紅參加工副產(chǎn)物蒸參露主要化學(xué)成分分析

謝麗娟，李健豪，苑冰冰，劉寶峰，徐芳菲，婁子恒，張玉靜，曹志強(qiáng)*

（1.吉林人參研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130022；3.康美新開(kāi)河（吉林）藥業(yè)有限公司，吉林 通化 134200）

人參為五加科人參屬多年生草本植物[1]，是眾所周知的傳統(tǒng)名貴中藥，其主要活性物質(zhì)包含人參皂苷、人參多糖、人參揮發(fā)油、氨基酸等多種成分[2-3]。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)人參具有提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性和總抗氧化的能力，從而達(dá)到抗衰老的作用[4-6]。同時(shí)，人參能有效促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并且在異體移植神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子發(fā)揮了協(xié)同增效作用進(jìn)而得到人參中有效成分可通過(guò)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的促進(jìn)而達(dá)到防治老年癡呆的效果[7-9]。人參主產(chǎn)于我國(guó)東北長(zhǎng)白山延脈，吉林省作為人參主要道地產(chǎn)區(qū)，鮮參年產(chǎn)量可達(dá)2萬(wàn)噸～5萬(wàn)噸，大量被用以加工成紅參，在鮮參蒸制加工成紅參的過(guò)程中，由于其加工工藝的獨(dú)特性，會(huì)有大量帶有濃重人參氣味的水蒸氣逸散，通過(guò)冷凝得到一種帶有人參氣味的清澈微黃色液體被稱為蒸參露。生成的蒸參露是紅參加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，一般情況下作為廢料被丟棄，不僅對(duì)環(huán)境造成了極大污染，也是一種資源的極大浪費(fèi)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)蒸參露中主要含有大量半萜及倍半萜類物質(zhì)及少量脂肪族、芳香族化合物[10-11]、少量人參皂苷及可溶性多糖，其主要成分以β-欖香烯、人參炔醇和人參環(huán)氧炔醇為主[12-13]。有藥理學(xué)試驗(yàn)表明β-欖香烯對(duì)癌細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。除此之外，人參環(huán)氧炔醇中多種成分的協(xié)同作用可以破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜通透性[14-16]，影響細(xì)菌物質(zhì)的能量代謝，繼而對(duì)一些常見(jiàn)菌種如金黃色葡萄球菌、放線菌、幽門螺桿菌等均具有抑制作用，并廣泛用于藥品、食品等多種領(lǐng)域[17-19]。本文通過(guò)對(duì)來(lái)自于不同廠家的兩種較有代表性蒸參露進(jìn)行了系統(tǒng)分析，對(duì)其多糖、皂苷及揮發(fā)性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè)研究，為人參及其加工品日后的研究提供理論依據(jù)，也對(duì)將來(lái)蒸參露的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)作好理論及試驗(yàn)基礎(chǔ)，為人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：Fisher公司；人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：中國(guó)食品藥品檢定研究院；1號(hào)蒸參露：康美新開(kāi)河（吉林）藥業(yè)有限公司；2號(hào)蒸參露：集安市吉聚參業(yè)有限公司；乙醇、乙醚、正己烷、濃硫酸、苯酚（均為分析純）：北京化工廠。

SQP電子天平：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵：上海振捷儀器設(shè)備有限公司；SP-1920紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器設(shè)備有限公司；3H16RI智能高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、色譜柱（ZORBAX SB-C18 250 mm×4.6 mm，5 μm）、890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：美國(guó)安捷倫公司。

1.2 紫外分光光度法檢測(cè)人參多糖含量

1.2.1 供試品溶液的制備

分別稱取1、2號(hào)樣品各100 mL置容量瓶中，在超聲波中萃取30 min，將提取液放入100℃水浴中提取4 h，冷卻至室溫20℃～25℃，定容至100 mL容量瓶，取5 mL提取液加80%乙醇溶液15 mL混勻，在高速離心機(jī)上以10000r/min的速度離心10min，棄去上清液，分別再次加入80%乙醇混勻離心2次，棄去上清液，殘?jiān)盟芙庥?00 mL容量瓶中作為待測(cè)液，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.01 mg/mL）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 具塞刻度試管中，加水至2.0 mL。再各加5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5 mL振搖5 min，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫20℃～25℃，以試劑空白為參比，于486 nm測(cè)定吸光度。

1.2.3 供試品的測(cè)定

取1、2號(hào)樣品各2 mL于25 mL具塞刻度試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，快速加入硫酸5 mL，振搖5 min，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min取出冷卻至室溫20℃～25℃，以試劑空白為參比，于486 nm測(cè)定吸光度。

1.3 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定人參皂苷含量

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱量人參皂苷 Re、Rb1、Rg1各 2 mg，分別加甲醇定容至10 mL，配制成0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

1.3.2 供試品溶液的制備

分別稱取1、2號(hào)樣品500 mL置于分液漏斗中加入250 mL水飽和正丁醇，搖勻反復(fù)萃取3次，棄去下層液，合并上層液，減壓濃縮蒸干，加入甲醇分別定容至10 mL容量瓶中，待測(cè)。同時(shí)為保證樣品中基質(zhì)不干擾色譜峰，分別精密量取1、2供試品待測(cè)液各0.5 mL，分別加入0.5 mL待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成1 mL加標(biāo)樣品溶液。

1.3.3 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量 20 μL，柱溫 30 ℃，流速 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，0～35 min，19%（A）81%（B），35 min～35 min，19%～29%（A）81%～71%（B），55 min～70 min，29%（A）71%（B），70 min～100 min，29%～40%（A）71%～60%（B），將 1、2 號(hào)樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)入HPLC進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)2015版《中國(guó)藥典》一部人參項(xiàng)下含量測(cè)定及四部通則0512高效液相色譜法測(cè)定。

1.4 GC-MS測(cè)定蒸參露中揮發(fā)性成分

1.4.1 供試品溶液的制備

分別稱取1、2號(hào)蒸參露500 mL，置于分液漏斗中，分別加入250 mL乙醚反復(fù)萃取3次，減壓濃縮至乙醚揮盡，精密加入正己烷溶液25 mL，振搖，靜置分層，吸取正己烷層，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液1 μL，待測(cè)。

1.4.2 GC-MS檢測(cè)條件

檢測(cè)條件：HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×250.00 μm，0.25 μm）；載氣為 He；載氣流量 1.0 mL/min；程序升溫條件：初始溫度60℃，保持3.0 min，以8℃/min升至280℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度260℃；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間2.00 min。MS條件：EI離子源；電子能量 70eV；質(zhì)量范圍 m/z20～600；MS Quad為150℃；MS Source為230℃；NIST-2008標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法檢測(cè)人參多糖含量

由1.2.2所制備葡萄糖對(duì)照品經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定得到回歸曲線，如圖1所示。A=0.007 6C+0.003 3 R=0.999 40，表示在此范圍內(nèi)濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

將1、2號(hào)樣品再分別進(jìn)行紫外分光光度法鑒別，經(jīng)計(jì)算得出1號(hào)樣品中多糖含量14.8 μg/mL，2號(hào)樣品中多糖含量16.5 μg/mL，。由此可知1、2號(hào)樣品蒸參露中多糖含量極低。因此，在人參蒸制加工成紅參過(guò)程中產(chǎn)生的蒸汽冷凝后所得水溶液——蒸參露中僅含有微量多糖成分。

2.2 HPLC法測(cè)定人參皂苷含量

HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.2 Ginsenoside standard HPLC chromatogram

由圖3、圖4可見(jiàn)1、2號(hào)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比無(wú)明顯皂苷成分存在，同時(shí)通過(guò)樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的回收率1、2號(hào)樣品Re分別為103.0%、105.0%，Rb1為 102.2%、106.3%，Rg1為 102.6%、103.7%，均在標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍內(nèi)，可進(jìn)一步顯示樣品中無(wú)明顯皂苷成分存在，色譜圖中存在少量細(xì)小雜峰，可能是人參加工成紅參過(guò)程中所產(chǎn)生的微量次級(jí)皂苷，因其收集方式的不同而帶入到蒸參露中，加工過(guò)程中機(jī)器安裝存在泄漏點(diǎn)或密封性未達(dá)到要求也會(huì)導(dǎo)致部分可溶性皂苷滲入蒸參露中。通過(guò)改良蒸參露收集方式可以有效控制此類情況的發(fā)生。由此也可以得出結(jié)論，蒸參露中并無(wú)明顯人參皂苷成分。

圖3 1、2號(hào)樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sample No.1 and No.2

圖4 1、2號(hào)樣品加標(biāo)HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of No.1 and No.2 samples after adding standards

2.3 GC-MS測(cè)定揮發(fā)性成分

2個(gè)樣品總離子流圖見(jiàn)圖5、圖6。結(jié)合相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)資料從1號(hào)、2號(hào)樣品中分別定性鑒別出27種、28種化合物，其相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1及表2。

由表1、表2可知，從化合物類型來(lái)看，蒸參露中揮發(fā)油所含成分主要有單萜類、倍半萜類、烷烴類，其中倍半萜類化合物為人參揮發(fā)油的特征成分，又分為倍半萜烯類化合物（β-欖香烯、β-花柏烯等，分子式均為C15H24）和倍半萜含氧化合物（主要指醇類，如異蜂斗菜醇、律草烯醇、藍(lán)桉醇、桉油烯醇等，分子式為C15H24O和C15H26O）。

其中β-金合歡烯、β-欖香烯、人參環(huán)氧炔醇為人參揮發(fā)油標(biāo)志化合物，同時(shí)對(duì)比1、2號(hào)樣品，其揮發(fā)性成分種類亦存在明顯差異，并且在各成分的占比上也有很大差異，1號(hào)樣品中含有（E）-β-金合歡烯、β-花柏烯、β-欖香烯、人參環(huán)氧炔醇等；2號(hào)樣品中含有β-花柏烯、β-欖香烯、人參環(huán)氧炔醇等。可見(jiàn)不同廠家因其加工紅參工藝的不同（包括蒸制過(guò)程中溫度高低、壓力大小、時(shí)間長(zhǎng)短的差異），得到的蒸參露的揮發(fā)油類成分具有一定差別。

圖5 1號(hào)樣品總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of sample No.1

圖6 2號(hào)樣品總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of sample No.2

表1 1號(hào)樣品成分分析Table 1 No.1 sample composition analysis

續(xù)表1 1號(hào)樣品成分分析Continue table 1 No.1 sample composition analysis

表2 2號(hào)樣品成分分析Table 2 Composition analysis of sample No.2

3 結(jié)論

本研究對(duì)人參蒸制加工成紅參過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物蒸參露的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析，紫外、高效液相和GC-MS數(shù)據(jù)顯示，蒸參露中含有多種萜類及倍半萜類物質(zhì)，如β-金合歡烯、β-欖香烯、人參環(huán)氧炔醇等，這些成分是人參揮發(fā)油標(biāo)志化合物。因此可以說(shuō)明此副產(chǎn)物蒸參露中含有人參揮發(fā)油。對(duì)人參多糖和人參皂苷的檢測(cè)結(jié)果也表明，蒸參露內(nèi)僅含有微量多糖類及皂苷類成分。且分析皂苷類成分可能是人參加工成紅參過(guò)程中所產(chǎn)生的少量次級(jí)皂苷，因其收集方式不同而帶入到蒸參露中，加工過(guò)程中機(jī)器安裝存在泄漏點(diǎn)或密封性未達(dá)到要求也會(huì)導(dǎo)致部分可溶性皂苷滲入蒸參露中。通過(guò)改良蒸參露收集方式可以有效控制此類情況的發(fā)生。綜上表明，人參蒸制加工成紅參過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物蒸參露富含大量揮發(fā)性物質(zhì)，而雜質(zhì)相對(duì)較少。

本研究發(fā)現(xiàn)蒸參露中含有大量以倍半萜類化合物為主的人參揮發(fā)油，而現(xiàn)有人參揮發(fā)油的提取多以人參根為主，人參根中人參揮發(fā)油含量在0.2%[20-22]左右，由于人參中揮發(fā)油的含量很低，研究、研發(fā)成本較高，所以用人參做為提取揮發(fā)油的原料，無(wú)論從原料還是生產(chǎn)所需成本與最終收益，都完全不成比例，致使其難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。目前針對(duì)人參揮發(fā)油的研究仍處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，人參揮發(fā)油工藝尚未有人進(jìn)行細(xì)致摸索研究。由此，如何以蒸參露作為原料提取人參揮發(fā)油的工藝研究必將成為日后專家學(xué)者研究的重點(diǎn)。從蒸參露中研發(fā)制備人參揮發(fā)油，無(wú)論從資源節(jié)約上還是資源利用上都必將帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。