鰍科魚類DNA條形碼鑒定及系統(tǒng)進化研究

劉紅艷 ，蔡 金，謝仲桂，熊 飛*，王 瑩，王 沁，喻記新，翟東東，夏 明，陳元元

（1.江漢大學生命科學學院，湖北武漢 430056；2.湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術研究中心，湖北武漢 430056；3.持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室，湖北武漢 430056；4.湖南生物機電職業(yè)技術學院，湖南長沙 410127）

【研究意義】鰍科（Cobitidae）魚類為鯉形目中一個較大的類群，種類多、形態(tài)差異大，分布廣泛，分類關系較為復雜[1-4]。一直以來，鰍科魚類主要以可數(shù)性狀和可量性狀等形態(tài)特征以及一些內部特征為依據(jù)進行分類鑒定?！厩叭搜芯窟M展】陳景星[5]通過頰部鱗片有無和眼下刺是否分叉等特征對沙鰍亞科魚類進行分類。趙鐵橋[6]通過鰾、腸、脊椎骨等特征對條鰍屬魚類的分類關系進行了探討。Kottelat[7]基于骨骼學特征對鰍科進行了系統(tǒng)性的整理，將鰍科分為3個主要的類群。然而傳統(tǒng)的魚類分類需要對大量標本的可量和可數(shù)性狀進行統(tǒng)計和測量，但是由于個體差異、性別差異和地理環(huán)境差異等因素的影響，在形態(tài)分類鑒定時容易造成相似種的混淆[8-9]。在實際操作中，也往往會遇到標本量較少以及樣本保存不完整等問題，給傳統(tǒng)的物種分類和鑒定研究帶來較大的困難。因而，單一的形態(tài)學鑒定已經(jīng)無法滿足魚類物種鑒定的需求，選擇一種更為有效、便捷的魚類鑒定方法，并將其用于物種鑒定、分類和進化研究是非常必要的。DNA 條形碼是指生物體內能夠代表該物種的、有足夠變異的、標準的、易擴增并且相對較短的DNA片段，可以快速、準確的進行物種鑒定[10]。DNA條形碼自2003年由Hebert等[11]提出后就得到了飛速發(fā)展。線粒體DNA 的COI基因具有長度適中、進化速率適中，引物通用性好和易于擴增的特點，已經(jīng)成為了對物種進行快速而準確鑒定的一個標準分子標簽[12]。目前，基于COI基因的DNA 條形碼技術在魚類的分類鑒定及系統(tǒng)進化中得到了廣泛的應用[13]，如對銀鯧進行物種識別[14]和對石首魚科魚類系統(tǒng)分類地位的探討[15]。

【本研究切入點】鰍科是魚類系統(tǒng)中的一個重要分類單元，近年來，一些研究者以線粒體Cytb基因片段和控制區(qū)以及ND4 和ND5 基因分析了部分鰍科魚類的系統(tǒng)分類關系[16-17]，但一些鰍科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關系仍未得到一致結論。Li等[18]用線粒體的COI基因條形碼對高原鰍屬魚類進行鑒定，但涉及鰍科的種類較少，僅包含高原鰍屬魚類。在鰍科魚類中，利用線粒體COI基因作為DNA 條形碼對鰍科魚類進行分類鑒定的研究還比較匱乏?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過對鰍科魚類3亞科18屬61種魚類線粒體COI基因的序列進行分析，分析基于COI基因的DNA 條形碼在鰍科魚類中作為物種鑒定的有效性，探討其系統(tǒng)進化關系，以期為鰍科魚類的物種鑒定和系統(tǒng)分類提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 研究材料

2016—2018年長江上游江段采集了紅尾副鰍、橫紋南鰍、長薄鰍、小眼薄鰍、紅唇薄鰍、中華沙鰍6種鰍科魚類樣本126尾。每個樣品取其肌肉組織保存于體積分數(shù)為95%乙醇中用于DNA條形碼分析。物種形態(tài)學鑒定主要依據(jù)《中國淡水魚類檢索》[19]、《四川魚類志》[20]和《云南魚類志》[21]。另外，從GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載了55種鰍科魚類的COI基因序列232條?？偣舶琐q科魚類的3亞科18屬61種，共358尾魚類標本（表1）。

表1 研究所用樣本名錄及相關信息Tab.1 The samples used in the study and related information

續(xù)表1

1.2 DNA提取、PCR擴增和序列測定

基因組DNA 采用GENEray 細胞/組織基因組試劑盒法提取，獲得的DNA 用TE 緩沖液溶解保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增引物采用魚類COI序列通用引物FishF1/FishR1。

FishF1：5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'

FishR1：5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'

PCR反應體系為50μL：上下游引物各為1.0μL（濃度為10μmol/L），基因組DNA模板總量約為20 ng，2×PCRmixture溶液25.0μL，其余補足滅菌蒸餾水。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，接著進行35個循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，最后再72 ℃延伸10 min，反應在PTC100型PCR 儀上進行。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定PCR 產(chǎn)物為目的條帶后，送至武漢擎科生物技術有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DNAstar8.0 軟件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA）中的SeqMan 程序查看測序波峰圖，手工去除序列兩端峰型不規(guī)則的部分，保留峰型規(guī)則的序列，然后將兩條單向序列拼接成一條雙向序列。使用MEGA7.0 軟件[22]中的Muscle 程序對所有的序列進行同源比對，進行序列的編輯剪切，得到COI基因538 bp 的同源序列矩陣用于隨后的遺傳分析。利用MEGA7.0 軟件統(tǒng)計變異位點、堿基組成情況，基于Kimura2-parameter 雙參數(shù)模型對種內、種間，屬內、屬間和亞科內、亞科間的遺傳距離進行計算。利用網(wǎng)絡版ABGD 軟件[23]確定物種的可操作單元，參數(shù)采取默認設置，距離矩陣模型選取K2P 模型，計算物種的OTUs 數(shù)。利用RAxMLv8.1.17 軟件[24]依據(jù)GTR+I+G 模型構建貝葉斯（Bayesian）系統(tǒng)進化樹，運行2 000 000 代重復。

2 結果

2.1 COI序列信息

本研究獲取鰍科魚類358 條序列，同源比對后538 bp 的線粒體COI基因序列用于條形碼分析，包含鰍科魚類3 亞科，18 屬，61 個物種，所有序列都沒有發(fā)現(xiàn)缺失、插入。A、T、C、G 平均堿基組成分別為A23.5%、T30.9%、C28.2%、G17.4%，平均堿基含量A+T（54.4%）高于C+G（45.6%），顯示明顯的堿基組成偏倚性，與其他硬骨魚類線粒體COI基因堿基組成基本一致[25]。在538 pb 序列位點中，有457 個不變位點和81個變異位點，變異位點中有52個轉換位點，29個顛換位點，轉換與顛換比（R）為1.79。

2.2 遺傳距離分析

基于K2P 計算鰍科物種之間的遺傳距離關系，種內、屬內和亞科內的平均遺傳距離分別為0.010、0.054 和0.163，隨著分類階元的升高，遺傳距離增大。亞科內的遺傳距離為0.107～0.158，條鰍亞科內的遺傳距離最小，花鰍亞科內的遺傳距離最大。亞科間的遺傳距離相差不大，為0.175～0.182。條鰍亞科與沙鰍亞科遺傳距離相對較小，花鰍亞科與沙鰍亞科遺傳距離相對較大（表2）。

表2 鰍科魚類的亞科內遺傳距離和亞科間遺傳距離Tab.2 Genetic distance within subfamily and between subfamily of Cobitidae fishes

鰍科屬內和屬間遺傳距離如表3，其中7個屬只有1個物種，不計算屬內遺傳距離，其余11個屬的屬內遺傳距離為0.013～0.112，平均值為0.054。其中中華沙鰍屬屬內遺傳距離最?。?.013），似鱗頭鰍屬屬內遺傳距離最大（0.112）。屬間遺傳距離為0.092～0.210，其中副沙鰍屬與薄鰍屬遺傳距離最?。?.092），須鰍屬與馬頭鰍屬（0.210）、瘦身鰍屬與沙鰍屬（0.210）遺傳距離最大。

表3 鰍科魚類屬內遺傳距離和屬間遺傳距離Tab.3 Genetic distance within genera and between genera of Cobitidae fishes

7 個物種只有1 個個體，不計算種內遺傳距離，其余54 種鰍科魚類種內遺傳距離為0～0.130，平均值為0.010。除北方須鰍（0.022）、馬頭小刺眼鰍（0.026）、溫泉似鱗頭鰍（0.030）、泥鰍（0.031）、赫氏似鱗頭鰍（0.032）、中華花鰍（0.090）、岡特似鱗頭鰍（0.095）和瘤鰍（0.130）8 個物種的種內遺傳距離大于0.02 外，其余46 個物種的種內遺傳距離明顯小于Hebert 等[11]提出的種內遺傳距離小于0.02 的標準，其中有18 個物種的種內遺傳距離為0。種間遺傳距離為0.001～0.219，平均值為0.162，種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的16.2 倍，種間平均遺傳距離大于種內平均遺傳距離的10 倍以上。軟口高原鰍與黑背高原鰍的種間遺傳距離最小，為0.001，北方須鰍與岡特似鱗頭鰍種間遺傳距離最大，為0.219。有7 組魚類種間遺傳距離小于0.02，它們是：軟口高原鰍與黑背高原鰍（0.001）、小眼薄鰍與紅唇薄鰍（0.002）、麻爾柯河高原鰍與硬刺高原鰍（0.002）、天臺薄鰍與小眼薄鰍（0.002）、天臺薄鰍與紅唇薄鰍（0.002）、寬體沙鰍與中華沙鰍（0.004）、麻爾柯河高原鰍與貝氏高原鰍（0.009）。除軟口高原鰍與黑背高原鰍的種間遺傳距離（0.001）小于軟口高原鰍種內遺傳距離（0.003）外，其余53 種鰍科魚類的種內遺傳距離均小于其種間遺傳距離。鰍科魚類遺傳距離在種內、種間重疊較少，能形成一定的DNA 條形碼間隙（圖1）。

圖1 種內和種間遺傳距離直方圖Fig.1 Histogram of genetic distance within species and between species

2.3 分子系統(tǒng)樹及OTUs分析

基于GTR+I+G 模型構建的Bayesian 系統(tǒng)進化樹如圖2，以鯉科的草魚（Ctenopharyngodon idellus）和青魚（Mylopharyngodon piceus）作為外群時，整個鰍科魚類形成一個單系。在物種水平上，有6 組魚類彼此的個體相互混雜，不能按各自的物種聚類，它們分別是：中華沙鰍與寬體沙鰍、小眼薄鰍與紅唇薄鰍和天臺薄鰍、硬刺高原鰍與麻爾柯高原鰍、軟口高原鰍與黑背高原鰍、花鰍與長鰍、岡特似鱗頭鰍與溫泉鱗頭鰍。有4種魚類分成明顯的兩支，它們是花鰍、岡特似鱗頭鰍、泥鰍、瘤鰍。其余46種鰍科魚類均能按照各自的形態(tài)學分類分別聚成單支。在屬的水平上，泥鰍屬的泥鰍與花鰍屬魚類聚在一起，瘦身鰍屬的瘦身鰍和花鰍屬的瘤鰍與似鱗頭鰍屬魚類聚在一起，南鰍屬的2個物種分別與副鰍屬和須鰍屬魚類聚在一起，其它屬的鰍科魚類均能按各自的屬進行聚類。在亞科的水平上，沙鰍亞科的魚類聚成一大支，條鰍亞科的全部種類與花鰍亞科的白吻鰍、泥鰍及花鰍屬（除瘤鰍外）魚類聚成第二大支，花鰍亞科的小刺眼鰍屬、馬頭鰍屬、瘦身鰍屬、柯氏鰍屬、似鱗頭鰍屬與花鰍屬的瘤鰍聚成第三大支。值得注意的是，有2個瘤鰍個體處于整個鰍科魚類聚類的根部位置。

ABGD 分析結果顯示（圖3），當先驗種內遺傳距離在0.001 0～0.035 9 時，劃分了66 個操作分類單元（OTUs）），多于形態(tài)學分類的物種。北方須鰍、花鰍、中華花鰍、泥鰍、岡特似鱗頭鰍、瘤鰍分為2 個OTUs，馬頭小刺眼鰍、赫氏似鱗頭鰍分為了3 個OTUs。OTUs 的劃分大體與距離法一致，被分為多個OTUs的物種，其種內遺傳距離大多大于0.02的分類標準。

圖2 COI基因基于GTR+I+G模型構建的鰍科魚類Bayesian系統(tǒng)樹Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of Cobitidae based on COI gene using GTR+I+G model

圖3 ABGD劃分的鰍科魚類操作分類單元Fig.3 Operational taxonomic units of Cobitidae defined by ABGD analysis

3 討論

在DNA 序列分析中，不同物種的種內和種間遺傳距離大小是物種鑒定的一個重要判別標準。Hellberg 等[26]利用線粒體COI基因作為條形碼對動物物種鑒別時，認為種內的遺傳距離不大于0.02，且種間的遺傳距離大于種內距離10 倍以上可有效判別物種。本研究中，種內平均遺傳距離為0.010，種間平均遺傳距離為0.162，種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的16.2 倍，說明COI基因序列的遺傳差異為鑒定鰍科魚類提供了良好的基礎。本研究中，除軟口高原鰍與黑背高原鰍的種間遺傳距離小于軟口高原鰍種內遺傳距離外，其余鰍科魚類的種內遺傳距離均小于其種間遺傳距離，形成了一定的條形碼間隙。

本研究中，鰍科魚類的種內平均遺傳距離（0.010）稍高于已報道的幾種魚類的條形碼遺傳距離，如大西洋鄰加拿大水域的海水魚類[27]、長江中游的鯉科魚類[28]。較高的平均種內遺傳距離主要是由于北方須鰍、馬頭小刺眼鰍、溫泉似鱗頭鰍、泥鰍、赫氏似鱗頭鰍、中華花鰍、岡特似鱗頭鰍、瘤鰍等魚類中較高的種內遺傳距離導致的。同一物種出現(xiàn)較高水平的種內遺傳距離可能是由于原始物種錯誤鑒定，也有可能是由于不同隱存的或是沒有被發(fā)現(xiàn)的成種事件造成的[29]。目前，已有不少分子數(shù)據(jù)證明魚類存在數(shù)量巨大的隱存種[30-31]。如唐瓊英[32]認為形態(tài)特征上比較相似的一些花鰍物種均被劃分到中華花鰍這一物種中，中華花鰍可能是包含很多種類的一個復合類群。由于隱存種形態(tài)十分相似，根據(jù)外形特征不能把它們區(qū)分開，但在分子水平上表現(xiàn)出差異性，因此條形碼相對于傳統(tǒng)生物鑒定的優(yōu)勢在于可以揭示隱存種的存在。本研究中，北方須鰍、花鰍、中華花鰍、泥鰍、岡特似鱗頭鰍、瘤鰍分為2 個OTUs，馬頭小刺眼鰍、赫氏似鱗頭鰍分為了3個OTUs。另外，聚類分析中，花鰍、岡特似鱗頭鰍、泥鰍、瘤鰍在聚類上已經(jīng)形成了兩個明顯的分支。這些結果顯示，可能有隱存種的存在。另外，值得注意的是，有2個瘤鰍個體處于整個鰍科魚類的根部位置，與另外2個正常聚類到花鰍亞科的瘤鰍個體的遺傳距離差異相當大，但是這4 個個體均來源于同一地理位置，因此，筆者推測處于鰍科根部位置的2 個瘤鰍個體可能是原始種的錯誤鑒定造成的。

一般認為，鰍科中的沙鰍亞科是分類關系相對明確的一個類群，而條鰍亞科和花鰍亞科種類繁多，分類關系復雜。先前的學者支持沙鰍亞科為一個單系類群，但關于條鰍亞科和花鰍亞科單系性的問題爭議則較大[17,32-34]。本研究中，沙鰍亞科的所有個體分別按各自的屬聚類，然后各屬聚為一大支，研究結果也支持沙鰍亞科為一單系類群，并且各屬之間關系明確。唐瓊英[32]認為條鰍亞科包含大量形態(tài)上極為相似的物種，支持該亞科為一單系類群，但Nalbant[33]認為條鰍亞科為多系起源。本研究結果中，花鰍亞科的一些物種與條鰍亞科的物種聚在一起，因此，條鰍亞科并不能形成單系。Liu 等[35]認為花鰍亞科物種的多樣性最為豐富也最為復雜，認為花鰍亞科分為兩支，一支由花鰍屬、后鰭花鰍屬、副泥鰍屬和泥鰍屬構成，另一支由小刺眼鰍屬、瘦身鰍屬和潘鰍屬構成，不能形成單系。本研究中花鰍亞科的一些種類雖然與Liu 等[35]研究的種類有些差異，但本研究結果與Liu 等的觀點大體相同，花鰍亞科分為兩支，支持花鰍為多系起源。

在鰍科中，Hora[36]將沙鰍屬從薄鰍屬和副沙鰍屬中分離出來成為一個獨立的屬，F(xiàn)ang[37]又將沙鰍屬分為沙鰍亞屬（botia）、中華沙鰍亞屬（Sinibotia）和鰾膜沙鰍亞屬（Hymenophysa）。后來的一些學者在分類的時候并沒有把這3個屬進行細分，而是統(tǒng)一把它們歸為沙鰍屬[20,32,35]。本研究的材料中，只包含有沙鰍亞屬和中華沙鰍亞屬的種類，但在聚類關系中，這2個亞屬的物種分別聚類，各自形成單系，與沙鰍亞科其它屬的物種形成平行分支，并且這2 個屬的遺傳距離較遠，本研究結果支持把這2 個亞屬上升到屬的地位，分別為沙鰍屬和中華沙鰍屬。Bananescu等[38]認為南鰍屬包含了形態(tài)上差異極大的幾個類群，是較為復雜的一個多系起源類群。本研究中包括了南鰍屬的2 個物種，2 個南鰍屬魚類并沒有聚在一起，橫紋南鰍與副鰍屬魚類聚成在一起，密紋南鰍與須鰍屬魚類聚在一起，因此南鰍屬物種分類關系還需要明確。陳景星等[1]指出花鰍屬是分化最為明顯的一個屬。本研究中，花鰍屬物種的聚類比較分散，花鰍屬魚類并沒有聚在一起，而是分別與花鰍亞科的其它屬物種聚在一起，這表明了花鰍屬的分類還存在較大的問題，對其物種的歸屬問題還需進一步的整理和細化。

DNA條形碼最重要的作用就是對物種進行準確鑒別，彌補傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法的不足，明確魚類的種類和系統(tǒng)進化過程[39]。在本研究中，綜合遺傳距離、聚類分析和OTUs的結果，61種鰍科魚類中有46個物種能利用COI條形碼進行有效的鑒別，占總物種數(shù)的75.41%，另外，COI條形碼在鰍科的屬及亞科分類上也有一定的參考價值，能夠明確大多數(shù)屬和亞科物種的分類歸屬問題。