耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的危險因素及耐藥機制的研究

胡小飛 厲銀平 劉桂霞 彭清臻 王鋒

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性感染檢出排名僅次于大腸埃希菌的革蘭氏陰性桿菌，是造成呼吸道、泌尿道、血流等多個部位感染的重要致病菌之一。隨著人口老年化、侵入性操作增多以及抗菌藥物過度且不規(guī)范的使用，肺炎克雷伯菌對抗生素的耐藥性日見增高，特別是耐碳青霉烯類菌株數量激增，對臨床治療造成極大困難。相比感染碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌(CSKP)患者，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)感染患者具有更高病死率及治療總費用。因此，通過對相關臨床資料的分析，研究CRKP醫(yī)院感染的臨床特征、高危因素及耐藥機制具有重要意義。

資料與方法

一、資料

1 一般資料：收集我院2018年6月1日-2019年5月31日臨床分離的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者同一次發(fā)病重復分離的菌株。菌株鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀。對診斷為肺炎克雷伯菌感染的病例進行回顧性對照研究，收集入選患者的相關病史資料，包括 ：① 一般情況和基礎疾病特征；② 分離致病菌前抗生素使用情況；③ 感染特征；④ 相關侵入性操作；⑤相關治療方案。

2 儀器與試劑：藥敏紙片購自英國OXOID公司；MH瓊脂平板購自法國生物梅里埃公司；PCR引物由invitrogen公司合成；10X Buffer 、dNTPs(10 mmol/L)、Tap酶購自TOYOBO 生物科技有限公司；PCR儀為ABI 9600型；瓊脂糖購自碧云天生物技術有限公司；全自動凝膠電泳成像系統為Bio-Rad產品。

二、方法

1 藥敏試驗：采用瓊脂擴散法進行藥敏試驗，抗菌藥物的敏感折點參照美國臨床實驗室標準委員會(clinical and laboratory standard institute，CLSI)2015年的標準。藥敏試驗結果對亞胺培南或美羅培南任一耐藥者判定為耐碳青霉烯類菌株。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

2 碳青霉烯酶基因的檢測：挑取1～2個菌落采用煮沸法制備細菌DNA模板。KPC及IMP型碳青霉烯酶基因采用PCR方法擴增?；蛞镄蛄蟹謩e為：KPC-R：GTCCAGACGGAACGTGGTAT、KPC-F：GCTCAGGCGCAACTGTAAGT(目標片段334bp)和IMP-R：GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC、IMP-F: GCAGCCAAACCACTAWGTTATCT(目標片段195bp)。反應體系為：總體積50μL，其中10X Buffer 5μL、dNTPs(10 mmol/L)4μL、Tap酶0.25μL、上下游引物各(10μmol/L)l μL、模板DNA 2μL，高壓滅菌ddH2O補足至50μL。PCR反應條件參見相關文獻(10)。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動紫外凝膠電泳成像儀下觀察結果，收集PCR擴增陽性產物進行DNA測序分析(華大基因有限公司)，將所得測序結果通過GenBank中BLAST序列進行比對以確定。

3 統計學分析：使用SPSS 22.0軟件進行統計分析。分類資料統計采用百分比表示。利用χ2檢驗對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的潛在危險因素進行單因素分析，然后進行多元Logistic回歸分析篩選危險因素，輸出OR值及其95%可信區(qū)間。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般情況

共收集我院2018年6月1日-2019年5月31日臨床診斷為CRKP感染病例57例(CRKP組)，其中男性40例(70.1%)，女性17例(29.9%)，>60歲患者占43.8%；CSKP感染患者70例(CSKP組)，其中男性50例(71.4%)，女性20例(28.6%)，>60歲患者占58.5%(見表1)。

表1 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的一般情況[n(%)]

二、科室分布

CRKP組主要分布在呼吸科31.6%(18/57)、神經內科21.1%(12/57)、神經外科14%(8/57)和ICU 10.5%(6/57)；CSKP組分布情況如下，呼吸科30%(21/70)、神經內科20%(14/70)、神經外科17.5%(10/70)和ICU 11.4%(8/70)(見表2)。

表2 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的科室分布[n(%)]

三、感染部位分布

CRKP組主要為下呼吸道感染78.9%(45/57)、泌尿道感染17.8%(8/57)和血流感染6.7%(3/57)；CSKP組感染部位分布情況如下，呼吸道74.3%(52/70)、泌尿道17.1%(12/70)和血流5.7%(4/70)(見表3)。

表3 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的感染部位分布[n(%)]

四、抗生素使用情況

分離出肺炎克雷伯菌1個月內，CRKP組中單藥治療者35.1%(20/57),其中三代頭孢/酶抑制劑13例，喹諾酮類1例，碳青霉烯類6例；兩種治療者38.6%(22/57),其中三代頭孢/酶抑制劑聯合喹諾酮類8例，單用三代頭孢/酶抑制劑升級為碳青霉烯類14例；三種治療者31.6%(12/57)，均為三代頭孢/酶抑制劑聯合喹諾酮類升級為碳青霉烯類12例。

在CSKP組中單藥治療者31.4%(22/70),其中三代頭孢/酶抑制劑15例，喹諾酮類7例，碳青霉烯類0例；兩種治療者5.7%(4/70),其中三代頭孢/酶抑制劑聯合喹諾酮類4例；三種治療者5.7%(4/70)，均為三代頭孢/酶抑制劑聯合喹諾酮類升級為碳青霉烯類4例。

五、CRKP感染危險的單因素分析

對57人次CRKP感染者和70人次CSKP感染者進行相關危險因素的單因素分析，結果表明營養(yǎng)風險評分≥3、1月內使用三代頭孢/酶抑制劑、1月內使用碳青霉烯類、留置尿管、PICC、氣管切開、機械通氣≥5天、抑酸劑≥5天及鼻飼是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的危險因素(見表4)。

六、多元Logistic回歸分析

對上述9種高危因素使用Logistic逐步回歸分析方法進一步篩選(α入=0.10，α出=0.15)。各因素賦值情況(見表5)。結果顯示1月內使用三代頭孢/酶抑制劑、1月內使用碳青霉烯類以及留置尿管為碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的獨立危險因素(見表6)。

表5 CRKP感染的高位因素與賦值情況

七、碳青霉烯酶基因檢測結果

對57株CRKP菌株進行PCR擴增，有39株(68.4%)攜帶blaKPC基因,6株(10.5%)攜帶blaIMP基因。擴增的KPC和IMP型基因產物(見電泳圖1～2)。

圖1 部分菌株擴增blaKpC基因產物電泳圖(目標片段334bp)

圖2 部分菌株擴增blaIMP基因產物電泳圖(目標片段195bp)

討 論

抗微生物藥物耐藥性已被列為世界衛(wèi)生組織2019年全球十大健康威脅之一。CHINET監(jiān)測網顯示肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2017年的20.9%和24.0%,與此同時,肺炎克雷伯菌年分離率亦呈穩(wěn)步上升趨勢[1]。關于CRKP定值率的研究，土耳其專家回顧性分析了某醫(yī)院2009-2013年CRKP感染情況，結果表明CRKP定值率為6.8%[2]。本研究中，我院感染肺炎克雷伯菌患者中，CRKP感染者占9.6%(57/591)。從臨床科室分布看，CRKP感染者主要集中在呼吸內科、神經內科、神經外科和ICU，占總數的77.2%(44/57),這與其收治患者基礎疾病、病情危重及多侵入性診治可能相關；從感染部位分布情況看，CRKP感染部位主要分布于下呼吸道和泌尿道，占總數的92.9%(53/57)，這與相關報道較一致[3]。

住院患者感染CRKP是導致死亡的獨立危險因素之一[4]。因此，通過認知CRKP感染的危險因素進而采取綜合預防措施減少其感染率顯得尤為重要。本研究發(fā)現，機械通氣、各類留置導管等侵入性操作和濫用抗生素等為CRKP感染的高危因素，既往報道也佐證這一結論[5]。本研究同時發(fā)現入院時營養(yǎng)風險篩查評分(NRS-2002)≥3和應用抑酸劑≥5天亦與CRKP感染密切相關，雖然在相關文獻分析中未得到類似結論[6]，但在其它耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌感染中得到報道[7]。進一步的多元Logistic回歸分析表明，1月內使用碳青霉烯類抗生素是CRKP感染的獨立危險因素，這與國內外先前研究一致[8]。同時，1月內使用三代頭孢/酶抑制劑和留置尿管也為CRKP感染的獨立危險因素。本研究顯示，相比CSKP感染組，使用兩種或三種抗生素患者的比例在CRKP感染組中顯著增加。從本次回顧性病例對照研究的結果來看，應從先前使用三代頭孢/酶抑制劑、碳青霉烯類和留置尿管等危險因素入手減少CRKP感染的發(fā)生率。使用抗生素前應綜合患者感染部位、病情輕重、耐藥性風險及本地感染的流行病資料等多方面因素，做到合理、有針對性使用[9]。在診療過程中，應減少或縮短侵入性醫(yī)療器械的使用，加強手衛(wèi)生和醫(yī)院感染控制。

碳青霉烯類抗生素因對產超廣譜β-內酰胺酶和A mpC酶的革蘭氏陰性桿菌有很好的活性，在臨床重癥感染治療中往往取得令人滿意的療效。近年來，隨著碳青霉烯類過度及不規(guī)范使用，其耐藥菌株數量激增，特別是腸桿菌科肺炎克雷伯菌。碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制之一是產碳青霉烯酶，其中以KPC型、OXA型、IMP型和NDM型酶為主，因外膜通透性改變或(和)外排泵高表達所致藥物耐藥少見[10-12]。OXA型和NDM型酶更多見于耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌菌株。國內相關研究表明，我國CRKP以產KPC型碳青霉烯酶為主[13-14]。本研究也證實碳青霉烯酶的產生，我院CRKP耐藥的原因仍以產KPC型酶為主(39/57)，其次為產IMP型酶(6/57)。總之，細菌耐藥原因較為復雜，可能同時存在幾種耐藥機制。不同區(qū)域、不同狀態(tài)(感染或定值)、不同環(huán)境(一種或多種耐藥微生物感染)可能存在耐藥機制的多樣性。本研究只針對碳青霉烯類抗生素耐藥的最主要機制產碳青霉烯酶做了相關探討，存在一定局限性。

通過認知CRKP感染的高危因素及耐藥機制，給予綜合預防措施和針對性治療顯得十分重要。同時，應著重防控其傳播。