江西省5個(gè)規(guī)?；i場健康豬群中豬鏈球菌的流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性研究

譚美芳，譚 佳，曾艷兵，楊 群，李海琴

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西南昌 330200）

【研究意義】近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，現(xiàn)代豬場逐漸趨于集約化，養(yǎng)殖密度不斷擴(kuò)大，豬的疫病特別是細(xì)菌性疫病的發(fā)生也逐漸頻繁，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了巨大危害，因此控制和消滅規(guī)?；i場的常見細(xì)菌性疫病已成為當(dāng)前能否促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[1-2]。豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是定植于豬上呼吸道的一種具有莢膜的革蘭氏陽性球菌，主要引起豬的腦膜炎、全身性敗血癥、胸膜肺炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等，部分血清型的菌株可引起多發(fā)性漿膜炎、流產(chǎn)和局部膿腫，在世界范圍內(nèi)流行，病發(fā)率和病死率均居高不下，是當(dāng)前嚴(yán)重困擾我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的常見傳染性細(xì)菌病之一[3]。因此，檢測臨床健康豬群豬鏈球菌的攜帶情況以及病原菌對(duì)抗生素的耐藥情況，對(duì)于更好地監(jiān)控豬鏈球菌耐藥性、防治豬鏈球菌病以及有效防控豬鏈球菌的暴發(fā)具有重要意義。

【前人研究進(jìn)展】表觀健康豬的鼻腔、扁桃體等是豬鏈球菌自然感染部位，不同日齡階段的豬對(duì)其均有易感性，其中新生仔豬、哺乳仔豬的發(fā)病率和致死率最高[4]。根據(jù)莢膜抗原成分，可將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型（1～34、1/2），其中1、2、7 和9 型是豬的常見致病菌，而2 型豬鏈球菌被認(rèn)為是分布最廣、致病性最強(qiáng)的一種血清型，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)人類的生命安全構(gòu)成威脅[5]。目前，生豬產(chǎn)業(yè)主要通過滅活苗和抗生素來預(yù)防和控制豬鏈球菌的感染，但單價(jià)疫苗免疫不能對(duì)多種血清型產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，所以通過抗生素治療細(xì)菌感染仍是一種常見的手段。養(yǎng)殖戶通過在飼料中長期添加抗生素藥物或者直接肌肉注射來預(yù)防和處理未發(fā)病或已發(fā)病的豬群[6]。近年來，由于抗生素的濫用，特別是在動(dòng)物飼料中添加抗生素及在疾病治療過程中不合理用藥，很容易造成細(xì)菌敏感性降低，產(chǎn)生耐藥菌株，增加細(xì)菌病的治療難度，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展[7]?？偨Y(jié)2000年以來的豬鏈球菌耐藥的報(bào)道，目前我國豬鏈球菌對(duì)氧氟沙星、阿莫西林、多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物、萬古霉素、林可霉素、紅霉素、大觀霉素等均表現(xiàn)差異耐藥性[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】豬鏈球菌在江西省規(guī)?；i場中的流行和耐藥情況尚不清楚。而且，當(dāng)前對(duì)豬鏈球菌耐藥性的報(bào)道主要是針對(duì)發(fā)病豬群，對(duì)臨床上表觀健康豬群中攜帶的豬鏈球菌的耐藥性問題缺乏調(diào)查研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選定江西省部分大型規(guī)模化豬場，調(diào)查臨床表觀健康豬群的豬鏈球菌流行率，對(duì)分離株進(jìn)行耐藥性測定，旨在掌握該菌在省內(nèi)的流行現(xiàn)狀，為養(yǎng)殖場合理用藥提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持，以期科學(xué)有效地防控豬鏈球菌病在豬場中的蔓延和流行，降低養(yǎng)殖成本，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)效益最大化，同時(shí)從源頭上減少耐藥菌株的產(chǎn)生，降低耐藥菌株傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 健康豬群鼻拭子 樣本來自2017—2019年江西省遂川縣、南昌縣、萍鄉(xiāng)市和泰和縣4個(gè)市縣的5個(gè)規(guī)?；i場。在臨床健康的保育豬群中隨機(jī)挑選豬只總計(jì)314 頭，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精棉擦拭豬鼻表面后，用無菌棉簽采集鼻液拭子總計(jì)314份。將鼻拭子保存在生理鹽水中，4 ℃冷藏運(yùn)輸和保存。

1.1.2 參考菌株 本研究所用的陽性參考菌株為豬鏈球菌2型四川分離株SC19，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)分離，本實(shí)驗(yàn)保存。根據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CSLI）推薦，藥敏實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538，購自上海奧陸生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

PremixTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA marker 購自大連Takara 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、哥倫比亞CNA 瓊脂基礎(chǔ)、5%脫纖維綿羊血購自青島海博生物技術(shù)有限公司；新生牛血清（無噬菌體低內(nèi)毒素）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和革蘭氏陽性球菌藥敏試紙盒購自杭州濱和微生物試劑有限公司。引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及初步鑒定

用無菌接種環(huán)蘸取鼻拭子液，劃線接種至含5%脫纖維綿羊血的CNA 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。選取具有溶血環(huán)、半透明、邊緣整齊的針尖狀小菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察形態(tài)。若鏡檢結(jié)果為散在的或短鏈狀的革蘭氏陽性球菌，則為可疑菌落，接種到新鮮的CNA血平板上繼續(xù)劃線純培養(yǎng)。細(xì)菌經(jīng)過純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定，用微量生化反應(yīng)管進(jìn)行糖發(fā)酵和其他生化實(shí)驗(yàn)，觀察結(jié)果。選取部分疑似菌株，由武漢塞維爾生物科技有限公司通過掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 豬鏈球菌的PCR鑒定

用煮沸法制備細(xì)菌基因組DNA。鑒定豬鏈球菌16S rDNA 的引物、鑒定豬鏈球菌2 型cps2J基因的引物見表1。反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Taqmixture 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 6μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，共28 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳。在所有的PCR 反應(yīng)中，SC19 的基因組用作陽性對(duì)照，ddH2O 作為陰性對(duì)照。

表1 本實(shí)驗(yàn)所涉及的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Baner（KB）紙片擴(kuò)散法檢測豬鏈球菌的藥敏情況：將細(xì)菌接種至含5%新生牛血清的TSA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；用無菌棉簽蘸取3～5個(gè)單菌落，于1 mL生理鹽水中稀釋，將菌液濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?；另取無菌棉簽浸潤菌懸液，均勻涂布到新鮮TSA培養(yǎng)基表面；待平板室溫干燥5 min，用鑷子取藥敏片貼在瓊脂表面；貼好藥敏片后15 min內(nèi)，將平板在37 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)后取出平板，量取抑菌圈直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼看不見細(xì)菌為限，判讀結(jié)果，以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 豬鏈球菌形態(tài)觀察

細(xì)菌在含新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上生長良好，形成透明、濕潤、圓滑、邊緣整齊的小菌落，具有淡藍(lán)色熒光。在含5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h，呈均勻渾濁。在CNA血平板上呈現(xiàn)α溶血。革蘭氏染色結(jié)果顯示，豬鏈球菌在固體培養(yǎng)基上以單在和雙球菌為主，部分呈短鏈狀態(tài)（圖1a），在液體培養(yǎng)基中則以長鏈形態(tài)為主。通過掃描電鏡（50 000×）能觀察到卵圓形的細(xì)菌形態(tài)（圖1b）。

圖1 豬鏈球菌形態(tài)（標(biāo)尺：0.5μm）Fig.1 Morphology of S.suis

2.2 細(xì)菌的生化鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床分離的豬鏈球菌菌株對(duì)葡萄糖、核糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、乳糖、棉籽糖、阿拉伯糖、七葉苷、精氨酸、MR和VP的生化反應(yīng)結(jié)果差異很大，對(duì)糖的發(fā)酵不活潑，無規(guī)律不穩(wěn)定，難以作為分類依據(jù)。

2.3 豬鏈球菌PCR鑒定

本研究共采集到314 份表觀健康豬群的鼻拭子樣本。通過對(duì)豬鏈球菌特異性基因（16S rDNA）的PCR 鑒定，共計(jì)有112 株疑似菌株擴(kuò)增到了294 bp 的目的基因片段（圖2），證實(shí)為豬鏈球菌，檢出率35.67%。對(duì)這112株豬鏈球菌再次進(jìn)行PCR 鑒定，目的基因是豬鏈球菌2型特異性基因cps2J，目的片段大小為500 bp（圖3）。此次研究未檢測到豬鏈球菌2型菌株，檢出率為0%。

圖2 豬鏈球菌16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of S.suis 16S rDNA

圖3 豬鏈球菌2型的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of S.suis type 2

2.4 豬鏈球菌流行病學(xué)分析

本次調(diào)查中，表觀健康豬群中的豬鏈球菌總檢出率為35.67%，各個(gè)規(guī)?；i場的檢出率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）（表2）。其中，南昌的規(guī)模豬場檢出率為62.86%，顯著高于其他地區(qū)（P＜0.001），萍鄉(xiāng)和泰和的3家規(guī)模豬場的細(xì)菌檢出率無明顯差異（P＞0.05）。不同地區(qū)的豬鏈球菌的檢出率結(jié)果見表2。

2.5 耐藥性監(jiān)測

用苯唑西林、青霉素G、紅霉素、大觀霉素、克拉霉素、萬古霉素、克林霉素、氯霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、多粘菌素B、復(fù)方新諾明和呋喃妥因等16 種抗生素對(duì)分離鑒定出的豬鏈球菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 2017—2019年江西省規(guī)?；i場中SS流行情況Tab.2 The prevalence of SS in large-scale pig farms in Jiangxi Province from 2017 to 2019

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，112株豬鏈球菌對(duì)數(shù)種抗生素的耐藥情況嚴(yán)重，有96.43%的菌株對(duì)克林霉素耐藥，91.96%的菌株對(duì)四環(huán)素耐藥。其次耐藥情況比較嚴(yán)重的是：克拉霉素耐藥率66.96%、紅霉素耐藥率66.07%、大觀霉素耐藥率53.57%。對(duì)于其他抗生素，豬鏈球菌菌株表現(xiàn)出高度或者中度敏感性，如對(duì)萬古霉素的敏感率可達(dá)99.11%，對(duì)青霉素的敏感率達(dá)96.43%，對(duì)米諾環(huán)素的敏感率為95.54%。

表3 SS分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（n=112）Tab.3 The antibiotic susceptivity profiles of SS isolates

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，地域因素對(duì)豬鏈球菌耐藥的影響也非常明顯（表4）。5個(gè)規(guī)模化豬場分離的菌株，除對(duì)克林霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素和萬古霉素的耐藥或者敏感情況一致外，對(duì)其余12種抗生素的耐藥率差異較大。以紅霉素為例，5個(gè)豬場的耐藥率分別為58.33%、36.36%、75.00%、95.00%、92.86%，差異非常顯著（統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：One-way analysis of variance，P＜0.001）。豬場A、豬場B、豬場D 與豬場E 都分離出對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、苯唑西林、諾氟沙星、復(fù)方新諾明耐藥的菌株，豬場C 則未分離出對(duì)這6 種抗生素耐藥的菌株。從該豬場分離出的菌株，對(duì)紅霉素、大觀霉素的耐藥率也與其他四家豬場的差異顯著。此外，在豬場B和豬場E均分離到對(duì)青霉素G耐藥的菌株，其余3家豬場則沒有分離到。

表4 不同規(guī)?；i場的SS耐藥情況分析Tab.4 Analysis of SS antibiotic-resistance results in different pig farms

2.6 豬鏈球菌多重耐藥檢測結(jié)果

表觀健康豬群所攜帶的豬鏈球菌的耐藥譜以多重耐藥為主。如表5所示，檢測的112株細(xì)菌中，5重耐藥菌有26株，占比23.21%；6重耐藥菌有28株，占比25.00%；7、8、9重耐藥菌的占比也較高。在此次試驗(yàn)中，從豬場B分離出的編號(hào)為SS040的菌株，對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素等11種抗生素耐藥，對(duì)氯霉素和米諾環(huán)素2種抗生素中介。從豬場E分離出的編號(hào)為SS100的菌株，對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、克林霉素、諾氟沙星、青霉素G、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、多粘菌素B、紅霉素、克拉霉素、大觀霉素等12種抗生素耐藥。

112 株豬鏈球菌中，地域因素對(duì)豬鏈球菌耐藥譜的影響也非常明顯，來自相同豬場的菌株的耐藥譜比較接近，不同豬場間的耐藥譜差異較大。5家豬場分離出的豬鏈球菌普遍對(duì)克林霉素和四環(huán)素耐藥。除此之外，豬場A的12株分離菌主要對(duì)紅霉素、克拉霉素和大觀霉素耐藥；豬場B的44株分離菌主要對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、呋喃妥因和大觀霉素耐藥；豬場C的8株分離菌主要對(duì)呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場D的20株分離菌主要對(duì)左氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、紅霉素和克拉霉素耐藥；豬場E的28株分離菌主要對(duì)苯唑西林、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、紅霉素和克拉霉素耐藥。

表5 SS菌株的多重耐藥性情況分析Tab.5 Analysis of multiple drug resistance of SS strains

3 討論與結(jié)論

伴隨我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度越來越高，細(xì)菌性疾病的發(fā)生趨勢逐漸復(fù)雜[1]。豬感染豬鏈球菌的病例也被頻繁報(bào)道[5,9]。豬鏈球菌屬于條件性致病菌，作為常在菌群可被感染豬、康復(fù)豬或健康豬攜帶。在一個(gè)被豬鏈球菌嚴(yán)重污染過的豬場，豬的帶菌率可達(dá)100%，但該病的發(fā)病率不同時(shí)期各不相同，通常情況下低于5%[10]。近幾年來，我國廣大農(nóng)牧區(qū)及許多養(yǎng)豬場出現(xiàn)了來勢猛烈、傳播快、病程短、死亡率高的敗血型鏈球菌病，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)華南地區(qū)屠宰群中豬鏈球菌的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，401 份屠宰豬的扁桃體的陽性檢出率38.4%[11]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心對(duì)全國21 個(gè)省市送檢的12 452 份臨床病料進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，從中分離到致病菌3 926 株，其中豬鏈球菌占所分離細(xì)菌總數(shù)37.42%[12]。本研究對(duì)江西省省內(nèi)規(guī)?；i場進(jìn)行豬鏈球菌的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌在臨床健康豬群中的檢出率為35.67%，與上述大規(guī)模的豬鏈球菌流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)一致。另外，本次調(diào)查中表觀健康豬群的鏈球菌2型檢出率為0%。2011—2012年，江西省疾病預(yù)防控制中心在曾發(fā)生過豬鏈球菌感染人的景德鎮(zhèn)市和崇仁縣開展健康豬攜帶豬鏈球菌的狀況調(diào)查，從301份鼻拭子和扁桃體樣品中分離2株豬鏈球菌2型，分離率也僅為0.66%[13]。據(jù)江蘇省獸醫(yī)研究所報(bào)告，江蘇地區(qū)健康豬群對(duì)豬鏈球菌2型42.6%的攜帶率[14]，這與上述兩次江西省的調(diào)查數(shù)據(jù)差異較大，可能是因?yàn)榈貐^(qū)差異。

從臨床用藥的角度看，豬鏈球菌菌株對(duì)萬古霉素的敏感率最高，但是因?yàn)槿f古霉素對(duì)機(jī)體的副作用較大（神經(jīng)損傷、腎功能損傷等），一般不建議作為抗生素療法的首選。β-內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素G）作為臨床上長期使用的殺菌藥物，仍然對(duì)豬鏈球菌保持著高度敏感性，是理想的治療或者預(yù)防豬鏈球菌病的抗生素。

過度使用抗生素而引起細(xì)菌耐藥發(fā)展速度加快是一個(gè)共識(shí)，抗生素的常態(tài)化使用（飼料添加劑，消毒劑，食品和飼料的防腐劑或凈化劑）被認(rèn)定是耐藥菌產(chǎn)生和耐藥基因傳遞的主要因素[15]。研究數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)豬鏈球菌對(duì)臨床使用頻率較高的抗生素耐藥情況嚴(yán)重，主要有四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類、喹諾酮類以及磺胺類抗生素，并且出現(xiàn)了大量多重耐藥株[16]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，省內(nèi)豬鏈球菌的耐藥情況已相當(dāng)嚴(yán)峻。分離出的112株豬鏈球菌，至少對(duì)1種抗生素耐藥，多重耐藥菌株占大多數(shù)，甚至出現(xiàn)了11 重、12 重耐藥菌株。幾乎全部的菌株都對(duì)四環(huán)素耐藥，可能是由于四環(huán)素類抗生素被廣泛用于飼料添加劑，超標(biāo)的劑量導(dǎo)致細(xì)菌選擇性進(jìn)化，耐藥情況嚴(yán)重。此外，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，已有耐青霉素的菌株出現(xiàn)，不容樂觀。耐藥菌株往往在抗生素超標(biāo)使用的“選擇性壓力”下出現(xiàn)，因此強(qiáng)化養(yǎng)殖從業(yè)人員科學(xué)合理使用抗生素的意識(shí)非常重要。

通過此次調(diào)查結(jié)果可以看出，各個(gè)規(guī)模化豬場的豬鏈球菌流行率和耐藥率差異較大，從側(cè)面反映出各個(gè)豬場養(yǎng)殖模式和管理的差異性，例如在日常生產(chǎn)過程中抗生素的選擇、使用情況等。為預(yù)防豬鏈球菌的發(fā)生，豬場應(yīng)注意改善環(huán)境條件，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，盡量減少致病的應(yīng)激因素[17]。臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)，若選擇了對(duì)細(xì)菌不敏感的抗生素，導(dǎo)致治療過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無效且增加成本，更易產(chǎn)生耐藥性[12]。因此，有條件的規(guī)模化豬場可以考慮定期分離菌株，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，一旦發(fā)病，盡快選擇敏感藥物合理使用，同時(shí)在發(fā)病期間對(duì)整個(gè)豬群進(jìn)行藥物預(yù)防，使疫病得到有效控制，減少損失。規(guī)?；i場應(yīng)高度重視細(xì)菌耐藥性問題，通過實(shí)驗(yàn)室摸清豬場致病菌種類，建立完善、合理的細(xì)菌性疾病監(jiān)測方案，防患于未然。

致謝：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)胡巧博士和合作豬場對(duì)本研究給予了支持和幫助，謹(jǐn)致謝意!