高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法測(cè)定竹葉花椒中2種主要成分的含量*

齊景梁，高必興，，周 娟，茍 琰，，耿 昭，姜衛(wèi)東△，陳 茜

（1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611731；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

竹葉花椒來(lái)源于蕓香科花椒屬植物竹葉花椒Zanthoxylum armatumDC.的干燥成熟果皮，主要分布于我國(guó)西南、華南、華東和華中地區(qū)［1-2］，四川地區(qū)常稱其為“藤椒”，具有較長(zhǎng)的藥用歷史，常作民間藥用或在部分地區(qū)作花椒用。竹葉花椒在《本草綱目》《證類本草》《植物名實(shí)圖考》等古代本草中均有記載［3-4］，具有溫中止痛、殺蟲止癢之功效，用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛，外治濕疹瘙癢［5-6］?，F(xiàn)代研究表明，竹葉花椒主要含有揮發(fā)油、酰胺類物質(zhì)、生物堿、黃酮等成分，具有抑菌、抗炎、殺蟲、麻醉、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、保護(hù)胃腸道等功效［7-10］。其中，酰胺類物質(zhì)是竹葉花椒產(chǎn)生麻味的物質(zhì)基礎(chǔ)，又以山椒素類物質(zhì)如羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素為代表［11-12］，具有廣泛的生物活性［13-15］。目前，部分省市的地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)如2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、1999年版《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》、2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等均收載有竹葉花椒，但由于制訂時(shí)間較早，標(biāo)準(zhǔn)較簡(jiǎn)單，缺乏含量控制項(xiàng)，不能很好地控制其質(zhì)量［16-18］。本研究中，分別采用高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法測(cè)定竹葉花椒中羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素的含量，為完善竹葉花椒藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XP205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01mg）；e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HU-20500D型超聲波清洗儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，功率為400W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

羥基-α-山椒素（批號(hào)為RP181113），羥基-β-山椒素（批號(hào)為RP180508），均購(gòu)自成都麥德生科技有限公司，規(guī)格為每支20mg，純度≥98.00%；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，色譜純）；甲醇（成都科隆化學(xué)品有限公司，分析純）；水為超純水；20批竹葉花椒樣品產(chǎn)地見表1，經(jīng)四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院黎躍成主任中藥師鑒定為正品。

表1 樣品產(chǎn)地信息Tab.1 Origin information of sam ples

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil100-5 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（40∶60，V/V）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，目標(biāo)色譜峰與鄰近峰均達(dá)到完全分離（分離度大于1.5）。羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素理論板數(shù)均在20 000以上。色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別精密稱取羥基-α-山椒素對(duì)照品和羥基-β-山椒素對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羥基-α-山椒素79.11μg、羥基-β-山椒素9.471μg的溶液，即得。

供試品溶液：取供試品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10mL，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10，20，50μL，稀釋2倍、10倍后的對(duì)照品溶液各10μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，并以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，羥基-α-山椒素為Y1=8 397.76X1+135 685.15（r1=1.00），羥基-β-山椒素為Y2=8 893.16X2-18 858.23（r2=1.00）。羥基-α-山椒素與羥基-β-山椒素進(jìn)樣量分別在0.079 11～3.955 50μg和0.009 5～0.473 6μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素峰面積的RSD分別為0.42%和0.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品（編號(hào)為HY-4），平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量的RSD分別為0.50%和0.65%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品（編號(hào)為HY-4），依法制備供試品溶液，室溫下保存，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)測(cè)定。結(jié)果羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素含量的RSD分別為0.74%和1.13%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取6份已知含量的樣品（編號(hào)為HY-4）粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入與樣品中的量相當(dāng)?shù)牧u基-α-山椒素對(duì)照品和

羥基-β-山椒素對(duì)照品，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

耐用性試驗(yàn)：取同一樣品（編號(hào)為HY-4），分別考察Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Thermo HypersilGOLD C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Waters Xbridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果不同色譜柱測(cè)得羥基-α-山椒素含量的RSD為0.25%，羥基-β-山椒素含量的RSD為1.04%，表明方法耐用性良好。

2.1.4 樣品含量測(cè)定

取20批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表3。

表2 高效液相色譜法加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery test by HPLC（n=6）

表3 高效液相色譜法含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.3 Resu lts of content determ ination by HPLC（%，n=3）

2.2 紫外-可見分光光度法

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在紫外-可見分光光度計(jì)下分別對(duì)羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果，供試品溶液與羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液吸收光譜一致，且均于270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取羥基-α-山椒素對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含羥基-α-山椒素15.82μg的溶液，即得。

供試品溶液：取供試品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再精密量取0.3mL，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液0.5，1，2，3，5mL，置10mL容量瓶中，分別加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照，照紫外-可見分光光度法（2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0401），于270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.166X-0.003，r=1.00。結(jié)果羥基-α-山椒素質(zhì)量濃度在0.7910～7.9100μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照，于270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品（編號(hào)為HY-4），平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果6份樣品含量的RSD為0.29%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品（編號(hào)為HY-4），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.45%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取6份已知含量的樣品（編號(hào)為HY-4）粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液（每1mL含羥基-α-山椒素0.196 0mg）25mL，再精密加入甲醇25mL，稱定質(zhì)量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 紫外-可見分光光度法加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery test by ultraviolet-visible spectrophotometry（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取20批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表5。

表5 紫外-可見分光光度法含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）Tab.5 Results of content determ ination by ultraviolet-visible spectrophotometry（%，n=3）

3 討論

本研究中參考花椒及作為食品的藤椒、藤椒油含量測(cè)定的相關(guān)研究［19-22］，建立了基于高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法的竹葉花椒含量的測(cè)定方法。羥基-α-山椒素在特定條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為同分異構(gòu)體羥基-β-山椒素［23］，本研究中建立的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素，以二者的總含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，可避免因同分異構(gòu)體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的誤差。另外，酰胺類物質(zhì)是竹葉花椒中的一類鏈狀不飽和脂肪酸成分，除羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素外，竹葉花椒中還存在其他結(jié)構(gòu)類似的酰胺類物質(zhì)［24］，故建立了紫外-可見分光光度法測(cè)定酰胺類物質(zhì)總量的方法。曾考察供試品溶液的提取方法（超聲提取、回流提?。?、提取溶劑（水、乙醇、甲醇）及提取時(shí)間（10，30，45，60min）。最終，確定甲醇超聲提取30min作為供試品溶液的制備方法。高效液相色譜法和紫外-可見分光光度法含量測(cè)定方法中的供試品前處理相同，制備同一份供試品溶液可供2種方法使用，符合檢驗(yàn)經(jīng)濟(jì)學(xué)的要求。

本研究主要針對(duì)竹葉花椒中的麻味物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，但竹葉花椒中還含有揮發(fā)性香味物質(zhì)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析鮮竹葉花椒果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)，含量最高成分的是芳樟醇、檸檬烯、桉樹腦等［25-27］。對(duì)于揮發(fā)性物質(zhì)可否作為指標(biāo)成分對(duì)竹葉花椒藥材進(jìn)行質(zhì)量控制及如何控制，需進(jìn)一步開展系統(tǒng)研究。