羊草根際促生菌的分離篩選及促生作用研究

漫靜，唐波，鄧波，李佳歡，何玉娟，張佳良

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100193；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100049）

根際（rhizosphere）是植物根系周圍受根系影響的狹小區(qū)域，根際中包含著大量的微生物，如細(xì)菌、真菌及病原菌，其中有一類細(xì)菌能通過不同的作用方式來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，這類細(xì)菌被稱為植物根際促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）［1?2］。大量研究表明，一方面PGPR 能夠通過固氮、溶解土壤中的無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷及分泌植物激素如生長(zhǎng)素（indole-3-acetic acid，IAA）而直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育［3?4］。另一方面，當(dāng)植物處于鹽堿、干旱等非生物脅迫時(shí)或遭受病原菌等生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)乙烯水平會(huì)大幅升高，這種由于脅迫導(dǎo)致的植物體內(nèi)過量的乙烯嚴(yán)重阻礙了植物的生長(zhǎng)發(fā)育甚至?xí)?dǎo)致植物死亡。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，有一類PGPR 能夠通過分泌1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase，簡(jiǎn)稱ACC 脫氨酶），將乙烯合成前體ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate）分解轉(zhuǎn)化為α-酮丁酸（α-ketobutyrate acid，α-KA）和氨，從而避免或降低逆境中乙烯對(duì)植物的傷害，而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育［5?6］。基于PGPR 具有能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的這些特性，可代替化肥與農(nóng)藥，從而改善過量施用化肥和農(nóng)藥對(duì)土壤環(huán)境嚴(yán)重污染的現(xiàn)狀，因此，開發(fā)高效的PGPR 菌劑成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

羊草（Leymus chinensis）是禾本科賴草屬根莖型多年生牧草，為歐亞大陸草原東部區(qū)的重要建群植物，主要分布于我國(guó)的東北3 省及內(nèi)蒙古、河北、新疆等省區(qū)。由于羊草主要生長(zhǎng)于草原區(qū)域，因此對(duì)不同的生境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，具有耐旱、耐寒、耐鹽堿的生態(tài)特性，該物種在改良鹽堿地，保持水土等方面起著重要作用［7］。

目前，眾多學(xué)者已從小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）等糧食作物中分離篩選出優(yōu)良的PGPR 菌株并用于后續(xù)菌劑的研發(fā)［8?10］，但對(duì)草地牧草植物PGPR 資源的挖掘及促生潛力的研究相對(duì)較少。此外，PGPR 的數(shù)量分布及促生特性不僅與植物種類有關(guān)，還與植物所處的環(huán)境和土壤條件密切相關(guān)［11］。因此，本研究從不同地區(qū)的天然草地羊草根際分離篩選PGPR 菌株，并初步研究菌株的促生特性，從而為特定生境下羊草PGPR 菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015 年6 月中旬?7 月，選擇羊草生長(zhǎng)的主要地區(qū)即黑龍江省草業(yè)研究所蘭西試驗(yàn)基地（Lanxi，LX，46°32′N，125°28′E，海拔160 m）、內(nèi)蒙古錫林郭勒草原白音錫勒牧場(chǎng)（Xilinhot，XLHT，44°08′N，117°05′E，海拔1224 m）和內(nèi)蒙古呼倫貝爾海拉爾區(qū)謝爾塔拉牧場(chǎng)（Hulun Buir，HLBE，49°19′N，119°55′E，海拔628 m）3 個(gè)樣地，采集長(zhǎng)×寬×高為10 cm×10 cm×30 cm 的包含羊草根系的土塊，每個(gè)采樣區(qū)采集5 個(gè)，共15 個(gè)土塊。分別將各樣區(qū)采集的包含羊草根系的土塊放入無(wú)菌自封袋中，于4 ℃冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行PGPR 的分離與篩選。

1.2 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基

無(wú)氮培養(yǎng)基（nitrogen free medium，NFM）用于固氮菌的分離［12］；PKO（Pikovaskaia’s）無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基用于溶解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的分離［Ca3（PO4）2為唯一磷源］；蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基用于溶解有機(jī)磷細(xì)菌的分離（蛋黃卵磷脂為唯一磷源）［13］；PAF（Pseudomonas agar F）、DF 鹽（Dworkin and Foster）、ADF 培養(yǎng)基用于含ACC 脫氨酶促生菌的富集與分離［14］；溶菌肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）用于固氮菌和溶磷菌的保存；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soybean broth，TSB）用于含ACC 脫氨酶促生菌的保存［14］。

NFM 培 養(yǎng) 基：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，KOH 4.5 g，蘋果酸5.0 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚藍(lán)5 mL，瓊脂18 g（半固體培養(yǎng)基加2 g，液體培養(yǎng)基不加），蒸餾水1000 mL，pH 7.0；

PKO 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.0 g，酵母粉0.5 g，瓊脂18 g（液體培養(yǎng)基不加），蒸餾水1000 mL，pH 7.0；

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，蛋黃卵磷脂0.2 g，酵母粉0.4 g，瓊脂18 g（液體培養(yǎng)基不加），蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5；

PAF 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酪蛋白水解物10.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油10 mL，蒸餾水1000 mL，pH 7.5；

DF 鹽培養(yǎng)液：KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸2 mL，檸檬酸2.0 g，（NH4）2SO42.0 g，ZnSO4·7H2O 0.1246 mg，CuSO4·5H2O 0.0782 mg，MnSO40.0112 mg，MoO30.01 mg，H3BO30.01 mg，蒸餾水1000 mL，pH 7.5；

ADF 培養(yǎng)基：KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，葡萄糖2.0 g，葡萄糖酸2 mL，檸檬酸2.0 g，ZnSO4·7H2O 0.1246 mg，CuSO4·5H2O 0.0782 mg，MnSO40.0112 mg，MoO30.01 mg，H3BO30.01 mg，蒸餾水1000 mL，pH 7.5，瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基不加）。培養(yǎng)基高溫滅菌后加入1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC），使其終濃度達(dá)到3.0 mmol·L?1；

LB 培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5；

TSB 培養(yǎng)基：K2HPO42.5 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，大豆蛋白胨3.0 g，胰蛋白胨17 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.5，瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基不加）。

1.3 羊草根際促生菌的分離

1.3.1 固氮菌與溶磷菌的分離 為了便于研究，本試驗(yàn)將羊草根際細(xì)分為距根系較遠(yuǎn)土壤（soil away from roots，NRS）、根表土壤（soil adhering to roots，RS）、根系表面（rhizoplan of roots，RP）和根內(nèi)（histoplan of roots，HP）4 個(gè)區(qū)域，并通過平板涂布法分別對(duì)這4 個(gè)區(qū)域的PGPR 進(jìn)行分離篩選［15］。具體方法如下：取羊草根系周圍（5～15 mm）的土壤樣品10 g，磨細(xì)后溶于90 mL 已滅菌的0.85%的生理鹽水中，200 r·min?1充分震蕩30 min 后靜置，所獲上清液即為10?1的NRS 稀釋液，按照梯度稀釋的方法依次制備10?2、10?3、10?4和10?5的NRS 稀釋液，備用。取已抖落表面虛土的羊草根系1 g，放入盛有9 mL 已滅菌的0.85%的生理鹽水的試管中，800 r·min?1離心2 min 后靜置，上清液即為10?1的RS 稀釋液，梯度稀釋依次制備10?2、10?3、10?4和10?5的RS 稀釋液，備用。取出上一步經(jīng)過離心的根系，用無(wú)菌水沖洗2～3 次后放入盛有9 mL 已滅菌的0.85%的生理鹽水的試管中，同時(shí)加入滅菌小石子，1000 r·min?1離心10 min 后靜置，上清液即為10?1的RP 稀釋液，梯度稀釋依次制備10?2、10?3、10?4和10?5的RP 稀釋液，備用。取出上一步離心過的根系，用70%的無(wú)水乙醇浸泡30 s 后放入2%的次氯酸鈉（NaClO）中處理5 min，之后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5 次，并用無(wú)菌濾紙吸干根系表面水分，之后放于研缽中進(jìn)行研磨，用9 mL 已滅菌的0.85%的生理鹽水沖洗研缽，將研缽中的生理鹽水連同根系一同轉(zhuǎn)入離心管中，1500 r·min?1離心5 min，上清液即為10?1的HP 稀釋液，梯度稀釋依次制備10?2、10?3、10?4和10?5的HP 稀釋液，備用［16］。

分別吸取上述制備好的羊草根際4 個(gè)區(qū)域的10?3、10?4和10?5的稀釋液50 μL，分別涂布于NFM、PKO 和蒙金娜固體培養(yǎng)基上進(jìn)行固氮菌、溶解無(wú)機(jī)磷和溶解有機(jī)磷細(xì)菌的分離，根際每個(gè)區(qū)域、每個(gè)濃度梯度均做3 個(gè)平行涂布。無(wú)菌玻璃刮刀涂抹均勻后倒置于溫度為28 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，挑取NFM 培養(yǎng)基上菌落較大的單個(gè)菌落于新的NFM 上進(jìn)行平板劃線，獲得的純的單個(gè)菌落即為固氮菌。分別挑取PKO 和蒙金娜培養(yǎng)基上菌落周圍形成明顯透明圈的單個(gè)菌落于新制備的各自的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，獲得純的、菌落較大、溶磷圈明顯的即為溶磷菌。分離出的固氮菌和溶磷菌分別接種于LB 斜面培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?6］。

1.3.2 含ACC 脫氨酶的PGPR 分離 稱取羊草根系周圍（5～15 mm）的土壤樣品1 g，磨細(xì)后溶于50 mL 的PAF 液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃，200 r·min?1的搖床中暗培養(yǎng)24 h。取此時(shí)得到的PAF 培養(yǎng)液1 mL 于50 mL 已滅菌的PAF 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min?1再次暗培養(yǎng)24 h。之后取該P(yáng)AF 培養(yǎng)液1 mL 于50 mL 已滅菌的DF液體培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)24 h。之后取該DF 培養(yǎng)液1 mL 于50 mL 已滅菌的ADF 液體培養(yǎng)基中，同等條件再次培養(yǎng)24 h，此過程為含ACC 脫氨酶活性菌株的富集過程。取最后一步富集得到的ADF 培養(yǎng)液1 mL，用0.85%的生理鹽水梯度稀釋形成10?3、10?4和10?5的稀釋液，即為NRS 稀釋液。抖落羊草根系表面虛土，用鑷子將仍附著在羊草根系表面的土壤刮入滅菌三角瓶中。稱取該土壤1 g 于50 mL PAF 液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃，200 r·min?1的搖床中暗培養(yǎng)24 h。按照上述NRS 稀釋液的制備方法，進(jìn)行RS 稀釋液的制備。取上述抖落表面土壤的根系，無(wú)菌水沖洗5 次后，剪成1 cm 的小段，用石蠟油封住兩端，將該樣品放入10 mL 的PBS 緩沖液中浸泡10 min，150 r·min?1震蕩30 min，取上清液1 mL 于50 mL PAF 液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃，200 r·min?1的搖床中暗培養(yǎng)24 h。同樣按照上述NRS 稀釋液的制備方法，進(jìn)行RP 稀釋液的制備。將無(wú)菌水沖洗后的羊草根系無(wú)菌條件下用0.01%的Tween 20 處理30 s，8% NaClO 消毒5 min，無(wú)菌水沖洗后用75%酒精浸泡5 min，再次用無(wú)菌水沖洗并吸干根系表面水分，之后進(jìn)行研磨。轉(zhuǎn)移1 mL 研磨液于50 mL 的PAF 液體培養(yǎng)基，置于28 ℃，200 r·min?1的搖床中暗培養(yǎng)24 h。同樣按照上述NRS 稀釋液的制備方法，進(jìn)行HP 稀釋液的制備［14］。

分別吸取濃度為10?3、10?4和10?5的根際4 個(gè)區(qū)域的稀釋液50 μL 涂布于ADF 固體培養(yǎng)基上，根際每個(gè)區(qū)域、每個(gè)濃度梯度均3 次重復(fù)。無(wú)菌玻璃刮刀涂抹均勻后倒置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后，挑取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的單菌落進(jìn)行純化，直至獲得純的單個(gè)菌落后，挑選較大的菌株接種于TSB 斜面培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱保存。

1.4 羊草根際促生菌促生能力的測(cè)定

1.4.1 固氮能力 乙炔還原法測(cè)定1.3.1 中分離出的羊草根際固氮菌的固氮酶活性，單位為nmol C2H4·mL?1·h?1［16］。

1.4.2 溶磷能力 溶磷圈法進(jìn)行定性測(cè)定，也就是將1.3.1 中初步分離出的具有溶解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的細(xì)菌分別接種于PKO 無(wú)機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3 個(gè)重復(fù)，測(cè)定各菌株形成的溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），根據(jù)D/d 值的大小對(duì)菌株的溶磷能力進(jìn)行初步判斷。溶磷菌溶磷能力的定量測(cè)定：將D/d 值大于1.5的菌株作為初篩菌株，并對(duì)這些菌株的溶磷能力進(jìn)行定量測(cè)定。將菌株活化后，吸取500 μL 懸浮液（OD600=0.5）接種于50 mL 的PKO 液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株3 個(gè)重復(fù)，以不接菌的PKO 培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃、180 r·min?1搖床中培養(yǎng)7 d 后，取5 mL 培養(yǎng)液，用鉬藍(lán)比色法測(cè)定菌株溶解無(wú)機(jī)磷的能力。1.3.1 中蒙金娜培養(yǎng)基中分離出來(lái)的菌株溶解有機(jī)磷能力的測(cè)定方法同PKO 培養(yǎng)基中分離出的菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力的測(cè)定，但培養(yǎng)基換為蒙金娜培養(yǎng)基。

1.4.3 ACC 脫氨酶活性的測(cè)定 ACC 脫氨酶活性的測(cè)定參照Penrose 等［14］的方法。

1.4.4 分泌IAA 能力的測(cè)定 對(duì)1.4.1～1.4.3 中已測(cè)定的具有較高固氮酶活性、溶磷能力和ACC 脫氨酶活性的菌株進(jìn)行分泌IAA 能力的測(cè)定。測(cè)定方法為定性顯色法和Salkowski 定量比色法［17］。

1.5 羊草根際優(yōu)良PGPR 菌株試管接種效應(yīng)研究與鑒定

篩選出1.4 中已測(cè)定的具有優(yōu)良促生特性（即固氮酶活性較高、溶磷能力較強(qiáng)、ACC 脫氨酶活性或分泌IAA能 力 較 強(qiáng)）的 菌 株，包 括LNR24、HPS14、XMS12、XPR2、HAR7、LAH29、HPR6、HPN17、XMH1、XPR1 和HPR1，共11 株，制備PGPR 接種劑。分別接種各PGPR 菌株于50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，125 r·min?1培養(yǎng)48 h，之后用無(wú)菌水調(diào)節(jié)各菌株菌懸液濃度為1×108cfu·mL?1，接種此時(shí)得到的各菌懸液20 mL 于含有150 mL 已滅菌的LB 液體培養(yǎng)基中，相同條件再次進(jìn)行培養(yǎng)，之后再次調(diào)節(jié)其濃度為1×108cfu·mL?1，此時(shí)獲得的即為單一PGPR 菌株的接種劑［16］。

圖1 PGPR 菌株試管接種試驗(yàn)Fig.1 In vitro inoculation test of PGPR strains

挑選飽滿的羊草種子后用70%的酒精浸泡5 min，之后用2%的NaClO 處理10 min，無(wú)菌水沖洗5 次后，置于鋪有雙層濾紙、含適量蒸餾水的培養(yǎng)皿，之后在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，催芽條件為30 ℃（8 h，光照）/20 ℃（16 h，暗培養(yǎng)）［18］。當(dāng)種子萌發(fā)至3～4 cm 時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的幼苗轉(zhuǎn)接到20 mL 已滅菌的Hoagland 半固體難溶磷培養(yǎng)基的試管中，每個(gè)試管1 株幼苗，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)條件為28 ℃（16 h，光照）/20 ℃（8 h，暗培養(yǎng)），之后再次挑選出生長(zhǎng)一致的幼苗試管，分別接種各單一PGPR 菌株接種劑500 μL，以不接菌為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，培養(yǎng)周期為20 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將試管中的幼苗取出并用無(wú)菌水沖洗，立即測(cè)定羊草株高、葉片數(shù)、地上和地下部分干重（圖1）。

篩選出的11 株優(yōu)良PGPR 菌株的鑒定采用16S rRNA 基因序列比對(duì)。菌株DNA 的提取、16S rRNA 的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。將測(cè)得的16S rDNA 序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列檢索，并與已測(cè)定的細(xì)菌菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較。用MEGA 4 構(gòu)建分子進(jìn)化樹，采用Neighbor-Joining 法的Complete Deletion 模式建樹，用Bootstrap 進(jìn)行檢驗(yàn)，并重復(fù)1000 次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草根際PGPR 的篩選及分布

通過選擇性培養(yǎng)基，從3 個(gè)不同采樣點(diǎn)的羊草根際初步分離出固氮菌226 株，溶解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌112 株，溶解有機(jī)磷細(xì)菌191 株，含ACC 脫氨酶的細(xì)菌183 株。其中，HLBE 地區(qū)分離出的羊草根際固氮菌和溶磷菌的數(shù)量最多，LX 地區(qū)最少，但LX 地區(qū)分離到的羊草根際含ACC 脫氨酶的菌株最多（圖2A）。在同一取樣地下，羊草根際不同部位分離到的PGPR 的數(shù)量也不盡相同（圖2B）?？傮w而言，RS 和RP 兩個(gè)部位分離到的羊草PGPR 的數(shù)量大于NRS 和HP 兩個(gè)部位分離到的PGPR。

圖2 不同地區(qū)羊草根際PGPR 數(shù)量分布Fig.2 The distribution of PGPR in rhizosphere of L.chinensis in different areas

2.2 菌株固氮酶活性

通過乙炔還原法對(duì)初步分離出的226 株固氮菌的固氮酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，僅有20 株具有固氮酶活性，占供試菌株的9%。其中18 株來(lái)自LX 地區(qū)（菌株編號(hào)以L 開頭），剩余2 株分離于XLHT 地區(qū)（菌株編號(hào)以X 開頭），而HLBE 地區(qū)并未分離到具有固氮酶活性的固氮菌。在這20 株菌中，菌株LNR24 的固氮酶活性最高，可達(dá)（11.63±0.79）nmol C2H4·mL?1·h?1，該菌分離自LX 地區(qū)的羊草根表（圖3）。

2.3 菌株溶磷特性

圖3 羊草根際固氮菌固氮酶活性Fig.3 Nitrogenase activities of nitrogen fixing strains in the rhizosphere of L.chinensis（mean±SE，n=3）

圖4 部分無(wú)機(jī)及有機(jī)溶磷菌溶磷能力Fig.4 Qualitative determination of phosphate-solubilizing ability of some inorganic- and organic phosphorus solubilizing bacteria

表1 不同地區(qū)羊草根際不同部位溶解無(wú)機(jī)磷細(xì)菌溶磷能力Table 1 Phosphate-solubilizing ability of inorganic phosphorus solubilizing bacteria in different areas and different regions of L.chinensis rhizosphere（mean±SE，n=3）

將初步分離出的112 株溶解無(wú)機(jī)磷的細(xì)菌點(diǎn)接于PKO 培養(yǎng)基上，根據(jù)形成的溶磷圈的大小對(duì)其溶磷能力進(jìn)行定性測(cè)定（圖4）。結(jié)果表明，112 株菌中僅有26株的D/d 值大于1.5，這些菌株主要分離自XLHT 和HLBE 地區(qū)，LX 地區(qū)未分離到。菌株HPH12 的D/d值最大，而菌株XPR1 和HPS10 的最?。ū?）。對(duì)這些初步篩選出的溶解無(wú)機(jī)磷的細(xì)菌，根據(jù)其溶解Ca3（PO4）2的能力，對(duì)其溶磷能力進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果表明，菌株XPR1、HPS15 和HPR1 的溶磷能力顯著高于其他菌株，溶磷量分別為（78.37±5.35）μg·mL?1、（82.71±6.23）μg·mL?1和（80.62±1.10）μg·mL?1，而菌株HPH12 的溶磷能力最弱，溶磷量為（7.08±1.49）μg·mL?1（表1）。

同樣，對(duì)初步分離出的191 株溶解有機(jī)磷的細(xì)菌的溶磷能力進(jìn)行定性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，僅有36 株的D/d 值大于1.5，其中，LX 地區(qū)分離到1 株，XLHT 地區(qū)分離到11 株，HLBE 地區(qū)分離到24 株（圖4 和表2）。對(duì)這些初步篩選出D/d 值大于1.5 的溶解有機(jī)磷的細(xì)菌的溶磷能力進(jìn)行定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，分離自XLHT 地區(qū)的編號(hào)為XMS15 和分離自HLBE 地區(qū)的編號(hào)為HMN3 的菌株，溶解蛋黃卵磷脂的能力顯著高于其他菌株，分別為（31.19±2.05）μg·mL?1和（32.48±4.34）μg·mL?1（表2）。

表2 不同地區(qū)羊草根際不同部位溶解有機(jī)磷細(xì)菌溶磷能力Table 2 Phosphorus solubilizing ability of organic phosphorus solubilizing bacteria in different areas and different regions of L.chinensis rhizosphere（mean±SE，n=3）

2.4 菌株分泌ACC 脫氨酶的活性

對(duì)初步分離出的分泌ACC 脫氨酶活性菌株進(jìn)行酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，183 株中僅有60 株菌具有ACC 脫氨酶活性，酶活性范圍為0.04～64.31 μmol α-KA·mg?1Pr·h?1（表3）。

2.5 菌株分泌IAA 能力

挑選固氮酶活性較高、溶磷能力較強(qiáng)及ACC 脫氨酶活性較高的39 株P(guān)GPR 菌株，對(duì)其分泌IAA 能力進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，這些菌株均具有分泌IAA 的能力，顏色由粉紅色到紅褐色。進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，這39 株P(guān)GPR 的IAA 分泌量在（3.27±0.18）～（48.97±3.56）μg·mL?1。分泌量大于10 μg·mL?1的僅有10株，大部分菌株的分泌量較低。菌株LMR3 的分泌量最大，顯著高于其他菌株（表4）。

2.6 羊草根際優(yōu)良PGPR 菌株試管接種效應(yīng)

由圖5 可知，各菌株處理對(duì)羊草幼苗株高、地上和地下生物量均有不同程度的影響。與對(duì)照［CK，（22.20±0.58）cm，（0.0461±0.0069）g］相比，接種菌株HPS14 和XPR2 增加了羊草株高和地上生物量，株高分別增加了49.0%和16.8%，地上生物量分別增加了89.2%和28.9%。而接種菌株HPR6、XMH1、XPR1 和HPR1 顯著降低了羊草株高和地上生物量，株高分別降低了29.7%，64.9%，65.2%和67.3%，地上生物量分別降低了61.6%，68.0%，78.8%和76.1%。大部分菌株處理下的羊草地下生物量顯著高于對(duì)照（0.0038±0.0007）g·plant?1，其中HPS14、XPR2 和HPR1 處理下 的 羊 草 地 下生物量均較大，分 別 為（0.0129±0.0018）g·plant?1，（0.0128±0.0018）g·plant?1和（0.0162±0.0029）g·plant?1。

表3 PGPR 菌株ACC 脫氨酶活性Table 3 ACC deaminase activity of PGPR isolates（μmol α-KA·mg-1 Pr·h-1）

表4 優(yōu)良PGPR 菌株分泌IAA 能力Table 4 IAA production by PGPR isolates（mean±SE，n=3，μg·mL-1）

圖5 各菌株處理對(duì)羊草幼苗形態(tài)指標(biāo)和生物量的影響Fig.5 Effects of different treatments on morphological indexes and biomass of L.chinensis seedlings（mean±SE，n=3）

2.7 羊草根際優(yōu)良PGPR 的鑒定

對(duì)上述11 株P(guān)GPR 菌株進(jìn)行16S rRNA 鑒定發(fā)現(xiàn)，菌株LNR24、XMH1 和XPR1 為同一菌株（半透明黃單胞菌，Xanthomonas translucens，AB680445），與Xanthomonassp.具有很高的同源性（99%），屬于黃單胞菌屬。菌株LAH29（埃里米黃桿菌，Chryseobacterium elymi，NR115851）為金黃桿菌屬。菌株XMS12（伊夫弧菌，Phyllobacterium ifriqiyense，KJ734886）、XPR2（柔毛桿菌，Phyllobacterium loti，NR133818）、HPR6（桃金娘支桿菌Phyllobacterium myrsinacearum，AY512821）和HPN17（HQ380017）與Phyllobacteriumsp.具有很高的同源性，為葉桿菌屬。菌株HPS14 屬于Inquilinus ginsengisoli（GU201848）。菌株HPR1（泛菌，Pantoea conspicua，HF562884）為泛菌屬。菌株HAR7（產(chǎn)氣腸桿菌，Enterobacter aerogenes，KU500561）為腸桿菌屬。

3 討論

研究表明，PGPR 的數(shù)量分布不僅與植物種類及同一物種的不同品種有關(guān)，還受植物所處的環(huán)境條件的影響［11］。因此，從不同環(huán)境條件下分離和篩選PGPR 菌株是獲得高效功能菌株的基礎(chǔ)。本研究從LX、XLHT 和HLBE 3 個(gè)地區(qū)分離到的具有不同促生特性的PGPR 菌株的數(shù)量不同，說明羊草根際PGPR 菌株的分布受到了不同地區(qū)氣候條件、土壤等因素影響。此外，本研究發(fā)現(xiàn)距離根系越近的部位分離到的PGPR 的數(shù)量越多，如從羊草根表土壤（RS）與根系表面（RP）兩個(gè)部位分離到的PGPR 的數(shù)量高于從遠(yuǎn)根土壤（NRS）和根內(nèi)（HP）分離到的，引起這種現(xiàn)象的原因可能是可溶性化合物沿根的分布距離不同，使得根際微生物數(shù)量不同，進(jìn)而表現(xiàn)出了根際效應(yīng)［19］。

對(duì)初步分離出的菌株進(jìn)行促生特性的研究發(fā)現(xiàn)，226 株固氮菌中僅有20 株表現(xiàn)出了固氮酶活性，活性范圍為（8.71±0.01）～（11.63±0.79）nmol C2H4·mL?1·h?1。同樣，112 株溶解無(wú)機(jī)磷和191 株溶解有機(jī)磷細(xì)菌中D/d值大于1.5 的也僅有26 和36 株，溶磷量范圍分別為（7.08±1.49）～（82.71±6.23）μg·mL?1和（1.56±0.18）～（32.48±4.34）μg·mL?1。而183 株含ACC 脫氨酶的菌株中僅有60 株菌具有ACC 脫氨酶活性。這些研究結(jié)果表明羊草根際雖然存在著大量的PGPR 資源，但真正具有開發(fā)潛力的、促生特性較好的、可以用于后續(xù)菌劑研發(fā)的優(yōu)良PGPR 菌株非常少。與以往研究相比，本研究篩選出的羊草根際固氮菌的固氮酶活性與溶磷菌的溶磷量較低，如胡春錦等［20］采用Ashby 培養(yǎng)基從甘蔗（Saccharum officinarum）根際土壤和根樣品中分離出的36 株固氮菌中，酶活性最高的可達(dá)1143.39 nmol C2H4·mL?1·h?1，李顯剛等［21］采用PKO 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基從百脈根（Lotus corniculatus）根際分離出的11 株溶磷菌的溶磷量在94.35～400.49 μg·mL?1?？赡艿脑蚴欠蛛x固氮菌所選用的培養(yǎng)基及分離PGPR 的植物種類不同。含ACC 脫氨酶的PGPR 菌株可以將逆境條件下植物體內(nèi)產(chǎn)生的過量乙烯轉(zhuǎn)化為氨和α-酮丁酸，降低或避免了過量乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，并在一定程度上為植物生長(zhǎng)提供氮而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育［5］。Penrose 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)菌株的ACC 脫氨酶活性≥20 nmol α-KA·mg?1Pr·h?1時(shí)，才可以在以ACC 為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并作為一類PGPR。本研究篩選出的60 株P(guān)GPR 菌株的ACC 脫氨酶活性均大于20 nmol α-KA·mg?1Pr·h?1，酶活性范圍為0.04～64.31 μmol α-KA·mg?1Pr·h?1。秦寶軍等［22］從小麥（Triticum aestivum）根際分離出的9 株具有ACC 脫氨酶活性的菌株，酶活性最大為9.32 μmol α-KA·mg?1Pr·h?1。Bal 等［23］從水稻（Oryza sativa）根際篩選出的17 株ACC 脫氨酶活性的PGPR 菌株酶活性最大的僅為2.66 μmol α-KA·mg?1Pr·h?1。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究從羊草根際篩選出的具有ACC 脫氨酶活性的PGPR 菌株的酶活性相對(duì)較高，該結(jié)果說明，相較于固氮菌和溶磷菌，羊草根際含ACC 脫氨酶的PGPR 菌種資源的挖掘及促生特性的研究是值得研究的重點(diǎn)。

PGPR 的分離與篩選是許多微生物學(xué)者研究的熱點(diǎn)，在該過程中，微生物的鑒定也是必不可少的一步，但目前僅有少部分的種類得到鑒定，如類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、伯克霍爾德式菌屬（Burkholderia）、產(chǎn)檢桿菌屬（Advenella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等［24］。本研究通過16S rRNA 對(duì)篩選出的11 株P(guān)GPR 菌株進(jìn)行分子鑒定發(fā)現(xiàn)菌株LNR24、XMH1 和XPR1 是同一菌株（Xanthomonas translucens，AB680445），為黃單胞菌屬（Xanthomonassp.），該菌株同時(shí)具有固氮、溶解無(wú)機(jī)磷、溶解有機(jī)磷和分泌IAA 的特性。試管促生試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株顯著降低了羊草株高和地上生物量，但促進(jìn)了地下生物量的增加。程美霞等［25］發(fā)現(xiàn)1 株分離自水稻的黃單胞菌屬（Xanthomonassp.）在水稻幼根穩(wěn)定吸附、定植中發(fā)揮促生作用，本研究結(jié)果與此一致。但Gardiner 等［26］研究發(fā)現(xiàn)Xanthomonas translucens會(huì)導(dǎo)致小麥患細(xì)菌性條紋病。該結(jié)果說明菌株的促生特性會(huì)因植物種類的不同而不同。本研究篩選出兩株能夠同時(shí)促進(jìn)羊草株高、地上和地下生物量增加的菌株（HPS14 和XPR2），這兩株菌可能通過溶解無(wú)機(jī)磷及分泌IAA 而促進(jìn)羊草生長(zhǎng)，經(jīng)16S rRNA 基因序列比對(duì)鑒定分別屬于葉桿菌屬（Phyllobacterium loti）和Inquilinus ginsengisoli。Liu 等［27］通過對(duì)受重金屬污染的紫花苜蓿（Medicago sativa）接種Phyllobacteriumsp.發(fā)現(xiàn)，與未接菌相比，接菌的紫花苜蓿的生物量顯著增加了15.9%～20.2%，同時(shí)土壤微生物活性和微生物群落對(duì)土壤碳的利用能力也顯著提高，本研究結(jié)果與此一致。這說明本研究篩選出的這兩株菌可以作為優(yōu)良的PGPR 接種劑加以應(yīng)用。

4 結(jié)論

通過選擇性培養(yǎng)基，本研究從黑龍江蘭西、內(nèi)蒙古錫林浩特和呼倫貝爾3 個(gè)地區(qū)共篩選出20 株具有固氮酶活性的固氮菌株，固氮酶活性范圍為8.71～11.63 nmol C2H4·mL?1·h?1。篩選出26 株D/d 值大于1.5 的溶解無(wú)機(jī)磷的PGPR，通過鉬藍(lán)比色法測(cè)定其溶磷量為7.08～82.71 μg·mL?1。篩選出36 株D/d 大于1.5 的溶解有機(jī)磷PGPR，鉬藍(lán)比色法測(cè)定其溶磷量為1.56～32.48 μg·mL?1。篩選出60 株菌具有ACC 脫氨酶活性的PGPR 菌株，酶活性為0.04～64.31 μmol α-KA·mg?1Pr·h?1。通過試管接種試驗(yàn)，本研究共篩選出兩株（HPS14 和XPR2）可以促進(jìn)羊草株高、地上和地下生物量增加的菌株，經(jīng)16S rRNA 鑒定，這兩株菌分別屬于Inquilinus ginsengisoli和Phyllobacterium loti，可以用于后續(xù)PGPR 微生物肥料的研制和相關(guān)研究。