèn)溆茫↙i et al.，2009；Jiao et al.，2020）。依照 Douhovnikoff et al.（2003）的方法標記7株不同基因型個體，每基株分別取3株克隆分株的葉片，共21個樣，同樣的方法干燥保存作為對照組，用于計算 Jaccard’s相似系數(shù)閾值（T）。

1.2.2 試驗方法

1.2.2.1 DNA提取

采用的Wilson et al.（2005）方法提取總DNA。

1.2.2.2 AFLP分析

反應總體系為20 μL，包括4 μL模板DNA（50 ng·μL-1），2 μL Hind III/Mse I，1 μL Adapter，2.5 μL 10 mM ATP，2.5 μL 10X Reaction buffer，7 μL AFLP-Water，1 μL T4 Ligase，混勻離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。預擴增反應體系 25 μL，含 2 μL 模板 DNA，1 μL dNTPs，1 μL Pre-ampmix，2.5 μL 10X PCR buffer，0.5 μL Taq DNA polymease，18 μL水。離心數(shù)秒，PCR擴增循環(huán)30輪，擴增參數(shù)：變性94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s下復性，延伸72 ℃條件下80 s，72 ℃ 5 min。按1∶20稀釋預擴增產(chǎn)物，作為選擴模板。選擇性擴增體系反應體系25 μL，含預擴增稀釋樣品2 μL，0.5 μL dNTPS，2.5 μL 10XPCR buffer，1 μL（共 8 種）Mse I引物，1 μL（共 8 種）Hind III引物，0.5 μL Taq酶，17.5 μL H2O。擴增程序如下：第一輪擴增參數(shù)：94 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，80 s。以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，擴增12輪，然后按94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，80 s參數(shù)擴增23輪。通過ABI 377測序儀進行AFLP多態(tài)性分析。從100個引物中篩選出清晰、不彌散、不模糊且重復性好的條帶，陰性對照中無帶的引物作為正式擴增引物。擴增使用8個引物序列：Eco-AAC/Mse-CAA；Eco-AAG/Mse-CAC；Eco-ACA/Mse-CAG；Eco-ACT/Mse-CAT；Eco-ACC/Mse-CTA；Eco-ACG/Mse-CTC；Eco-AGC/Mse-CTG；Eco-AGG/Mse-CTT。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

遺傳多樣性參數(shù)計算方法：對照反應產(chǎn)物在凝膠上的對應位置，統(tǒng)計電泳圖譜中70—500 bp的條帶，“1”為有帶，“0”為無帶，生成0/1矩陣。采用POPGEN 32軟件計算多態(tài)位點百分率、有效等位基因數(shù)（Effective numbers of alleles，Ne）、等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity，H）和 Shannon’s信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）用來估算基因多樣性（宋振等，2019）。

采用Douhovnikoff et al.（2003）方法計算兩兩樣本是否來自同一克?。ɑ辏Ｓ嬎阃环N群兩兩樣本（x和y）間Jaccard’s相似系數(shù)Sxy，Sxy=n11/(n11+n10+n01)，n11是個體x和y都有的條帶數(shù)，n10是只在x個體上特異性條帶數(shù)量，n01是只在y個體上的特異性條帶數(shù)量。相似系數(shù)的計算用SPAGeDi 1.4軟件。當兩植株間相似系數(shù)Sxy大于Jaccard’s相似系數(shù)閾值T值時，認為這兩株植物屬于同一克?。ɑ辏╓ilson et al.，2005）。

采用以下3個參數(shù)估算克隆多樣性：（1）基因型比例（G/N）=G/N（Dorken et al.，2001；Liet al.，2009）；（2）Simpson多樣性指數(shù)（D）；（3）基因型分布均勻度（E）（Pielou，1969；李鈞敏等，2009）。

表1 劍葉金雞菊的不同生境概況Table 1 The conditions of the different habitants of C. lanceolata

圖1 種群基株分布圖Fig. 1 Distribution of genets in different population

結(jié)實率計算方法：選取樣地標記 10個植株，每株選取果實5個，計算每株植株結(jié)實率以及每個種群的平均結(jié)實率。

3 結(jié)果與分析

3.1 劍葉金雞菊不同種群遺傳多樣性分析

對劍葉金雞菊種群遺傳多樣性分析表明（表2），3個種群多態(tài)性位點百分率（P）均很高，最低為廬山植物園種群（LBG）89.74%，最高石門澗種群（SMJ）可達 95.13%。Shannon’s指數(shù)最大的是石門澗種群（SMJ）為0.51，指數(shù)排序為石門澗種群 (SMJ)＞牯嶺種群 (GL)＞廬山植物園種群(LBG)。以Nei’s多樣性指數(shù)（H）為指標3個種群的排序與Shannon’s指數(shù)排序結(jié)果一致。

3.2 劍葉金雞菊不同種群克隆多樣性分析

為了辨別種群內(nèi)不同株是否來自同一克隆，通過對21個樣（7個不同基因型基株，每株分別取3個克隆分株）AFLP分析，計算出Jaccard’s相似系數(shù)閾值為0.88，即兩兩植株相似系數(shù)大于該閾值即認為來自同一克隆。由表3可知，牯嶺（GL）種群的基因型比例和 Simpson多樣性指數(shù)最低（G/N=0.65，D=0.91），石門澗（SMJ）種群最高（G/N=0.88，D=0.98）?；蛐途鶆蚨龋‥）最高為廬山植物園（LBG）種群0.87，牯嶺（GL）和石門澗（SMJ）種群分別為0.53和0.57。3個種群克隆分株間平均距離1.2 m，范圍0.93—1.65 m，克隆分株最遠距離為1.80 m。

3.3 不同種群劍葉金雞菊結(jié)實率分析

圖2結(jié)果表明，無論是高海拔還是低海拔種群，或者人工擾動大的公路旁及干擾低的荒地種群，劍葉金雞菊均有較高結(jié)實率，每個種群結(jié)實率平均數(shù)在64.97%—70.93%之間，不同種群之間的結(jié)實率差異不顯著。

4 討論

本研究AFLP分子標記分析結(jié)果表明，不同生境劍葉金雞菊天然種群均有較高遺傳多樣性。曾建軍等（2010）分析了劍葉金雞菊結(jié)實特征，其單株種子產(chǎn)量達到12000粒，種子千粒質(zhì)量 (1794±18)mg，種子萌發(fā)率在60%以上，落地可繁殖。我們推測有性繁殖能力強是劍葉金雞菊種群遺傳多樣性高的重要原因。由于天然屏障作用，入侵植物從低海拔向高海拔擴散能力逐漸減低，植物的遺傳多樣性可能隨海拔升高而降低（Alpertet al.，2000；Pauchardet al.，2009）。但是Bustamante et al.（2017）研究發(fā)現(xiàn)入侵植物花菱草（Eschscholzia californica）從低海拔到高海拔遺傳多樣性并未減低的現(xiàn)象。通過分子標記方法顯示，人類多次引入是入侵克隆植物Furcraea foetida(L.)引入地種群和入侵地種群均可保持高遺傳多樣性的重要因素（Barbosa et al.，2019）。劍葉金雞菊屬于多次引入園林植物（萬慧霖等，2008），因此我們推斷，多次引入是劍葉金雞菊種群保持較高遺傳多樣性水平的原因之一。種群遺傳多樣性高有利于植物有性繁殖成功（Reed et al.，2003；Kettenring et al.，2019），劍葉金雞菊種群較高的遺傳多樣性同時也提高了有性繁殖適合度，促進有性繁殖成功，提高入侵能力。

表2 劍葉金雞菊不同種群遺傳多樣性分析Table 2 Statistical analysis of genetic variation of C. lanceolata in different population

表3 劍葉金雞菊不同種群克隆多樣性分析Table 3 Statistical analysis of Clonal diversity of C. lanceolata in different population

圖2 劍葉金雞菊不同種群結(jié)實率Fig. 2 Setting rate of C. lanceolata in different population

克隆植物種群的基因型比例G/N的平均值約為0.44（Honnayet al.，2008），本研究中劍葉金雞菊3個種群基因型G/N平均值為0.77，較高G/N值表明劍葉金雞菊種群內(nèi)植株體大多來自不同基株，說明游擊型生長對提高劍葉金雞菊種群不同基因型混合度及拓殖種群的作用有限。有性繁殖是克隆植物種群保持較高基因型比例的機制（Bona et al.，2019；Hedrén et al.，2019），劍葉金雞菊種群較高的克隆多樣性進一步表明有性繁殖是該物種種群更替非常重要的繁殖策略。Albert et al.（2008）認為，種群克隆多樣性水平與異交率正相關(guān)關(guān)系，例如歐洲越桔（Vaccinium myrtillus）克隆多樣性高的種群異交率也更高。本研究中廬山3個劍葉金雞菊自然種群果實平均結(jié)實率均達64.97%以上，與人工模擬基因型均勻混合種群平均結(jié)實率64%基本一致（曾建軍等，2014），進一步說明劍葉金雞菊的克隆生長并未影響異株異花傳粉，推測這與其種群克隆多樣性高密切相關(guān)。

花粉擴散距離與克隆大小之間的關(guān)系也影響異交率。Sinclair et al.（2014）研究了克隆植物波喜蕩（Posidonia australis）的傳粉過程，通過水為媒介，花粉擴散距離可達178 m，遠遠大于其克隆平均大小30.8 m，因此保證了充足的異株異花花粉數(shù)量。在本研究中，劍葉金雞菊種群內(nèi)克隆分株間平均距離較小為1.2 m，最遠距離僅1.8 m。曾建軍等（2014）研究了劍葉金雞菊主要傳粉昆蟲的一次最長飛行距離雖然只有60 cm，但傳粉昆蟲在訪花過程中有多個飛行回合，訪問的基株數(shù)最大達到6株，總飛行最遠距離超過 1.8 m。而且我們也觀察到與其它伴生植物比較，劍葉金雞菊的克隆生長產(chǎn)生了更大的花展示，吸引了數(shù)量眾多的傳粉昆蟲，提高了異株花粉資源輸出，因此保障了異交交配系統(tǒng)的繁殖成功。

5 結(jié)論

江西廬山劍葉金雞菊不同海拔（低和高海拔）、不同干擾程度（干擾大的公路旁綠化帶和干擾小的荒地）種群均有較高遺傳多樣性，有性繁殖能力強和多次引入是該克隆植物保持種群高遺傳多樣性的重要原因。種群較高的遺傳多樣性同時也提高了劍葉金雞菊有性繁殖適合度，促進有性繁殖成功。種群克隆多樣性高減低了劍葉金雞菊同株異花授粉幾率，推測劍葉金雞菊的克隆生長產(chǎn)生了更大的花展示，通過吸引數(shù)量眾多的傳粉昆蟲，提高異株花粉資源輸出，因此保障了劍葉金雞菊專性異交交配系統(tǒng)有性繁殖成功。