超聲波輔助提取大新苦丁茶中總黃酮的工藝研究

張貞發(fā)，韋馥軒，趙漢民，翁艷英，陳婷

（廣西民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，桂西南特色植物資源化學(xué)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 崇左 532200）

廣西崇左市大新縣2003年被授予“中國(guó)苦丁茶之鄉(xiāng)”稱號(hào)，原國(guó)家質(zhì)檢總局2006年正式批準(zhǔn)對(duì)“大新苦丁茶”實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[1]。目前大新縣大面積推廣種植的苦丁茶其種名系為Ilex Kudingcha C.J.Tseng，喜高溫多濕而不耐寒，若引至江浙一帶栽培冬季會(huì)凍死，但是口感比大葉冬青好。近年來的科學(xué)研究表明：苦丁茶可以預(yù)防和干預(yù)高脂飲食引起的高脂血癥[2]、保護(hù)肝損傷和胃損傷[3-5]、降低膽固醇[6]、保護(hù)心臟神經(jīng)和皮膚[7-8]，具有抗衰老[9]、減肥[10]等作用，因此常被用作制成輔助治療的功能性飲料[11]，備受人們青睞。苦丁茶中含有的黃酮類物質(zhì)是一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物，具有多種生物活性功能[12]，如抗氧化、抗菌、抗炎等。提取苦丁茶中總黃酮的方法[13]有熱水提取法、乙醇回流法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等，不同的提取方法各有優(yōu)點(diǎn)，都被廣泛地應(yīng)用在總黃酮的提取過程中。其中，超聲波輔助提取的原理主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速被提取成分和溶劑的相互擴(kuò)散，從而加速植物有效成分的浸出提取，因此應(yīng)用比較廣泛。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮苦丁茶嫩葉：采集于廣西大新縣龍門鄉(xiāng)；蘆丁對(duì)照品：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；95%乙醇：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉：成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

CLF-02型封閉粉碎機(jī)：中國(guó)浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；722型可見光分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；AR124CN電子天平：奧豪斯儀器有限公司制造；Φ300國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)篩：新鄉(xiāng)市大漢振動(dòng)機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦丁茶原材料預(yù)處理

將采摘到的苦丁茶樹葉清洗干凈，用剪刀剪成碎片，放入鼓風(fēng)干燥箱中，60℃烘干，置于高速粉碎機(jī)中粉碎，得到苦丁茶粉末，過60目篩，用塑料袋密封包裝好，放入裝有藍(lán)色硅膠的干燥器中備用。

1.2.2 總黃酮的定性檢驗(yàn)

1）Fe3+反應(yīng)：取苦丁茶提取液2.0 mL于試管中，加1滴FeCl3溶液反應(yīng)，振蕩。當(dāng)提取液表現(xiàn)出墨綠色，則證實(shí)其中含有黃酮。

2）HCl-Zn反應(yīng)：取苦丁茶提取液2.0 mL于試管中，先添加少量鋅粉，接著加4滴濃鹽酸進(jìn)行反應(yīng)，振蕩。當(dāng)提取液表現(xiàn)出亮黃色，則證實(shí)其中含有黃酮。

3）NaOH反應(yīng)：取苦丁茶提取液2.0 mL于試管中，加4滴4%的NaOH進(jìn)行反應(yīng)，振蕩。當(dāng)提取液表現(xiàn)出橙紅色，則證實(shí)其中含有黃酮[14]。

4）Al（NO3）4反應(yīng)：取苦丁茶提取液2.0 mL于試管中，加4滴10%的Al（NO3）3溶液，振蕩。當(dāng)提取液呈黃色，則證實(shí)其中含有黃酮。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精準(zhǔn)稱取40.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL燒杯中，加入適量60%的乙醇溶液溶解，待完全溶解后移入100 mL容量瓶中，再用60%乙醇溶液定容至刻線，搖勻，得到質(zhì)量濃度為400 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液。

2）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：精確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液1 mL于25 mL具塞比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min，然后加入4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL，用60%的乙醇溶液稀釋至刻線，搖勻，靜置15 min，用1 cm玻璃比色皿，測(cè)定溶液在400 nm～900 nm的吸收光譜，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 25 mL 具塞比色管中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液 1.0 mL，搖勻，靜置6 min，然后加入4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL，用60%的乙醇溶液稀釋至刻線，搖勻，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的濃度分別為：0.00、16.00、32.00、48.00、64.00、80.00 μg/mL，同時(shí)做空白試驗(yàn)作為參比。靜置15 min，用1 cm玻璃比色皿在波長(zhǎng)510 nm處分別測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，用excel軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.013 2 C-0.005 2，R2=0.999 2。

1.2.4 苦丁茶總黃酮的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.00 g苦丁茶粉末于100 mL的干燥錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液為提取劑，放入設(shè)定溫度的超聲波清洗儀中冷凝回流提取，提取結(jié)束后，迅速抽濾，并用少量60%的乙醇溶液洗滌3次，將濾液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀釋定容到刻度線，搖勻，用移液管準(zhǔn)確移取1.0 mL于25 mL比色管中，同時(shí)做試劑空白，以試劑空白為參比，按照1.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定溶液吸光度。

1.2.5 苦丁茶黃酮提取率的計(jì)算

將測(cè)定的溶液的吸光度代入1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.013 2C-0.005 2，求算出濃度C，提取率計(jì)算如下式：

式中：w為苦丁茶總黃酮的提取率，%；C為總黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為溶液的體積，mL；N為溶液的稀釋倍數(shù)；m為稱取苦丁茶粉末的質(zhì)量，g。

1.2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在苦丁茶粉末稱樣量固定為1 g的情況下，考察分析料液比、乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)單因素對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響。每組單因素試驗(yàn)只保持1個(gè)因素改變，其它3個(gè)因素不變，研究4個(gè)單因素對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)條件為因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，因素水平表如表1。以總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.2操作，對(duì)苦丁茶提取液中黃酮類化合物進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。

表2 苦丁茶提取液中黃酮類化合物的顯色鑒定Table 2 The color identification of flavonoids in the extract of Kuding tea

由表2說明，通過顯色反應(yīng)鑒定，表明提取液中含有黃酮類化合物。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

不同料液比對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響如圖1。

由圖1可看出，當(dāng)料液比處于1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）之間時(shí)，隨著提取劑用量增多，苦丁茶總黃酮提取率不斷增大，在料液比為1∶20（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，隨著提取劑用量的繼續(xù)增多，在料液比為1∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）范圍內(nèi)，提取率隨提取劑用量的增多呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。說明當(dāng)提取劑用量太少時(shí)，不足以完全浸漬苦丁茶粉末樣品，也無法滲入粉末顆粒內(nèi)部，因此隨著提取劑用量增多，浸潤(rùn)和滲入的更徹底，溶出的總黃酮就越多，當(dāng)提取劑的用量能夠完全浸潤(rùn)苦丁茶粉末并滲入粉末內(nèi)部溶出樣品中的絕大部分黃酮時(shí)，提取率達(dá)到最高，繼續(xù)增加提取劑的用量，可能會(huì)溶出一些影響黃酮顯色反應(yīng)及吸光度測(cè)定的雜質(zhì)，或者造成已經(jīng)溶出的黃酮的變性，且過多的使用提取劑，會(huì)造成溶劑與能源的浪費(fèi)，綜合考慮，選擇料液比1∶20（g/mL）時(shí)為最佳。

圖1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of liquid-material ratio on extraction

2.2.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

不同濃度的乙醇溶液提取劑對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響如圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction

由圖2可看出，苦丁茶總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大先增后降。當(dāng)乙醇濃度較小時(shí)，黃酮溶解于提取劑中的溶解推動(dòng)力較小，溶解速率較慢，總黃酮提取率隨著提取劑中乙醇濃度的增加而增大。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值，乙醇濃度超過60%以后，總黃酮的提取率隨著乙醇濃度增大出現(xiàn)降低的情況，可能原因是高濃度的乙醇溶解出了苦丁茶粉末中更多的物質(zhì)，其中一些物質(zhì)影響了黃酮的顯色反應(yīng)，造成了吸光度降低。因此，選擇乙醇濃度60%為最佳。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響如圖3。

由圖3可知，在10 min～20 min時(shí)，總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，20 min時(shí)達(dá)到最大值，隨后其隨時(shí)間的增加而下降。當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，黃酮類化合物未能于提取劑中充分析出，故其提取量不高。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮類化合物析出不斷增多，故提取率逐漸增大。但當(dāng)超聲波作用時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，使得提取率逐漸趨于極限，同時(shí)具有抗氧化性的黃酮類化合物由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在外，容易被氧化分解破壞，導(dǎo)致提取物中雜質(zhì)增多，所以20 min后，其提取率降低。故從總黃酮提取率、節(jié)約時(shí)間等方面綜合考慮，超聲時(shí)間選取20 min最佳。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction

2.2.4 超聲溫度對(duì)提取率的影響

超聲溫度對(duì)苦丁茶總黃酮提取率的影響如圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction

由圖4可知，總黃酮的提取率隨著超聲溫度的不斷升高而逐漸增大，在35℃～50℃時(shí)增長(zhǎng)速度最快，而后隨著溫度升高逐漸趨于平穩(wěn)。形成這樣的原因可能是，溫度對(duì)溶質(zhì)的溶出都有促進(jìn)作用，溫度越高，分子熱運(yùn)動(dòng)速度越快，降低提取劑的黏滯性，使得擴(kuò)散系數(shù)變大，總黃酮提取量則增加，隨著溫度持續(xù)升高到80℃，總黃酮提取率并沒有降低，說明苦丁茶總黃酮在該溫度區(qū)間比較穩(wěn)定，并沒有被破壞。因溫度過高會(huì)增加提取劑的揮發(fā)損失且增大了能耗，選取的超聲溫度為50℃為最佳溫度。

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

依據(jù)2.2單因素所得出的試驗(yàn)結(jié)果及所做出的分析，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，按1.2的試驗(yàn)操作進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3The results of L9（34）orthogonal experiment

根據(jù)表3可以看出，本試驗(yàn)中A、B、C、D4個(gè)因素的主次關(guān)系是 A＞B＞D＞C，即 A（料液比）>B（乙醇濃度）>D（超聲時(shí)間）>C（超聲溫度）?？梢詮恼辉囼?yàn)中看出，用超聲波輔助提取法從苦丁茶中提取總黃酮最優(yōu)的條件組合為A3B3C1D2，故最后可以確認(rèn)的最佳提取工藝為：料液比1∶25（g/mL），乙醇濃度70%，超聲時(shí)間15 min，超聲溫度50℃。

2.3.2 最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)得出最佳工藝的條件為試驗(yàn)條件，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of replication experiment about optimum process

從表4中可以看出，在最佳提取條件下試驗(yàn)3次，苦丁茶總黃酮的提取率平均值為0.772%，3次平行試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.12%。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取大新苦丁茶中的總黃酮，分析料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度4個(gè)單因素對(duì)總黃酮提取率影響。通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到了超聲波輔助提取苦丁茶總黃酮的最佳條件為料液比1 ∶25（g/mL），乙醇濃度 70%，超聲時(shí)間 15 min，超聲溫度50℃。在最佳提取條件下，得到的總黃酮的得率為0.772%。