雪燕營養(yǎng)成分分析及抗氧化活性評價

白利琴，楊新，李沖，李研東，肖妙，郝建雄，趙丹丹，劉璐，李晟霖，韓雪*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北 石家莊 050002；3.石家莊市畜產品質量監(jiān)測中心，河北 石家莊 050041）

雪燕（tragacanth gum）為木髓分泌物，原產于地中海東部干旱地區(qū)、亞洲西南部、北部高原和沙漠[1]。因產品性狀與燕窩相似而得名，并被引入中國。但是，目前對雪燕成分及功能性的認知和研究少有報道。隨著大眾對養(yǎng)生追求的不斷提高，人們對雪燕產品的需求逐漸擴大。然而，雪燕質量良莠不齊，一方面由于缺乏專門的學者研究，另一方面市場沒有與它相關的準則進行約束，因此，深入研究雪燕的營養(yǎng)成分及其功能性勢在必行[2-3]。

多糖，又稱多聚糖，是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的一類分子結構復雜且龐大的糖類物質[4]。在食物營養(yǎng)成分中，活性多糖是能夠起到調節(jié)人體機能作用的生物活性物質種類中重要的一種[5]。根據(jù)多糖理化性質的不同，其提取方法通常包括傳統(tǒng)的水提醇沉法、酸提法、堿提法，或是采用超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法等新興技術手段，以提高其提取效率[6]。雪燕作為樹髓分泌物，其多糖的溶出不受植物細胞壁的約束限制，因此，本研究關于雪燕多糖的提取采用成本低、污染少、安全的傳統(tǒng)方法進行提取，并將提取工藝條件進行優(yōu)化。

不同來源的多糖具有不同生物學功能。研究表明，植物多糖通常具有抗氧化、免疫調節(jié)、腫瘤抑制、治療心腦血管系統(tǒng)疾病、抗病毒等多種生理功能[7-10]。其中，抗氧化作用體現(xiàn)在植物多糖可保護膜結構的完整性，防止超氧陰離子自由基的攻擊；可與羥基自由基形成有關的金屬離子相結合，抑制羥自由基的產生；能清除細胞內過多的自由基，減輕活性自由基對免疫系統(tǒng)的損傷或保護DNA、蛋白質、脂類等生物大分子免受直接攻擊而起到抗癌的作用[11-14]。本試驗對雪燕多糖的體外抗氧化效果進行分析評價，將為后續(xù)相關研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪燕：印度BOZI購買，于40℃烘箱中烘干，含水量為5%，打粉機粉碎過60目篩后裝于自封袋中，備用。

鄰苯三酚：美國Sigma公司；葡萄糖、無水乙醇、苯酚、L-抗壞血酸（VC）（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；2，2’-連氮基-雙-（3 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）、1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸：源葉生物有限公司；三氯乙酸、甲醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、過硫酸鉀（分析純）：天津市百世化工有限公司；三氟乙酸、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1，2-dihydro-5-methyl-2-phenyl-3H-pyrazol-3-one ，PMP）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗儀器

S433D全自動氨基酸分析儀：德國Sykam；iCap Q電感耦合等離子體質譜儀（inductively coupled plasmamass spectrometry ，ICP-MS）：Thermo Fisher Scientific；1200 液相色譜儀：Agilen；SPECTROstarNano酶標儀：德國BMG；FW80型粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；HC-3018高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-4水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雪燕微量元素含量的測定

采用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法[15-17]測定雪燕中微量元素的含量。稱取樣品0.3 g（精確到0.0001g），置于消化罐中，加入硝酸4.0mL，浸泡30min；加入雙氧水1.0 mL浸泡過夜，裝入消解裝置，設定溫度為165℃，時間為12 min啟動儀器。計時完成后等待3 min～5 min即可把消解罐從微波爐中取出，冷卻20 min后即可在通風櫥內打開消解罐。將消解完成的樣品試劑轉移到25 mL比色管中定容，溶液靜置澄清后上機測定，測定參數(shù)如表1所示。

表1 ICP-MS的儀器參數(shù)Table 1 ICP-MS instrument parameters

1.3.2 雪燕中氨基酸含量測定

1.3.2.1 樣品前處理

稱取試樣約100 mg（準確至0.1 mg）于20 mL安瓿瓶中，加入10.00 mL 6 mol/L鹽酸溶液，搖勻，充氮氣2 min，封管。將水解管放入110℃恒溫干燥箱中水解22 h～24 h。冷卻，混勻，過濾；取0.2 mL的濾液，60℃濃縮至干；用1 mL pH 2.2檸檬酸鈉上機稀釋液溶解殘留物，0.45 μm濾膜過濾，上機測定。

1.3.2.2 上機測定

梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

色譜柱：Na+磺基水楊酸柱（liquid chromatography under the limiting conditions of adsorptionL，CLCA）（K06/Na 4.6 mm×150 mm×7 μm）分離柱；流動相：緩沖溶液A為pH 3.4的檸檬酸鈉，緩沖溶液B為pH 10.8的檸檬酸鈉，再生液為氫氧化鈉溶液和茚三酮溶液，均按照廠家要求配制。檢測波長：570 nm；進樣量：50 μL；緩沖泵流速：0.45 mL/min；試劑泵流速：0.25 mL/min；柱溫程序：初始柱溫 58 ℃；0～19.0 min，柱溫58℃；19.0 min～24.0 min，柱溫由58℃變化到74℃；24.0 min～49.0 min，柱溫 74 ℃；49.0 min～54.0 min，柱溫由74℃變化到58℃；54.0 min～59.0 min，柱溫58℃；反應器溫度：130℃。

1.3.3 雪燕多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 雪燕多糖提取單因素試驗

取處理好的雪燕粉，以料液比為1∶200（g/mL），選擇溶液pH值、提取時間和提取溫度3個因素進行單因素試驗[18-21]。其中 pH 值設置為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；提取時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h；提取溫度 20、30、40、50、60、70、80、90、100℃。加4倍體積的無水乙醇，即濃縮液∶無水乙醇為1∶4的體積比進行沉淀，靜置過夜后8 000 r/min的條件下離心10 min，棄去上清，沉淀部分即為雪燕多糖。采用苯酚-硫酸法[20]測定多糖含量，并最終確定各單因素中的最佳提取參數(shù)。

1.3.3.2 雪燕多糖提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以多糖提取率為評價指標，按L9（33）進行正交試驗（表3），確定雪燕多糖最優(yōu)提取條件。

表3 L9（33）正交試驗因素與水平設計Table 3L9（33）Orthogonal experimental factors and level design

1.3.4 單糖組成成分分析

1.3.4.1 糖的衍生化

完全酸水解：取適量樣品于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroaceticacid，TFA）1 mL，于120℃烘箱中水解2 h。取出后，氮氣吹干。

衍生化反應：向吹干后的樣品中加1 mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 （PMP）-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70℃水浴60 min，冷卻，加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液后，加入0.5 mL氯仿，振蕩搖勻后靜置20 min，棄去下層，萃取3次，取水層過膜上機。通過與標準品保留時間的比較，確定色譜峰所屬的化合物種類，通過峰面積計算各種化合物含量。

1.3.4.2 色譜條件

SHISEIDO C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：A為0.1 mol/L KH2PO4（pH 6.8）；B為乙腈；A∶B=82∶18（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫為 25℃；進樣量 10 μL；波長為 245 nm。

1.3.5 雪燕多糖體外抗氧化能力測定

1.3.5.1 羥自由基清除能力測定

取1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液，加入2.5 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液（樣液的空白組和陽性對照組的空白組加1 mL無水乙醇）和1 mL 8.8 mol/L的過氧化氫溶液置于離心管中混合均勻，37℃下反應30 min，隨后在4 000 r/min條件下離心10 min，在510 nm處測量溶液上清液的吸光度。溶液樣品進行3組平行，樣品對羥自由基的清除率按式（2）計算[22-23]。

式中：A為不加樣品組的吸光度（即用蒸餾水代替樣品）；B為試驗組的吸光度；B0為與試驗組對應的空白組的吸光度。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

將0.2 mL濃度為7.4 mmol/L ABTS溶液和0.2 mL濃度為2.6 mmol/L過硫酸鉀等體積混合。室溫黑暗條件下反應12 h～16 h。得到ABTS工作液母液后用乙醇稀釋40倍～50倍，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液將該溶液在734 nm處吸光度調節(jié)為0.7～0.8之間，得到工作液備用。取0.1 mL 0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液[24-25]，加入1.9 mL調配好的稀釋工作液，在37℃避光反應1h后于734 nm下測定其吸光度。平行測定3次，取平均值。

式中：A對照為0.1mL乙醇+1.9 mL ABTS工作液的吸光度；A樣品為0.1 mL樣品+1.9 mL ABTS工作液的吸光度。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力測定

稱取一定量的DPPH試劑，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L DPPH溶液。取0.2 mg/mL的雪燕多糖提取液2 mL+1 mL DPPH溶液（空白組用甲醇代替DPPH）混合均勻后在室溫黑暗處靜置30min，在517nm處測吸光度值。以抗壞血酸作為陽性對照，樣品對DPPH自由基的清除率按式（4）計算。

式中：A為不加樣品組的吸光度（即用蒸餾水代替樣品）；B為試驗組的吸光度；B0為與試驗組對應的空白組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較并進行Duncan’s檢驗，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 雪燕中微量元素含量

電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）擁有低檢出限、寬動態(tài)線性范圍、干擾少、分析精密度高、分析速度快、可進行多元素同時測定以及可提供精確的同位素信息等分析特性。采用該方法對雪燕中的微量元素進行評價分析，結果如表4所示。

表4 微量元素測定結果Table 4 Trace element determination results

雪燕中鉛、鎘、砷均未檢出，鎳、鉻含量均符合國家安全標準限量，說明該雪燕產品安全性高，不存在重金屬超標問題。同時雪燕中含有人體必需微量元素鍶、鈷、銅、鋅，以及元素鎳和錳。其中鍶（1.06×10-2g/100 g）、錳（2.87×10-3g/100 g）含量豐富，鍶是人體牙齒及骨骼的正常組成部分，在人體內的代謝與鈣極為相似，能促進骨骼的發(fā)育生長，在骨骼中，約占人體鍶總量的90%。缺鍶會引起齲齒、骨質疏松、阻礙新陳代謝、產生牙齒和骨骼發(fā)育不正常等癥狀。而錳有促進骨骼的正常生長和發(fā)育，維持正常的糖代謝和脂肪代謝，預防貧血和癌癥，維持正常腦功能等作用。

2.2 雪燕中氨基酸含量

雪燕中氨基酸含量見表5。

酸水解樣品后測定雪燕中氨基酸的種類豐富且較為齊全。共含有16種氨基酸，其中人體必需氨基酸含有 7 種 （Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val），總量達21.1 g/100 g，占總氨基酸比例為42.93%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為43∶57。雪燕中天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最為豐富，分別達到 9.28、7.01、5.49 g/100 g。

表5 雪燕中氨基酸含量Table 5 Amino acid content in tragacanth gum

天冬氨酸在雪燕中含量最高，占總氨基酸的18.5%，天冬氨酸對于高血壓、心臟病等疾病有較好的治療效果[26]。食品領域中可用來添加到保健食品中起到緩解疲勞的作用，在飲料配制時添加天冬氨酸，對口感和風味有一定的提升[27]；化工領域中可作為高分子材料的原材料，也能夠作為營養(yǎng)添加劑添加到化妝品中[28]。

谷氨酸為雪燕中含量較高的氨基酸，占總氨基酸含量的11.09%，有助于蛋白質的合成，參與腸道改善功能、提高腸道阻擋能力、使腸道細胞活性增強、促使腸道生長發(fā)育、提高抗氧化功能[29]。

2.3 多糖提取工藝優(yōu)化試驗結果

2.3.1 單因素試驗結果

2.3.1.1 提取溫度對雪燕多糖提取率的影響

溫度對雪燕多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，雪燕多糖提取率呈先上升后下降的變化趨勢，當提取溫度升至60℃時，多糖提取率達最大值（3.63%）。溫度較低時，多糖成分溶解速率緩慢，在相同時間內多糖提取率較低；隨著溫度的升高，多糖溶解度提高，利于多糖的提??；但溫度過高易引起多糖水解或分子鏈破壞而生成小分子糖類物質，使多糖含量下降，同時，溫度過高也會導致水氣化的出現(xiàn)，若水氣化現(xiàn)象持續(xù)時間較長，則會引起溶劑體積增大，料液比下降，影響多糖的溶出率，降低多糖的提取率[30]。因此，提取溫度為60℃時，雪燕多糖的提取效果最佳。

圖1 溫度對雪燕多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

2.3.1.2 pH值對雪燕多糖提取率的影響

pH值對雪燕多糖提取率的影響見圖2。

圖2 pH值對雪燕多糖提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

結果如圖2所示，當pH值為3.0時，雪燕多糖提取率最大（6.58%）。pH值較高與過低時，雪燕多糖提取率均較低，該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是酸環(huán)境和堿環(huán)境均導致了雪燕中的一些大分子多糖降解為小分子多糖，導致雪燕多糖的徹底溶解。因此，提取液pH 3為最適pH值。

2.3.1.3 提取時間對雪燕多糖提取率的影響

提取時間對雪燕多糖提取率的影響見圖3。

從圖3可以看出，提取時間對雪燕多糖提取率存在一定影響，從0.5 h開始隨著時間的增加呈上升趨勢，到達最高點后提取率又隨著時間的增加而下降。當提取時間為3.0 h時，多糖的提取率最高（8.73%）。在酸性環(huán)境下提取時間過長會增加多糖的水解程度，影響其提取率。同時達到一定時間后，細胞內、外滲透壓逐步趨于平衡，多糖提取率不再上升，加熱狀態(tài)下過長的時間可能導致多糖鏈結構發(fā)生變化，使多糖提取得率下降[31]。

圖3 提取時間對雪燕多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from tragacanth gum

2.3.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表6。

雪燕多糖提取率正交試驗所選3種因素的主次順序為：提取時間>提取溫度>pH值，即提取時間對雪燕多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，最后為pH值。雪燕多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間 3.5 h。

為驗證正交試驗工藝組合提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間3.5 h，進行3次平行驗證試驗。結果表明，在該組合工藝條件下，雪燕多糖平均提取率為13%，證明該正交試驗結果可靠準確。

2.4 單糖組成成分分析

不同種類的單糖因在糖柱中的保留時間不同而依次出峰。在1.3.4測試條件下鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標準混合溶液的液相譜圖見圖4，雪燕多糖水解液的液相色譜見圖5。

圖4 混合標準單糖PMP衍生物的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of a mixed standard monosaccharide PMP derivative

表6 正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results

通過保留時間可對單糖進行定性分析，在液相色譜圖中，峰面積與質量濃度呈正比關系，因此通過峰面積可對單糖進行定量分析，雪燕多糖中的單糖組成成分主要是鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、它們的相對質量分數(shù)分別為22.1%、20.0%、5.66%、1.64%。王森等[32]研究印度樹膠水解后可獲得L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-半乳糖醛酸，與本研究所得單糖組成有所不同，由此可得同一種類天然食用樹膠不同樹種（種源）之間，單糖含量不同。

2.5 體外抗氧化結果與分析

自由基（free radical，F(xiàn)R）是指帶有未成對電子的原子或基團。機體在受到各種因素（環(huán)境溫度、機械、病原）的影響下會在短時間內大量產生。機體內大量自由基的產生是機體應激、亞健康和文明病形成的主要原因。機體內的自由基分為兩類：活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）。活性氧（ROS）不僅包括氧中心自由基，而且包括氧的反應衍生物的非自由基（如H2O2）?；钚缘≧NS）是指氮自由基和其他反應分子。在活性氧自由基中，·OH具有強氧化性和強反應性。·OH能損害與其緊密接觸的分子，是對生物物質最具破壞性的ROS。·NO是代表性的活性氮自由基，能結合過渡態(tài)金屬，·NO與Fe的結合是·NO發(fā)揮作用的重要機制，同時通過結合血紅蛋白中的鐵使其在失活和消除的過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 雪燕多糖水解PMP衍生物的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of tragacanth gum polysaccharide hydrolyzed PMP derivative

本研究以抗壞血酸為陽性對照，采用ABTS+自由基清除法與DPPH法分析雪燕多糖體外清除活性氮自由基的抗氧化能力，同時以·OH為對象，評價了雪燕多糖對其清除能力。雪燕多糖體外抗氧化結果見圖6。

結果如圖6所示，雪燕多糖羥自由基清除能力與ABTS+自由基清除率分別為7.39%與4.34%，顯著低于陽性對照，說明雪燕多糖對·OH和ABTS+自由基的清除能力有限；與此相反，DPPH試驗中，雪燕多糖顯示了良好的抗氧化能力，DPPH自由基清除率為23.841%，其抗氧化效果均與陽性對照VC相似。說明雪燕多糖具有較高的清除氮自由基能力。多糖屬于高分子物質，易溶于水，而不溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，即使在含有部分水的DPPH與ABTS工作溶液中，多糖也很容易析出，造成溶液渾濁[33]。因而本試驗僅對濃度為0.2 mg/mL的低濃度多糖溶液進行了抗氧化試驗。

圖6 雪燕多糖體外抗氧化結果Fig.6 Antioxidant results of tragacanth gum polysaccharide in vitro

在蔡延渠等[24]、李鳳月等[25]的研究中證實了相同濃度下，與VC相比，桃膠多糖作用較弱，與本試驗結果中雪燕多糖羥自由基清除能力與ABTS+自由基清除率低于VC清除能力的結果一致。

3 結論

雪燕作為一種新興的食品，具有較高的營養(yǎng)價值，含有豐富的微量元素和氨基酸，其中鍶、錳、天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最為豐富。作為生物活性成分，雪燕多糖提取條件優(yōu)化將為雪燕產品開發(fā)提供重要依據(jù)，本研究確定雪燕多糖的最佳提取條件為提取溫度60℃、pH 2.0、提取時間3.5 h，多糖提取率可達13%。經HPLC法分析測定，確定雪燕多糖中的單糖組成主要含有鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、巖藻糖，其中鼠李糖和半乳糖含量較高，相對質量分數(shù)為22.1%、20.0%。提取的雪燕多糖具有一定的抗氧化能力，對活性氮自由基的清除能力較高。雪燕及雪燕多糖具有豐富的營養(yǎng)價值和生物學功能，是化妝品、保健食品和藥品領域的一種良好的天然營養(yǎng)食品及抗氧化劑，具有較高的研究與開發(fā)價值。