超聲輔助低共熔溶劑提取甘草多糖的研究

孫悅，何蓮芝，蘇卓文，李志田，劉婭，2*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆石河子832000）

甘草為豆科、甘草屬多年生草本植物，全世界有13種甘草，主要分布于亞洲、美洲中部、北非等地。新疆是我國甘草的主要產(chǎn)地之一[1]。甘草作為藥食兩用資源，其中含有甘草多糖、甘草黃酮和甘草酸等多種生物活性成分[2]，而多糖是人體內(nèi)的一種信息分子，廣泛存在于自然界和生物體中，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用，還能降血脂，延緩衰老、抗疲勞[3-5]，因此多糖的提取和性質(zhì)研究日益受到重視。

傳統(tǒng)的多糖提取，以水為介質(zhì)，存在費時、生產(chǎn)能耗高、活性組分易損失、得率低等不足。而低共熔溶劑作為一種綠色、新型介質(zhì)，由氫鍵受體和氫鍵供體按照一定比例混合構(gòu)成[6]，二者通過氫鍵相互結(jié)合，能夠提供或接受外部電子或質(zhì)子形成氫鍵，使得它們可以溶解多種物質(zhì)，包括多糖、蛋白質(zhì)、藥物活性物質(zhì)和鹽等，因此，可用于植物中極性或非極性組分的有效提取[7-8]。

此外，低共熔溶劑不僅具有離子液體的良好性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性優(yōu)異，與水和有機溶劑混溶[9]，對各種有機化合物具有優(yōu)異的溶解性和萃取性，而且原料易得，成本較低，制備簡單，無污染[10]。

國外已將低共熔溶劑成功應(yīng)用于多酚、多糖、異黃酮、花青素、白藜蘆醇、香草醛[11-16]等多種生物活性成分的提取，而國內(nèi)相關(guān)報道甚少。

為了解低共熔溶劑提取多糖的規(guī)律，本研究以甘草為對象，以低共熔溶劑為提取劑，選取價廉易得的氯化膽堿為氫鍵受體，采用超聲輔助技術(shù)提取其中的多糖類化合物，優(yōu)化甘草多糖提取工藝，從而為甘草多糖的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)，并為后期多糖功能性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料甘草（二級甘草）：新疆和濟中藥飲片有限公司。

氯化膽堿：上海源葉生物科技有限公司；丙三醇：天津市化學(xué)試劑三廠；異丙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；尿素、中性醋酸鉛：天津市永晟精細(xì)化工有限公司；草酸、葡萄糖：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海遠帆試劑廠；氫氧化鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；濃鹽酸：北京化工廠；酚酞：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS 2000S天平（d=0.01 g）：北京賽多利斯天平有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：常州普天儀器制造有限公司；JP-1000B-2高速多功能粉碎機：浙江永康市久品工貿(mào)有限公司；KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；B250智能數(shù)顯恒溫油水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低共熔溶劑的制備

將氯化膽堿與草酸（尿素、異丙醇、丙三醇）等按照一定的摩爾比混合置于錐形瓶中，在恒溫水浴鍋中，保持溫度60℃，攪拌至完全溶解后取出，冷卻至（20±2）℃后得到無色透明液體，裝入試劑瓶中，（20±2）℃下放置一周后仍為均勻透明的液體[17]。

1.3.2 甘草多糖提取的工藝流程

甘草→粉碎脫脂→加入低共熔溶劑攪拌→混勻靜置→超聲輔助提取→加入澄清劑→過濾→粗多糖[18-19]

1.3.3 甘草多糖含量測定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定多糖含量[20]。分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄溶液（100 μg/mL）置于干燥具塞的試管中，分別加蒸餾水至4.0 mL，加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴中10 min，取出，流水冷卻后，510 nm處測定吸光值。以多糖濃度為橫坐標(biāo)x，測出的吸光度為縱坐標(biāo)y，繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.014 4x-0.009 2（R2=0.991 4）。

1.3.4 甘草多糖提取率的計算

式中：C為回歸方程計算得到甘草多糖的濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；M為原材料的質(zhì)量，g。

1.3.5 確定低共熔溶劑體系

根據(jù)計算數(shù)值精確稱取一定量的氯化膽堿與丙三醇、異丙醇和尿素，按照摩爾比 1∶1、1 ∶2、1 ∶3、2 ∶1、3∶1混合，加入適量的水，進行加熱攪拌至完全溶解，直至形成均勻透明的無色液體[22]，低共熔溶劑的種類及摩爾比見表1。

表1 低共熔溶劑的種類及摩爾比Table 1 Types and molar ratios of eutectic solvents

1.3.6 甘草多糖提取單因素試驗

在提取溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃，料液比分別為 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），超聲時間分別為 15、20、25、30、35 min，超聲功率分別為 100、150、200、250、300 W的條件下，按照1.3.2的方法，進行提取溫度、料液比、超聲時間、超聲功率4個因素的單因素試驗[23-25]，考察各因素對甘草多糖提取率的影響。

1.3.7 甘草多糖超聲提取的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗方法，對超聲輔助低共熔溶劑提取甘草多糖的影響因素進行研究和條件優(yōu)化，做出響應(yīng)面圖，建模并分析各因素對響應(yīng)值的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用origin軟件和Design－Expert軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低共熔溶劑體系對甘草多糖提取率的影響

低共熔溶劑是由氫鍵供體和氫鍵受體按照一定摩爾比混合而構(gòu)成，其中氫鍵受體、氫鍵供體種類繁多，二者摩爾比不同、體系含水量不同都會影響多糖提取率。本研究以氯化膽堿為氫鍵受體，考察常見的幾種氫鍵供體對甘草多糖提取率的影響見如圖1～圖3。

圖1 氯化膽堿-丙三醇體系中不同摩爾比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different mole ratio in choline chloride-glycerol system on polysaccharide extraction rate

圖2 氯化膽堿-異丙醇體系中不同摩爾比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different mole ratio in choline chloride-isopropanol system on polysaccharide extraction rate

圖3 氯化膽堿-尿素體系中不同摩爾比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different mole ratio in choline chloride-urea system on polysaccharide extraction rate

從圖1～圖3可知，氫鍵供體為氯化膽堿，氫鍵受體為異丙醇，二者摩爾比為1∶3，含水量為40%時的低共熔溶劑體系的多糖提取率最高。這可能是因為多糖為極性大分子，低共熔溶劑極性也相對較大，根據(jù)相似相溶原理，可溶解的多糖相應(yīng)較多；另一方面可能是因為醇類大量羥基的存在，也能加強與多糖的相互作用力，提高多糖提取率，然而，低共熔溶劑黏度會影響多糖的提取率，加入適量水使得溶劑體系黏度降低，溶液流動性增大，可高效快速溶解更多的多糖，提高多糖的提取率[26]。因此選用氫鍵供體為氯化膽堿，氫鍵受體為異丙醇，二者摩爾比為1∶3，含水量為40%時的低共熔溶劑體系最適宜。

2.2 甘草多糖提取單因素試驗

選取料液比、提取溫度、超聲時間以及超聲功率4個因素做單因素試驗，考察各因素對甘草多糖提取效果的影響。

2.2.1 提取溫度對多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

從圖4可知，當(dāng)提取溫度較低時，甘草多糖的提取率隨著溫度的升高而增大；40℃時多糖提取率最高；之后隨著溫度的升高，多糖提取率降低。多糖提取率隨著溫度升高先增加后減少可能是因為隨著溫度的升高，整個反應(yīng)體系的反應(yīng)速度加快，利于多糖物質(zhì)的溶出，溫度進一步升高，使得多糖在低共熔溶劑中的穩(wěn)定性不高，發(fā)生降解而減少。因此提取溫度選擇40℃。

2.2.2 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖5。

從圖5可知，當(dāng)料液比為1∶50（g/mL）時，多糖提取率最大，之后趨于平穩(wěn)。可能是因為低共熔溶劑本身為黏稠液體，在一定范圍內(nèi)，隨著料液比降低，溶劑與甘草的接觸面積增多，超聲還起到一定的攪拌作用，多糖的溶出增多，使得多糖提取率增加；而當(dāng)溶劑過高時，黏稠的低共熔溶劑阻礙了超聲波的作用，使超聲波不能充分作用于甘草，亦或是提取出的多糖受到過多溶劑的稀釋，而使提取率降低。因而，從提取率及成本等方面考慮，料液比以1∶50（g/mL）為宜。

圖5 料液比對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.2.3 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on polysaccharide extraction rate

從圖6可以看出，提取率隨著超聲時間的增加先緩慢升高后下降，30 min時多糖提取率達到最高。這可能是因為在一定時間范圍內(nèi)，隨著超聲時間的增加，超聲波能充分作用于甘草粉末，破壞其細(xì)胞壁，使多糖溶出；但是隨著超聲時間的進一步增加，超聲波使得部分多糖水解，從而使提取率降低。因此，超聲時間以30 min為宜。

2.2.4 超聲功率對多糖提取率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖7。

由圖7可知，多糖的提取率隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，功率250 W時的多糖提取率最高。這可能是因為隨著功率增加，超聲波的強度增加，使得甘草與溶劑充分反應(yīng)，從而使多糖溶出增加，而功率過高時，可能對多糖類化合物具有破壞作用，使提取率下降。因此，超聲功率選擇250 W為宜。

圖7 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides

2.3 甘草多糖提取的響應(yīng)面試驗

2.3.1 Box-Behnken試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取料液比、提取溫度、超聲時間、超聲功率進行響應(yīng)面試驗。以Box-Benhnken設(shè)計的組合變量為自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，進行多糖提取條件的優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素和水平設(shè)計見表2，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平表Table 2 Box-Behnken experimental factors and level table

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Response surface experimental results

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental results

利用Design-Expert8.06軟件，對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸模型擬合，獲得甘草多糖提取率（Y）對應(yīng)編碼自變量的二次多項式回歸方程：Y=8.23-1.04A-0.15B-0.9C+0.14D+0.27AB-1.16AC-0.14AD-0.16BC-0.083BD-0.44CD-2.01A2-2.72B2-3.57C2-1.99D2

響應(yīng)面二次模型方差分析見表4。

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface quadratic model

由表 4可知：一次項 A、C 影響極顯著（P＜0.01）；二次項 AC 影響極顯著（P＜0.01）；A2、B2、C2、D2影響極顯著（P＜0.01）；失擬項不顯著（P＞0.05）。模型 R2=0.982 0，R2Adj=0.963 9，說明該方程與實際情況擬合良好，可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。根據(jù)F值可知各因素對多糖提取率影響程度大小順序為：超聲功率＞提取溫度＞超聲時間＞料液比。

2.3.2 各個因素相互作用的響應(yīng)曲面圖

響應(yīng)曲面圖可直觀地看出各因素交互作用對甘草多糖提取率的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對多糖提取率的影響越大，相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。

2.3.2.1 超聲功率與超聲時間的交互作用

超聲功率與超聲時間的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖8。

圖8 超聲功率與超聲時間的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

由圖8可知，隨著超聲功率和超聲時間的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，等高線近似圓形。說明超聲功率和超聲時間的交互作用對甘草多糖的提取率影響不顯著。這是因為隨著超聲功率與時間的增加，超聲波的作用越明顯，甘草粉末與溶劑混合的越均勻，接觸越多，甘草多糖越快溶出。

2.3.2.2 超聲功率與提取溫度的交互作用

超聲功率與提取溫度的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖9。

圖9 超聲功率與提取溫度的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic power and temperature

由圖9可知隨著超聲功率和提取溫度的增加，多糖提取率先增加后減少，等高線呈橢圓形，說明超聲功率和溫度的交互作用對甘草多糖的提取率影響極顯著。

2.3.2.3 超聲功率與料液比的交互作用

超聲功率與料液比的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖10。

由圖10可知，隨著超聲功率和溶劑體積的增加，多糖提取率先增加后減少，等高線近似圓形，說明超聲功率和料液比的交互作用對甘草多糖的提取率影響不顯著。這是因為隨著溶劑體積與超聲功率的增加，甘草粉末與溶劑充分接觸，使多糖溶出加快，提取率升高；當(dāng)超聲功率過高時，可能對多糖類化合物具有破壞作用，故導(dǎo)致了多糖得率下降。因此，選擇超聲功率為250 W為宜。

圖10 超聲功率與料液比的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and material-liquid ratio

2.3.2.4 提取溫度與超聲時間的交互作用

提取溫度與超聲時間的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖11。

圖11 超聲時間與提取溫度的交互作用Fig.11 Interaction between ultrasound time and extraction temperature

由圖11可知，隨著超聲時間和提取溫度的增加，多糖提取率先增加后減少。等高線近似圓形，說明超聲時間和溫度的交互作用對甘草多糖的提取率影響不顯著。

2.3.2.5 超聲時間和料液比的交互作用

超聲時間和料液比的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖12。

圖12 超聲時間與料液比的交互作用Fig.12 Interaction of ultrasonic time and material-liquid ratio

由圖12可知，隨著超聲時間和溶劑體積的增加，多糖提取率先增加后減少，等高線近似圓形。說明超聲時間和料液比的交互作用對甘草多糖的提取率影響不顯著。

2.3.2.6 提取溫度和料液比的交互作用

提取溫度和料液比的交互作用對甘草多糖的提取率影響見圖13。

由圖13可知，隨著溫度和溶劑體積的增加，多糖提取率先增加后減少，等高線近似圓形。說明提取溫度和料液比的交互作用對甘草多糖的提取率有影響但不顯著。

圖13 提取溫度與料液比的交互作用Fig.13 Interaction between extraction temperature and materialliquid ratio

2.4 驗證試驗

根據(jù)回歸方程得出提取率最高的組合為超聲功率249.36 W、時間29.81 min、溫度39.10℃、料液比1∶50.55（g/mL）時，甘草多糖的理論最高提取率為8.40%?？紤]到實際操作的可行性，將提取條件調(diào)整為超聲功率250 W、時間30 min、溫度39℃、料液比1∶50（g/mL）。此時的提取率為8.31%，該值與理論值接近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化甘草多糖提取工藝可行。

3 結(jié)論

本研究以甘草為研究對象，以低共熔溶劑作為提取劑，低共熔溶劑體系氫鍵供體為氯化膽堿，氫鍵受體為異丙醇，二者摩爾比為1∶3，含水量為40%時，多糖提取率最高。采用超聲輔助低共熔溶劑提取其中的多糖，料液比、提取溫度、超聲溫度、超聲功率和超聲時間對甘草多糖的提取率均有影響。通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗得出甘草多糖提取的最優(yōu)條件：超聲功率250 W、時間 30 min、溫度 39℃、料液比 1∶50（g/mL），此時的提取率為8.31%，此法工藝條件溫和，不需要高溫高壓，多糖的提取率較高，水解和生物分解損失率低。此外，低共熔溶劑是綠色環(huán)保天然溶劑，無毒無污染，提取物可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，體現(xiàn)了低共熔溶劑提取多糖的優(yōu)勢。