基于中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶介導(dǎo)的通路研究地膽頭干預(yù)慢性阻塞性肺疾病患者氣道黏液高分泌及療效觀察

賈盼紅，李 琪，熊曉嫚，周向東

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 簡(jiǎn)稱慢阻肺，以進(jìn)行性加重、不完全可逆的氣流受限為特點(diǎn)，臨床常出現(xiàn)反復(fù)咳嗽、咳痰、發(fā)熱，漸進(jìn)性呼吸困難。疾病晚期常出現(xiàn)呼吸衰竭、肺性腦病、肺心病，極大危害患者生命，是全球致死率、致殘率最高疾病之一。正常生理情況下，氣道存在少量黏液，少量黏液在氣道的先天性免疫過程中發(fā)揮極其重要作用，而過度黏液分泌會(huì)使纖毛清除功能受損，致使感染加重，且會(huì)加重呼吸道梗阻，致使氣流受限進(jìn)一步加重[1]，氣道黏液高分泌是慢阻肺、支氣管哮喘等疾病主要的病理生理特點(diǎn)[2]。目前，氣道黏液高分泌已經(jīng)成為導(dǎo)致慢阻肺高發(fā)病率、高死亡率的重要因素[3]。氣道黏液高分泌的機(jī)制十分復(fù)雜，其信號(hào)通路由多種因素、多種物質(zhì)共同參與，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程層層遞進(jìn)，之間又相互影響、相互交叉、相互作用[4]。目前,關(guān)于NE介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究較多，研究證實(shí)，慢阻肺病人氣道分泌物中NE大量蓄積。NE為中性粒細(xì)胞激活后釋放的一種可引起組織損傷的炎性毒性分子，其與慢阻肺發(fā)病及病情變化密切相關(guān)[5]。研究證實(shí)，NE是促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌黏液蛋白(MUC5AC)的最強(qiáng)因素[6],氣道黏液高分泌主要源于的MUC5AC高表達(dá)。MUC5AC的高表達(dá)和杯狀細(xì)胞增生是慢阻肺病人典型的病理特征，貫穿疾病始終[7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)采用NE特異性抑制劑西維來司鈉對(duì)大鼠的慢性氣道炎癥模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可使大鼠氣道黏液蛋白表達(dá)降低[8]。

地膽頭(Elephantopus scaber Linn)又名苦地膽等，是中國(guó)長(zhǎng)江以南常用的民間中草藥，被《海南常見中草藥名錄》收錄。地膽頭具有清熱解毒、抑菌等功效[9]。范瓊等[10]發(fā)現(xiàn)地膽頭主要成分為酚類、類黃酮物質(zhì)，酚類、黃酮類物質(zhì)是強(qiáng)的抗自由基物質(zhì)[11]。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)及臨床觀察證實(shí)地膽頭明能夠明顯減少慢阻肺患者痰量，減少其急性加重次數(shù)，減少炎癥因子的釋放。但是否能夠降低氣道黏液高分泌，是否能夠減少M(fèi)UC5AC的分泌，以及是否與NE介導(dǎo)的通路相關(guān)尚不清楚。本研究通過檢測(cè)地膽頭治療前后慢阻肺病人血清中NE及MUC5AC的表達(dá)，并觀察肺功能(FEV1、FEV1/FVC)變化，觀察其臨床療效，與對(duì)照組進(jìn)行比較分析，旨在為慢阻肺氣道黏液高分泌臨床防治提供新思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月～2019年6月在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診慢阻肺急性加重的住院病人160例，年齡55～74歲，平均 (58.86±4.52)歲；病程4～15年，平均 (10.25±2.66)年。采取隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為觀察組和對(duì)照組，各80例。兩組年齡、患病時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；兩組予以吸氧、抗感染、解痙、祛痰等基礎(chǔ)治療，觀察組加用地膽頭液4 mL霧化吸入，每天1次,每次15 min，治療2周；同期選80名健康體檢者為健康對(duì)照組。所有體檢者FEV1/FVC大于70%。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2017年慢阻肺診治中國(guó)專家共識(shí)診治標(biāo)準(zhǔn)的患者[12]；排除標(biāo)準(zhǔn)：患支氣管擴(kuò)張、哮喘、活動(dòng)性肺結(jié)核、心功能不全等造成呼吸困難的疾?。唤肽陜?nèi)曾使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等抗氧化劑；經(jīng)本院倫理委員會(huì)許可，受試者自愿簽定知情同意書。

1.2 主要儀器試劑

酶標(biāo)儀(奧地利Anthosht公司)，超凈工作臺(tái)(山東博科有限公司)，高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckmancoulter公司)，地膽頭液(廣州市紅十字醫(yī)院贈(zèng))，人NE、MUC5AC試劑盒(中國(guó)上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)方法

入院時(shí)分別抽取觀察組、對(duì)照組、健康對(duì)照組早晨空腹靜脈血4 mL，治療2周后抽取觀察組、對(duì)照組早晨空腹靜脈血4 mL，后置于離心機(jī)離心15 min(3 000 r/min)，分離血清，放入-80℃冰箱待測(cè)。ELISA檢測(cè)觀察組、對(duì)照組治療前后及健康對(duì)照組NE、MUC5AC水平，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 療效觀察

參照文獻(xiàn)[12]中慢阻肺臨床癥狀評(píng)分:活動(dòng)耐力下降，胸悶加重記1分，咳嗽、咳痰加重，記1分，痰液更加黏稠或者有膿性改變，咳痰較前困難，記1分。顯效:評(píng)分較診療前下降2～3分，有效:評(píng)分較診療前下降1分，無效：癥狀無減輕甚至加重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組治療后療效比較

治療2周后，觀察組總有效率大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組和對(duì)照組治療后療效比較[n=80,n(%)]Tab 1 Comparative analysis of clinical effects of patients in observation group and control group after treatment [n=80,n(%)]

2.2 各組血清NE、MUC5AC水平及肺功能FEV1、FEV1/FVC比較

與健康對(duì)照組比較，觀察組和對(duì)照組治療前血清中NE、MUC5AC表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組治療后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC與觀察組診療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組治療前后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組治療后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC與對(duì)照組治療后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組血清NE、MUC5AC水平及肺功能FEV1、FEV1/FVC比較Tab 2 Comparison of serum levels of NE and MUC5AC measured by ELISA and lung function of

3 討論

慢阻肺疾病是高發(fā)病率、高病殘率、高死亡率的一種呼吸系疾病，WHO統(tǒng)計(jì)分析慢阻肺是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的排名第4疾病，每年約有6億患者受其困擾，且人數(shù)逐年增加[13]。研究證實(shí)，黏液糖蛋白、蛋白質(zhì)及脂類3種物質(zhì)組成了氣道黏液。黏液可分成上下兩層，上層為黏液層，其能夠通過纖毛細(xì)胞的擺動(dòng)，吸附空氣中的微小顆粒物及致病菌，下層為漿液層，可潤(rùn)滑纖毛，保證黏液纖毛運(yùn)動(dòng)[14，15]。近些年，越來越多研究者關(guān)注慢阻肺患者氣道黏液高分泌。氣道黏液高分泌不僅能夠加重氣道梗阻，使肺功能急速下滑，還為細(xì)菌繁殖提供了良好培養(yǎng)基，致使抗菌藥物的殺菌環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致氣道感染難以控制及反復(fù)發(fā)作；且感染產(chǎn)生的炎性物質(zhì)，又可以再一次使黏液高分泌，形成惡性循環(huán)。黏液高分泌與慢阻肺住院率密切相關(guān)，其已經(jīng)成為發(fā)病率、死亡率居高不下危險(xiǎn)因素[16-18]。因此，有效遏制氣道黏液高分泌狀態(tài)將成為防治慢阻肺可行新途徑。NE是中性粒細(xì)胞所釋放的炎癥介質(zhì)之一。正常情況下，NE可以保護(hù)機(jī)體免受感染的傷害，然而過量的NE能夠破壞氣道纖毛機(jī)構(gòu)及功能，并大量降解膠原蛋白以及誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞及黏液下腺的增生、促進(jìn)黏蛋白分泌[19]。目前研究證實(shí)，NE為最強(qiáng)的促黏液分泌因子，其可通過多種通路調(diào)控MUC5AC，包括氧自由基(ROS)、EGFR、TOLL樣受體4信號(hào)通路，它們之間相互關(guān)聯(lián)、相互交錯(cuò)[20]。抑制NE的活性，可明顯抑制MUC5AC合成[21，22]。近年，研究者針對(duì)氣道黏液高分泌開發(fā)了一些西藥，但較多仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。GOLD指南指出：慢阻肺穩(wěn)定期ICS、LAMA、LABA聯(lián)合使用可減少慢阻肺病人急性加重次數(shù)，提高其生活質(zhì)量，可是因?yàn)樗幬锇嘿F，長(zhǎng)期使用增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且有增加肺炎、心血管疾病事件、股骨頭壞死等相關(guān)不良影響，嚴(yán)重影響了慢阻肺病人長(zhǎng)期治療的依從性及臨床療效[23，24]。中草藥可有效補(bǔ)充西藥的不足之處，本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明紅茶中提取物茶黃素可有效改善氣道黏液高分泌狀態(tài)，其機(jī)制是通過抑制NE介導(dǎo)的MUC5AC含量及MUC5ACmRNA表達(dá)量所致，且與劑量依賴關(guān)系[25]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)及臨床觀察證實(shí)地膽頭能夠有效抑制社區(qū)獲得性肺炎炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TNF-α的釋放，改善肺炎患者咳嗽、咳痰癥狀，有效縮短住院時(shí)間，且無不良反應(yīng)發(fā)生。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)3組血清中NE、MUC5AC表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺病人血清中NE、MUC5AC明顯高于健康體檢組，提示慢阻肺病人NE介導(dǎo)的氣道黏液高分泌MUC5AC通路被激活；給予地膽頭液霧化治療后，觀察組體內(nèi)NE、MUC5AC的表達(dá)明顯降低；觀察組、對(duì)照組治療后血清中NE、MUC5AC存在明顯差異(P<0.05)，經(jīng)pearson相關(guān)性分析，NE、MUC5AC存在正相關(guān)關(guān)系，提示地膽頭液抑制慢阻肺患者M(jìn)UC5AC的分泌可能與NE介導(dǎo)的通路相關(guān)。地膽頭組總有效率優(yōu)于對(duì)照組，能夠明顯緩解癥狀，且無不良反應(yīng)發(fā)生，值得推廣。本研究有局限之處，僅提示地膽頭抑制慢阻肺病人MUC5AC減少可能與NE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，下一步筆者將從基因及細(xì)胞層面進(jìn)行更深層次地探索。