擴(kuò)散峰度成像評估兔惡性骨腫瘤髓內(nèi)浸潤范圍及與病理指標(biāo)的相關(guān)性研究

房亞軍，周銳志，陳海松，徐文堅(jiān)

原發(fā)性惡性骨腫瘤的發(fā)病率雖然不高，但其進(jìn)展迅速，侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高，給患者生命健康及生活質(zhì)量帶來極大危害[1-2]。多數(shù)原發(fā)惡性骨腫瘤好發(fā)于兒童和青少年，約2/3為骨肉瘤，其余大部分屬于尤因肉瘤家族[3-4]。過去單純截肢術(shù)是肢體惡性骨腫瘤的唯一治療手段，隨著醫(yī)學(xué)檢查技術(shù)特別是MR新技術(shù)的發(fā)展，惡性骨腫瘤浸潤范圍判斷的準(zhǔn)確性得以提高。近年來骨骼和關(guān)節(jié)置換等保肢術(shù)輔以放、化療逐漸代替了單純截肢術(shù)，越來越多地被應(yīng)用于臨床。

惡性骨腫瘤在其生長過程中，腫瘤細(xì)胞蔓延、浸潤生長，腫瘤遠(yuǎn)端邊界不清。在腫瘤與正常組織之間存在著過渡的移行區(qū)，移行區(qū)為含有少量腫瘤細(xì)胞的微觀浸潤區(qū)及無腫瘤細(xì)胞的單純水腫區(qū)。正確區(qū)分腫瘤邊界的微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)可避免截骨過度或截骨不足，最大程度保留正常骨組織，對外科保肢手術(shù)方案的制定及患者預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。

目前，國內(nèi)外關(guān)于MRI擴(kuò)散峰度成像(diffusion kurtosis imaging，DKI)對骨腫瘤髓內(nèi)浸潤范圍的報(bào)道相對少見，與組織病理學(xué)相對照的研究更少。本文采用兔VX2惡性骨腫瘤模型行MR擴(kuò)散加權(quán)DKI序列成像，分析骨腫瘤不同區(qū)域DKI各參數(shù)間的差異，以及各參數(shù)與組織病理學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性，旨在探討其對顯示骨腫瘤髓內(nèi)浸潤范圍的價(jià)值。

材料與方法

1.VX2模型兔的制備

選擇從青島食品和藥物管理局購買的純種雄性新西蘭大白兔30只，月齡2個(gè)月左右，體重2～3 kg。于已麻醉的兔右側(cè)脛骨近端較平坦處依次縱行切開皮膚、皮下筋膜、肌肉組織，注意避開血管，切口10～15 mm，最后剝離骨膜，暴露脛骨近端骨皮質(zhì)。于脛骨平臺下約20 mm鉆孔，直徑1～2 mm。采用24G醫(yī)用頭皮留置針將3～4塊1 mm×1 mm腫瘤組織塊送入髓腔，深度約1 cm。骨蠟封口、分層縫合，碘伏消毒，無菌紗布覆蓋，包扎。術(shù)后3天連用青霉素40萬IU/KG肌注，預(yù)防感染[5-8]。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.MRI檢查方法

模型兔腫瘤生長14～21 d后行常規(guī)MRI及DKI掃描，掃描前麻醉模型兔以防產(chǎn)生運(yùn)動偽影。MRI檢查采用3.0T磁共振成像系統(tǒng)(Siemens MAGNETOM Prisma 3.0 T，Erlangen，Germany)，8通道兔線圈(上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司)。模型兔取仰臥位，足先進(jìn)，對兔右側(cè)股骨下段至踝關(guān)節(jié)水平分別行冠狀面、橫軸面快速自旋回波(TSE)T1WI，選取脛骨最大切面行矢狀面TSE-T1WI、TSE-T2WI、短時(shí)反轉(zhuǎn)恢復(fù)抑脂序列(short tau inversion recovery，STIR)，然后采集MR擴(kuò)散加權(quán)DKI序列圖像，采用自由呼吸單次激發(fā)平面回波序列，在三個(gè)正交方向上施加擴(kuò)散梯度，b值分別為0、1000、1500、2000 s/mm2。各序列的掃描參數(shù)見表1。

表1 MRI常規(guī)序列及DKI序列的掃描參數(shù)

3.MRI圖像后處理

VX2骨腫瘤DKI原始DICOM圖像經(jīng)syngo.via傳輸至工作站，于西門子后處理軟件MR Body Diffusion Toolbox v1 3.0 測量DKI各定量指標(biāo)。選取包含腫瘤的最大矢狀層面，以病理為金標(biāo)準(zhǔn)行嚴(yán)格點(diǎn)對點(diǎn)對照，并結(jié)合MRI STIR序列在腫瘤實(shí)性區(qū)、微觀浸潤區(qū)、單純水腫區(qū)勾畫大小約1 mm的感興趣區(qū)(ROI)，注意避開腫瘤中央出血、壞死區(qū)。每個(gè)感興趣區(qū)均放置3次，取其平均值獲得各區(qū)域的平均擴(kuò)散系數(shù)(average diffusion coefficient，MD)及平均峰度(average kurtosis，MK)。

4.病理檢查

經(jīng)兔耳緣靜脈注入空氣處死模型兔，于股骨中下段至踝關(guān)節(jié)水平離斷患肢，沖洗干凈，用骨鋸機(jī)(KUGELTSG-CG，德國)沿脛骨長軸、對應(yīng)MRI最大矢狀面以層厚3 mm切片，固定24 h后于EDTA脫鈣液中進(jìn)行脫鈣約一個(gè)月，經(jīng)脫水、石蠟包埋行HE染色及免疫組化檢查(CD31、VEGF)。

腫瘤大體標(biāo)本對應(yīng)兔脛骨MRI圖像最大矢狀層面，按照Karim法[9]間距5 mm網(wǎng)格狀分割，坐標(biāo)軸的水平軸平行于脛骨平臺水平切線，編碼1～9；縱軸平行于脛骨骨干長軸，編碼A～X。根據(jù)大體標(biāo)本與影像大小的比例關(guān)系確定影像圖像的橫縱坐標(biāo)間隔(等比例)，實(shí)現(xiàn)MRI和病理圖像的點(diǎn)對點(diǎn)對照研究(圖1)。

圖1 腫瘤大體標(biāo)本及MRI圖像Karim法分區(qū)。

HE染色病理圖像于CaseViewer軟件中找到腫瘤實(shí)性區(qū)、微觀浸潤區(qū)及單純水腫區(qū)。400倍光鏡下在實(shí)性區(qū)及微觀浸潤區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)視野，分別得到每個(gè)視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞核總面積與視野面積之比，取其平均值為腫瘤細(xì)胞密度(tumor cell density，CD)。微血管密度(microvessel density，MVD)計(jì)數(shù)參照Weidner法。CD31抗體免疫染色玻片于100倍光鏡下找到微血管分布區(qū)，然后在200倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野計(jì)數(shù)血管，取其平均值為MVD計(jì)數(shù)結(jié)果。

400倍光鏡下統(tǒng)計(jì)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)陽性細(xì)胞的百分率，其得分為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積。選取3個(gè)視野取其平均值為VEGF的表達(dá)程度。染色強(qiáng)度分級：無染色為0，染色程度弱為1，中等為2，染色程度較強(qiáng)為3。陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0，0～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，76%～100%為4。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表2 VX2骨腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)、微觀浸潤區(qū)和單純水腫區(qū)的DKI各參數(shù)值比較

結(jié) 果

1.模型兔制備結(jié)果

成功制備模型兔25只，其中病理切片發(fā)現(xiàn)骨腫瘤邊界不清、存在微觀浸潤區(qū)者21只，將此21只納入研究。

2.DKI圖像參數(shù)分析結(jié)果

腫瘤STIR抑脂圖像及DKI原始圖像見圖2。MD值在VX2惡性骨腫瘤實(shí)性區(qū)、微觀浸潤區(qū)及單純水腫區(qū)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.747，P<0.05)；采用最小顯著差異性t檢驗(yàn)行多重比較，結(jié)果顯示腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)(P=0.000)、微觀浸潤區(qū)與水腫區(qū)(P=0.000)、實(shí)性區(qū)與水腫區(qū)(P=0.000)的MD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)性區(qū)MD值低于微觀浸潤區(qū)及水腫區(qū)，微觀浸潤區(qū)的MD值低于單純水腫區(qū)。MK值在VX2惡性骨腫瘤實(shí)性區(qū)、微觀浸潤區(qū)及單純水腫區(qū)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.926，P=0.402，表2)。

圖2 a)STIR抑脂圖像，腫瘤呈外周高、中央稍低信號影；b)b值為0的DKI圖像，腫瘤呈高信號；c)b值為1000s/mm2的DKI圖像；d)b值為1500s/mm2的DKI圖像；e)b值為2000s/mm2的DKI圖像。

MD值診斷惡性骨腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)、微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)的ROC曲線下面積分別為0.891、0.831(圖3)，MD值取1028.5 mm2/s可作為鑒別惡性骨腫瘤微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)的的閾值，敏感度和特異度分別為95.24%和66.67%，MD值>1028.5 mm2/s時(shí)可考慮為腫瘤的單純水腫區(qū)。

3.病理結(jié)果

HE染色示VX2骨腫瘤實(shí)性區(qū)腫瘤細(xì)胞核大、深染，大小不一，排列緊密，核分裂象多，核漿比高，部分呈巢狀排列；腫瘤移行區(qū)包括微觀浸潤區(qū)和單純水腫區(qū)，其中微觀浸潤區(qū)內(nèi)可見少量腫瘤細(xì)胞呈散在片狀分布，而單純水腫區(qū)無腫瘤細(xì)胞浸潤。CD31染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色著色，與周圍組織分界欠清，腫瘤微觀浸潤區(qū)亦見內(nèi)皮細(xì)胞染色；VEGF染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞胞漿染色為棕褐色或棕黃色，邊界清(圖4)。VX2骨腫瘤的水腫區(qū)為炎性細(xì)胞浸潤，無腫瘤細(xì)胞，其免疫組化指標(biāo)為零。CD、MVD、VEGF在腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，且3個(gè)病理指標(biāo)鑒別腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)的AUC值均較高，分別為1.000、0.998、0.870(表3)。

表3 腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)與微觀浸潤區(qū)的CD、MVD、VEGF值比較

4.病理學(xué)與DKI參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果

腫瘤實(shí)性區(qū)及微觀浸潤區(qū)的MD值與CD計(jì)數(shù)均呈顯著負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.745、-0.753，P<0.05)，與VEGF計(jì)數(shù)亦呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.726、-0.697，P<0.05)，與MVD之間無明顯相關(guān)性(r值分別為- 0.356、-0.186，P>0.05)。

圖3 a)MD鑒別腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)的ROC曲線；b)MD鑒別微觀浸潤區(qū)與水腫區(qū)的ROC曲線。 圖4 a)病理圖示腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)(A)、微觀浸潤區(qū)(B)和單純水腫區(qū)(C)，腫瘤細(xì)胞核大、深染，核分裂象多，核漿比高，部分呈巢狀排列；微觀浸潤區(qū)散在少量腫瘤細(xì)胞呈片狀分布；單純水腫區(qū)無腫瘤細(xì)胞浸潤(×100，HE)； b)CD31染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色著色(×100，CD31)； c) VEGF染色后血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞胞漿染色為棕褐色或棕黃色，邊界清(×100，VEGF)。

腫瘤實(shí)性區(qū)及微觀浸潤區(qū)的MK值與CD、MVD、VEGF計(jì)數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r值分別為0.152、0.108，0.118、008，0.140、0.339，P>0.05)。

討 論

本研究成功建立兔VX2惡性骨腫瘤模型，模型制備成功率達(dá)83.3%(25/30)，腫瘤邊界不清、存在微觀浸潤區(qū)者的比例為70%，本研究所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均來自存在微觀浸潤區(qū)的骨腫瘤模型。該腫瘤模型是一種同種異體移植性模型，生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、傳代簡易，且該腫瘤與人類惡性骨腫瘤的生物學(xué)行為相似，血供豐富，呈浸潤性生長，進(jìn)行性破壞周圍結(jié)構(gòu)，是臨床研究惡性腫瘤的理想動物模型[10-12]。趙景新等[12]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸液植入法較組織塊植入法可提高腫瘤局部浸潤率，但后者更易培養(yǎng)出大的瘤體，從而使實(shí)驗(yàn)更易于觀察。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)手術(shù)方法將VX2骨腫瘤組織塊植入脛骨，瘤體相對較大且存在微觀浸潤區(qū)者的比例也相對較高。

病理學(xué)光鏡下可區(qū)分微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)，微觀浸潤區(qū)可見散在的少量腫瘤細(xì)胞及炎性細(xì)胞，骨髓水腫區(qū)內(nèi)無腫瘤細(xì)胞。瘤周水腫的發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚，有文獻(xiàn)認(rèn)為主要包括炎癥反應(yīng)、血管源性水腫、壓力淤滯性水腫等[13-14]；腫瘤周圍的炎性反應(yīng)、毛細(xì)血管滲出及腫瘤內(nèi)部壓力增高也可導(dǎo)致瘤周水腫，而惡性腫瘤周圍水腫主要可能是由于腫瘤浸潤或周圍組織血流灌注及細(xì)胞通透性的改變所引起。

MRI可很好地顯示腫瘤周圍水腫情況，但常規(guī)MRI常難以區(qū)分腫瘤周圍的微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)。相關(guān)研究認(rèn)為，常規(guī)T1WI是判斷骨腫瘤髓內(nèi)浸潤程度的最佳方法[15-16]，但T1WI顯示的腫瘤邊界依靠的是骨髓內(nèi)脂肪替代所顯示的腫瘤的所謂邊緣，無法顯示和區(qū)分微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)，其顯示的腫瘤邊緣并不一定是腫瘤在病理意義上的真正確切邊緣。本研究制備成功的兔VX2骨腫瘤模型中，MRI常規(guī)序列顯示腫瘤邊界不清，分析其原因可能是模型兔均為未成年兔，骨髓以紅骨髓為主，脂肪信號較少，使得骨髓替代的腫瘤區(qū)域與正常區(qū)域之間在T1WI上缺乏對比而難以區(qū)分，而T2WI和STIR抑脂序列在紅骨髓和微觀浸潤區(qū)以及單純水腫區(qū)中均顯示高信號；另外，VX2瘤株種植成功后可迅速增殖呈浸潤性生長，使得骨腫瘤的邊界更加難以區(qū)分。目前已有研究指出ADC值對區(qū)分惡性骨腫瘤微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)具有重要價(jià)值[17]；DCE-MRI定量參數(shù)能準(zhǔn)確評估惡性骨腫瘤髓內(nèi)浸潤范圍，其中Ktrans值的準(zhǔn)確度最高[18]。但目前尚無DKI鑒別骨腫瘤周圍水腫與腫瘤浸潤的研究報(bào)道。

DKI成像目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19-21]、肝臟[22-24]等方面的研究較多，已證實(shí)其臨床應(yīng)用價(jià)值及研究前景。DWI為常規(guī)單e指數(shù)模型，假設(shè)人體內(nèi)水分子擴(kuò)散是不受阻礙的自由運(yùn)動，水分子在隨機(jī)運(yùn)動的情況下其擴(kuò)散運(yùn)動位移滿足高斯分布即正態(tài)分布；而生物組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散實(shí)際上是在細(xì)胞間隙、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動，故運(yùn)動位移是非高斯分布的。水分子擴(kuò)散受周圍環(huán)境的限制程度越大、體素內(nèi)組織成分越混雜，擴(kuò)散的非高斯性越顯著。DKI是以非高斯模型為基礎(chǔ)的一種功能MRI新技術(shù)，可提供較常規(guī)DWI更精確的組織特征信息，由Jensen等[25]首次提出。MD和MK是DKI模型的兩個(gè)定量參數(shù)，MD是校正后的平均表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADC)值，代表某一體素內(nèi)水分子擴(kuò)散的大小和程度，與組織細(xì)胞密度有關(guān)，其值越大表明組織內(nèi)水分子擴(kuò)散受限程度越小[26]。與ADC值相比，MD值可更好地量化水分子擴(kuò)散的非高斯行為，從而反映微觀結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，更接近于水分子在生物組織中的運(yùn)動和分布[27-28]；MK為平均峰度，其大小取決于感興趣區(qū)內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度，組織微觀結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，非正態(tài)分布水分子擴(kuò)散受限越顯著，即MK值越大[29]。

腫瘤迅速增殖生長依賴于腫瘤新生血管的形成。惡性腫瘤細(xì)胞生長快速，耗氧耗糖增加，導(dǎo)致腫瘤及其周圍組織的低氧和低糖狀態(tài)，從而刺激多種血管生成調(diào)節(jié)因子如VEGF的分泌[30-31]。VEGF為目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物、間質(zhì)膠原酶，增加微血管通透性。目前MVD是評估腫瘤新生血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)[32]，MVD計(jì)數(shù)增高，表明腫瘤新生微血管增生活躍。

本研究Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示MD值與腫瘤細(xì)胞密度(CD)呈負(fù)相關(guān)，細(xì)胞密度越大，MD值越低，這與林浩等[33]在鼻咽癌中的研究結(jié)果類似。腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)內(nèi)腫瘤細(xì)胞密度較高，微觀浸潤區(qū)內(nèi)少量腫瘤細(xì)胞呈散在分布，水腫區(qū)無腫瘤細(xì)胞浸潤。腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)的MD值低于微觀浸潤區(qū)和單純水腫區(qū)，微觀浸潤區(qū)的MD值亦顯著低于單純水腫區(qū)，MD值在腫瘤各區(qū)域間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是因?yàn)镈KI對圖像信號衰減的擬合優(yōu)于單指數(shù)模型，能更準(zhǔn)確地反映病變的異質(zhì)性[34]。徐阿巧等[35]發(fā)現(xiàn)MVD、VEGF在不同子宮肌瘤病理類型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另有研究指出ADC值與宮頸癌MVD值呈負(fù)相關(guān)[36]，MD值是表觀擴(kuò)散系數(shù)的平均值，更可直觀準(zhǔn)確地反映其與MVD的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示MD值與腫瘤實(shí)性區(qū)及微觀浸潤區(qū)的VEGF表達(dá)水平均有一定相關(guān)性，但MD值與MVD值相關(guān)性不高，本研究與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果存在一定差異，筆者分析原因是VX2腫瘤惡性程度高，腫瘤在其生長過程中微血管生成期、穩(wěn)定維持期及血管退化各種狀態(tài)均存在，CD31染色不均一；另外可能與細(xì)胞突變、血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性較高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MD值鑒別診斷惡性骨腫瘤實(shí)性區(qū)與微觀浸潤區(qū)、微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)的AUC均大于0.5，在區(qū)分腫瘤不同區(qū)域方面具有較高的敏感度和特異度。臨床工作中對于區(qū)分惡性骨腫瘤邊界，實(shí)際上就是區(qū)分微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)，DKI圖像有助于區(qū)分兩者，當(dāng)MD值大于1028.5 mm2/s時(shí)，可考慮為骨腫瘤周圍單純水腫區(qū)，對臨床工作有一定指導(dǎo)意義。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，前列腺良、惡性組織間的MK值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[37]；王麗芳等[38]研究發(fā)現(xiàn)乳腺惡性腫瘤的MK值與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，MK值在腫瘤實(shí)性區(qū)、微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤實(shí)性區(qū)和微觀浸潤區(qū)的MK值與CD、MVD、VEGF計(jì)數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，本研究與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果不符，分析其原因可能包括兩點(diǎn)：①兔VX2骨腫瘤因其生長迅速，腫瘤中央多為壞死，腫瘤細(xì)胞環(huán)繞于壞死區(qū)域周圍；②腫瘤DKI圖像后處理時(shí)，全部感興趣區(qū)由人工勾畫，免疫組化指標(biāo)均由人工計(jì)數(shù)，可能存在一定誤差。

當(dāng)前DKI參數(shù)MD值對骨腫瘤微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)的鑒別診斷具有一定研究價(jià)值，可作為鑒別兩者的聯(lián)合手段之一，尚無能力單獨(dú)鑒別，故仍需進(jìn)一步研究，以提高DKI在骨腫瘤微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)診斷中的應(yīng)用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明DKI參數(shù)MD對判斷惡性骨腫瘤范圍特別是鑒別微觀浸潤區(qū)與單純水腫區(qū)具有較高價(jià)值，MD值與腫瘤浸潤區(qū)的CD、VEGF計(jì)數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。