辣木葉不同極性部位對(duì)細(xì)胞的抗氧化及抗增殖活性研究

王麗虹，劉陽(yáng)*，許悅，熊凡，潘敏怡，王語(yǔ)嫣

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223；2.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430073）

人體正常生命活動(dòng)中會(huì)生成自由基，自由基過(guò)多或身體自身清除過(guò)慢，都會(huì)對(duì)人體的健康造成一定影響。大量研究顯示，自由基與多種疾病的發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)[1]。人工合成抗氧劑在食品工業(yè)中被廣泛使用，但毒理學(xué)和生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人工合成抗氧劑對(duì)人體健康安全存在威脅[2-3]。許多研究證實(shí)了天然產(chǎn)物中所含的黃酮類物質(zhì)有抗氧化的功能，因其安全性高，在抗氧劑研發(fā)中極具潛力和應(yīng)用價(jià)值[4-5]，因此具有較高的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)前景。

辣木（Moringa oleifera Lam）屬于辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa Adans）落葉喬木[6]，為藥食兩用植物，其含有的黃酮含量達(dá)到31.28 mg/g。曾有學(xué)者對(duì)辣木葉醇提物的自由基清除能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下其抗氧化活性能與人工合成抗氧劑相媲美[7]，這表明辣木葉是一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧劑原料。有研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉甲醇提取物減輕了糖尿病大鼠肝臟的炎癥，顯示了肝臟保護(hù)作用[8]。辣木葉還具有抗癌的功能，其抗癌活性被證實(shí)主要來(lái)源于其含有的槲皮素、煙堿甲素[9-11]。前期研究中采用化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)辣木葉不同極性部位均有清除自由基的能力，為進(jìn)一步研究其抗氧化活性，本文以H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷為模型，通過(guò)生化分析方法測(cè)定細(xì)胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力，評(píng)價(jià)辣木葉不同極性部位的抗氧化能力，并對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行研究，旨在篩選活性較強(qiáng)的極性部位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由武漢大學(xué)病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

辣木葉：云南大藥山商貿(mào)有限公司；纖維素酶（10萬(wàn)U/g）、果膠酶（5萬(wàn)U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液：?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：上海源葉生物科技有限公司；GSH-Px測(cè)定試劑盒、CAT測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置相差熒光顯微鏡（TE2000-5）：日本尼康公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC）：松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；生物安全柜（BHC-1300ⅡB2）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高速離心機(jī)（HC-3018）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平（A223 S-CW）：德國(guó)賽多利斯公司；酶標(biāo)儀（Infinite F200）：瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉不同極性部位的制備

稱取干燥辣木葉粉1 g、纖維素酶20 mg、果膠酶40 mg，加入濃度為 88%的乙醇，料液比為 1∶26（g/mL），超聲45 min后置于60℃的水浴鍋酶解25 min，提取辣木葉總黃酮，得總醇提液（M），并按石油醚、乙酸乙酯、正丁醇順序依次萃取，萃取液經(jīng)旋蒸、干燥，分別制得辣木葉石油醚部位（M1）、乙酸乙酯部位（M2）、正丁醇部位（M3）和水溶性部位（M4），經(jīng)檢測(cè) M、M2、M3、M4 中總黃酮含量依次為 （100.56±1.49）、（326.19±2.35）、（209.39±1.16）、（45.40±2.11）mg/g，M1 含有極少量的總黃酮，故舍去。試驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基配制成不同濃度無(wú)菌溶液。

1.3.2 HepG2細(xì)胞復(fù)蘇

取出含HepG2細(xì)胞的凍存管于37℃水浴鍋中快速解凍，加37℃預(yù)熱DMEM高糖培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min離心5 min后棄去最上層液體，迅速加入含有血清和雙抗的完全培養(yǎng)基，用移液槍頭輕輕地吹打細(xì)胞至完全分散后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×105個(gè)/mL，按 100 μL/孔接種于 96 孔板后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去原培養(yǎng)基，模型組加入100 μL用完全培養(yǎng)基配制的50 μmol/L～1 000 μmol/L H2O2溶液，正常組和調(diào)零組（不添加細(xì)胞）分別加入相同體積的完全培養(yǎng)基[12]。每組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2 h后棄去上層培養(yǎng)液，按10 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄上層液加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL/孔，低轉(zhuǎn)速搖晃10 min使結(jié)晶溶解充分，后用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔OD值。用公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 辣木葉不同極性部位給藥劑量的篩選

將1.3.3中的H2O2溶液用0.1mg/mL～5.0mg/mL辣木葉不同極性部位溶液代替，培養(yǎng)24 h后按照1.3.3的步驟，加入MTT溶液測(cè)定細(xì)胞存活率，篩選出對(duì)HepG2細(xì)胞安全無(wú)毒的劑量范圍[13]。

1.3.5 辣木葉不同極性部位對(duì)H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

向模型組中加入安全濃度的辣木葉各極性部位溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸去上層液，加入用完全培養(yǎng)基配制的400 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)2 h后，按1.3.3操作步驟檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.6 細(xì)胞氧化酶活力檢測(cè)

同1.3.5的步驟，H2O2處理細(xì)胞2 h，收集培養(yǎng)液后離心取上清液待測(cè)；細(xì)胞用冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次后加入胰蛋白酶-EDTA溶液消化、離心收集，在冰浴中用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，待測(cè)[14]。參照相應(yīng)試劑盒方法，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞中MDA、SOD、GSH-Px以及CAT水平。

1.3.7 辣木葉不同極性部位對(duì)細(xì)胞增殖的影響

依照1.3.4的操作，用MTT法分別檢測(cè)辣木葉不同極性部位作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h時(shí)的存活率，并利用軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50，mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，繪圖采用Origin Pro 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷濃度的確定

H2O2是一種活性氧，是人體新陳代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物，它極易穿透細(xì)胞膜作用于一些生物大分子，引起脂質(zhì)過(guò)氧化等一系列反應(yīng)，是建立細(xì)胞氧化損傷的常用物質(zhì)[15]。HepG2細(xì)胞因有和人體正常肝細(xì)胞相同的功能，所以常被用在探究天然抗氧化活性產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的試驗(yàn)中[16]。不同濃度H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見圖1。

圖1 不同濃度H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HepG2 cells

由圖1可知，H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷隨濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng) H2O2濃度為 200、400、800μmol/L 時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率分別為（74.33±2.44）%、（64.73±1.52）%、（35.30±3.10）%。由于低濃度H2O2對(duì)細(xì)胞損傷較輕，樣品對(duì)于細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯；而濃度過(guò)大又會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，所以一般應(yīng)選擇細(xì)胞存活率在50%～70%范圍內(nèi)，便于試驗(yàn)觀察研究[17]。因此，選擇400 μmol/L H2O2進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞損傷保護(hù)試驗(yàn)。

2.2 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

為了后續(xù)試驗(yàn)研究辣木葉對(duì)H2O2氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，樣品劑量作用于正常細(xì)胞必須是安全無(wú)毒的。辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見圖2。

圖2 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（24 h）Fig.2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（24 h）

由圖2可知，在4個(gè)樣品濃度均低于1.0 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率都大于99%，因此選擇0.1、0.5、1.0 mg/mL這3個(gè)劑量來(lái)研究H2O2導(dǎo)致HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

2.3 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響見表1。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞存活率為（64.73±1.52）%，與正常組（99.81±0.41）%相比，存活率顯著下降（P＜0.001），這說(shuō)明細(xì)胞損傷成功。由表1可知，與模型組相比，除M4低濃度組外，其它樣品低、中、高濃度組的細(xì)胞存活率均有明顯升高（P＜0.01，P＜0.001），并具有濃度依賴性；濃度相同時(shí)，M2對(duì)H2O2損傷HepG2細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，M3、M次之，M4最弱；高濃度時(shí)（1.0 mg/mL），預(yù)先用M2溶液處理HepG2細(xì)胞，400 μmol/L H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷較小、存活率達(dá)到（92.24±3.22）%，比模型組提高了42%以上，防護(hù)作用顯著（P＜0.001）。

表1 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=5）Table 1 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（n=5）

2.4 辣木葉不同極性部位對(duì)H2O2導(dǎo)致HepG2損傷細(xì)胞酶活力的影響

辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2損傷細(xì)胞酶活力的影響見表2。

由表2可知，與正常組比較，模型組中MDA的含量顯著上升（P＜0.001），其它酶的活力顯著下降（P＜0.001），說(shuō)明經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞氧化損傷造模成功。與模型組比較，辣木葉樣品組預(yù)處理后顯著降低了細(xì)胞中 MDA 含量（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT 活性顯著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），并具有濃度依賴性，各樣品組使各項(xiàng)指標(biāo)均趨于正常組細(xì)胞的水平。說(shuō)明辣木葉不同極性部位通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi) SOD、GSH-Px、CAT活力，發(fā)揮了對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用。綜合比較各項(xiàng)指標(biāo)，各樣品其防護(hù)作用強(qiáng)弱順序是：M2＞M3＞M＞M4。

表2 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2損傷細(xì)胞酶活力的影響（n=5）Table 2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on enzyme activity of HepG2 injured cells（n=5）

2.5 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用

辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的影響見表3。

表3 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的影響（n=5）Table 3 The effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the inhibition rate of HepG2 cells（n=5）

由濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果可知，辣木葉不同極性部位在作用時(shí)間較短（24 h）且濃度低于1.0 mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)抑制作用。由表3可得，辣木葉不同極性部位在濃度大于1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，且呈濃度、時(shí)間依賴性；濃度及作用時(shí)間相同時(shí)，各極性部位對(duì)細(xì)胞抑制作用順序?yàn)椋篗2＞M3＞M＞M4。綜合考慮濃度和時(shí)間因素，M2的最佳濃度和作用時(shí)間分別是2.5 mg/mL、72 h，此時(shí)抑制率為（66.47±2.24）%，達(dá)到最大濃度時(shí)抑制率的87%，繼續(xù)增大濃度對(duì)抑制率的影響較小。

辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞不同作用時(shí)間下的IC50值見表4。

表4 辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞增值抑制率的IC50值Table 4 IC50value of inhibition rate of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the proliferation of HepG2 cells

由表4可知，各樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的時(shí)間依懶性；時(shí)間相同時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用順序?yàn)椋篗2＞M3＞M＞M4，與表3結(jié)果一致；作用72 h時(shí)，M4濃度是M2濃度的2.07倍以上才能達(dá)到相同的抑制效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷探究辣木葉不同極性部位對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明，利用較低濃度（＜1.0 mg/mL）的辣木葉不同極性部位預(yù)處理細(xì)胞后，對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其作用順序?yàn)镸2＞M3＞M＞M4，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化酶活性相關(guān)。增殖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉不同極性部位對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用與濃度和時(shí)間呈正相關(guān)，抑制作用順序?yàn)镸2＞M3＞M＞M4，該結(jié)果可能與辣木葉不同極性部位中總黃酮含量有關(guān)，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，辣木葉乙酸乙酯部位（M2）在濃度較低時(shí)對(duì)細(xì)胞氧化損傷有較好的保護(hù)作用，但濃度較高時(shí)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，其IC50值為1.83 mg/mL（72 h），顯示了較強(qiáng)的生理活性，因而可進(jìn)行后續(xù)的分離純化和藥效學(xué)研究。