藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑及關(guān)鍵催化酶的研究 策略

周正 李卿 陳萬生 張磊

（1. 海軍特色醫(yī)學中心，上海 200433；2. 海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院藥學部，上海 200003；3. 海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433）

天然產(chǎn)物根據(jù)其生源途徑，分為初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物大多由生物大分子（多糖、核酸、脂類和蛋白質(zhì)）的合成和降解形成，對維持植物基本的生命活動具有不可替代的作用，貫穿生命的全程；次生代謝產(chǎn)物則是生物體特有的代謝途徑中所產(chǎn)生的各種特殊分子類型，其骨架往往比初生代謝產(chǎn)物更為復(fù)雜，往往發(fā)生在生命過程的某一階段。

控制天然產(chǎn)物生物合成的基因決定了不同種類天然產(chǎn)物的產(chǎn)生與累積，即基因的多樣性導致天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性。目前，藥用植物天然產(chǎn)物的研究中最前沿的科學問題是：各種復(fù)雜的天然產(chǎn)物是如何形成的？能否通過調(diào)控，大量獲得提取困難、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、應(yīng)用需求廣泛的天然產(chǎn)物。為了解決這些問題，需要解析天然產(chǎn)物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的功能，了解這些基因的表達和調(diào)控，進而對整個代謝網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控，甚至將不同來源的生物合成相關(guān)的代謝途徑模塊化，在底盤細胞上進行組裝，利用合成生物學的手段，實現(xiàn)各種重要的藥用植物天然產(chǎn)物的高效生物合成和規(guī)?；a(chǎn)。而所有問題的本源便是生物合成途徑和關(guān)鍵催化酶的解析。

本文針對藥用植物天然產(chǎn)物生物合成及關(guān)鍵催化酶的研究策略進行系統(tǒng)綜述，從藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的推測、天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵催化酶的發(fā)現(xiàn)與預(yù)測、酶的表達特征研究、體內(nèi)酶功能研究、酶催化特征研究、酶結(jié)構(gòu)解析與優(yōu)化、合成生物學研究這6個方面進行總結(jié)和討論。

1 生物合成途徑的推測

通過目標代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，推測目標化合物的生物合成途徑，是目標天然產(chǎn)物生物合成途徑催化酶研究的基礎(chǔ)。20世紀下半葉，隨著初生代謝途徑的解析基本完成，萜類、生物堿、苯丙素類等天然產(chǎn)物的組裝化學原理開始呈現(xiàn)。根據(jù)基本的化學反應(yīng)原理，結(jié)合研究物種中所分離到的天然產(chǎn)物，首先提出目標化合物的生物合成途徑假說。接下來則通過同位素示蹤實驗，即通過穩(wěn)定重原子標記初生代謝產(chǎn)物作為底物進行飼喂，再利用核磁共振或者高分辨質(zhì)譜，動態(tài)監(jiān)測并追蹤含有同位素原子代謝物的流向，進而驗證所提出的天然產(chǎn)物生物合成途徑假說的正確性。

同位素示蹤法廣泛應(yīng)用于解析藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的研究中。如在紫杉醇生物合成途徑的推測中，Eisenreich等［1］對紅豆杉（Taxus chinensis）的懸浮細胞飼喂前體［U-13C6］葡萄糖、［1-13C6］葡萄糖、［1，2-13C12］醋酸，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物 ［1，2-13C12］醋酸僅轉(zhuǎn)化到taxuyunnanine C的4個乙?；鶄?cè)鏈，卻未轉(zhuǎn)移到紫杉烷的環(huán)形骨架上；而兩個被標記的葡萄糖不僅轉(zhuǎn)移到了taxuyunnanine C的乙?；校瑫r也轉(zhuǎn)移到了紫杉烷的環(huán)形骨架。以上結(jié)果表明，紫杉烷的環(huán)形骨架來源于DXP/MEP途 徑（deoxyxylulose phosphate or methylerythritol phosphate pathway）。在莨菪堿的生物合成途徑推測中，Robins等［2］以3-苯基-［2-13C，2-2H］乳酸、苯基- ［1，3-13C2］乳酸以及［1'，3'-13C，甲基-2H3］海螺堿飼喂曼陀羅毛狀根（Datura innoxia），通過2D-NMR檢測13C、1H、2H，發(fā)現(xiàn)托品和來自苯丙氨酸的苯乳酸通過縮合反應(yīng)生成海螺堿。在丹酚酸途徑生物合成途徑推測中，Di等［3］用13C標記的苯丙氨酸飼喂丹參（Salvia miltiorrhiza）毛狀根，通過高分辨質(zhì)譜對丹酚酸成分的天然產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)丹參中迷迭香酸的產(chǎn)生途徑可能與已報道的彩葉草途徑有差異，同時預(yù)測迷迭香酸可能是丹酚酸B的前體化合物；而在丹參酮生物合成途徑的研究中，Guo等［4］利用13C標記的次丹參酮二烯飼喂丹參毛狀根，通過檢測發(fā)現(xiàn)了隱丹參酮和鐵銹醇的生成，證明了兩種物質(zhì)是丹參酮合成的中間產(chǎn)物。

大量的研究表明，同樣類型的化合物大多共用一套生物合成途徑，骨架合成酶和后修飾酶的種類，在特定結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的形成中基本一致［5-8］。因此，在后基因組時代，如苯丙素類、萜類、生物堿、黃酮等主要類型的藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑已逐步完善，基于同位素飼喂推斷代謝產(chǎn)物生物合成途徑的方法不像之前使用那樣頻繁。隨著生物信息學的發(fā)展，大量生信工具通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學以及代謝組學的分析及計算，便可以提供化學原理和酶學機制的高通量信息，幫助解析目標化合物的生物合成途徑。但是，對于一些基因組數(shù)據(jù)龐大、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學研究較為復(fù)雜的物種，同位素標記仍然發(fā)揮著極其重要的作用，比如在2016年Anttila等［9］利用同位素標記法標記［13C-甲基］蛋氨酸研究海洋甲藻（Alexandrium ostenfeldii）中聚酮類螺亞胺的生物合成途徑。

2 關(guān)鍵催化酶的挖掘和篩選

目標天然產(chǎn)物的生物合成途徑明確之后，則需要對目標關(guān)鍵催化酶進行挖掘和篩選。早期科研工作者僅是通過蛋白質(zhì)分離對酶的活性進行驗證，但是受制于檢測手段和測序技術(shù)，酶的挖掘和鑒定過程非常緩慢。

隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，對于關(guān)鍵酶的發(fā)現(xiàn)不再局限于傳統(tǒng)的分離純化和鑒定，而是基于各種生物信息學數(shù)據(jù)，通過酶的氨基酸序列與酶結(jié)構(gòu)的相似性進行挖掘。相比于已經(jīng)通過實驗驗證功能的酶，絕大多數(shù)酶的功能仍然是未知的。根據(jù)未知酶和已知酶之間的相似性，對未知酶的功能進行預(yù)測，已經(jīng)成為酶學研究中非常普遍的研究手段。盡管序列相似性預(yù)測不能完全找到整個酶家族中所有進化和功能的聯(lián)系，但是對于催化酶的挖掘來說具有十分重要的意義。此外，為了縮小候選基因的范圍，常常通過多種組學數(shù)據(jù)相結(jié)合的分析方法，如轉(zhuǎn)錄組學與基因組學、代謝組學相結(jié)合的方法，并輔助以酶的表達特征分析，如亞細胞定位實驗、GUS實驗、組織器官表達水平分析等，對生物合成途徑的關(guān)鍵催化酶進行篩選。

2.1 傳統(tǒng)酶的分離純化方法

酶的提取、分離、純化是指把酶從組織或者細胞內(nèi)外提取出并使之達到相應(yīng)程度的過程，一般包括5個步驟，包括細胞破碎、酶液提取、酶分離純化、酶濃縮、酶檢測與保存。其中最重要的的步驟便是分離純化，目前常用的分離純化方法包括離心分離、過濾分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離和結(jié)晶分離等。以嗎啡生物合成途徑解析為例，從1967年提出嗎啡的生物合成途徑假說以來，數(shù)十年來科學家們通過蛋白分離純化鑒定出了數(shù)種關(guān)鍵催化酶。如Roswitha于1993年利用7步程序，從罌粟（Papaver somniferum）的細胞懸浮液中分離純化得到了可以將罌粟生物堿salutaridine還原成（7S）-salutaridinol的氧化NADPH-7-氧化還原酶［10］。1995年，Rainer又從罌粟細胞懸液中分離得到了Salutaridinol-7-O-酰基轉(zhuǎn)移酶，解析了嗎啡前體蒂巴因生成過程［11］。隨著分子生物學的發(fā)展和組學數(shù)據(jù)的應(yīng)用，僅十幾年的時間，嗎啡的生物合成途徑便已經(jīng)基本闡明，甚至成功在酵母中進行了前體的異源合成［12］，這將在后文詳細說明。

2.2 基于共表達分析挖掘關(guān)鍵催化酶

共表達分析（Co-expression analysis）是通過大量基因表達數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基因之間的相關(guān)性，從而篩選、挖掘基因功能的一類分析方法。研究表明，在植物體內(nèi)同一個代謝通路上的基因，在受到體外或體內(nèi)刺激后，這些基因在表達量變化上會出現(xiàn)共表達的趨勢。通過這一特性，對轉(zhuǎn)錄組測序后所獲得的龐大數(shù)據(jù)進行篩選、注釋和可視化，對目標催化關(guān)鍵酶進行挖掘。

Di等［3］利用茉莉酸甲酯和脫落酸誘導丹參的毛狀根，根據(jù)酚酸基因表達水平的變化，尋找到了丹參迷迭香酸合成酶（SmRAS）、細胞色素P450單加氧酶（SmCYP98A14）和細胞色素P450還原酶（SmCPR）。Li等［13］利用茉莉酸甲酯處理菘藍毛狀根，并進行轉(zhuǎn)錄組測序，首次從菘藍（Isatis indigotica）發(fā)現(xiàn)了Dirigent蛋白家族19個基因，并對其進行了序列特征和表達分析，這為該類蛋白的進一步研究提供了基礎(chǔ)。

此外，通過共表達分析結(jié)合代謝數(shù)據(jù)的方法，Xiao等同樣使用茉莉酸甲酯處理菘藍毛狀根，研究落葉松脂素生物合成途徑的基因表達水平，并結(jié)合木脂素成分的積累水平，繪制了“基因與化合物”關(guān)聯(lián)性熱圖，篩選出27個與菘藍木脂素合成相關(guān)的基因，并對菘藍松脂醇還原酶IiPLR1基因進行研究，發(fā)現(xiàn)其在落葉松脂素的積累中發(fā)揮重要的作用［14-15］。Wang等［16］對不同紫草素積累量的新疆紫草（Arnebia euchroma）進行轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合新疆紫草不同器官中的基因表達水平、關(guān)鍵酶的亞細胞定位實驗，鑒定出了催化香葉基氫醌轉(zhuǎn)變?yōu)樽喜菟厍绑w的關(guān)鍵羥化酶CYP76B74。

2.3 基于基因組挖掘關(guān)鍵催化酶

相比于基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過基因的表達量挖掘關(guān)鍵催化酶，高質(zhì)量的基因組數(shù)據(jù)提供了更為全面準確的信息，其可以在群體水平上揭示個體之間基因的變化差異，從分子水平理解基因的結(jié)構(gòu)、組成、功能和進化。

Zhao等［17］通 過 黃 芩（Scutellaria baicalensis）基因組測序，揭示了漢黃芩素完整的生物合成途徑。根據(jù)基因組，共注釋了28 930個基因，并在黃芩特有的串聯(lián)重復(fù)區(qū)內(nèi)找到6個氧甲基轉(zhuǎn)移酶（SbPFOMT）候選基因。通過組織器官表達分析以及茉莉酸誘導黃芩毛狀根實驗，對篩選到的PFOMT進行進一步篩選。最終結(jié)合體外酶催化和體內(nèi)RNA抑制實驗，確認了PFOMT5是催化漢黃芩素生成的關(guān)鍵酶。Ma等［18］對自交6代純合的丹參株系進行基因組測序發(fā)現(xiàn)，形成丹參酮前體母核的二萜合酶與細胞色素P450基因以基因簇的方式存在于鼠尾草屬植物中。利用基因擴張和收縮分析，聚焦于丹參中明顯擴張的SmCYP71D亞家族，并篩選到了4個候選基因。后續(xù)研究表明，SmCYP71D373和SmCYP71D375可以催化丹參酮特征五元呋喃環(huán)的生成，SmCYP71D411與丹參酮類化合物C20位脫甲基化過程相關(guān)。Guo等［19］利用多種測序技術(shù)組裝獲得了罌粟的基因組，發(fā)現(xiàn)罌粟中那可丁和嗎啡類生物堿合成途徑中15個基因在11號染色體上形成超級基因簇（BIA基因簇），從而高效合成罌粟中的各種次生代謝產(chǎn)物，同時結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)BIA通路基因在根和莖中特異性表達且共表達。此外，根據(jù)序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)P450和氧化還原酶基因融合形成了一個STORR基因，該基因?qū)τ诶浰谥袉岱鹊纳锖铣删哂嘘P(guān)鍵作用。該研究揭示了罌粟基因組的復(fù)制、重排及基因融合導致了罌粟有效成分合成途徑的進化。

目前，越來越多的研究結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組，對藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵催化酶進行挖掘。通過轉(zhuǎn)錄組挖掘差異基因，快速圈定核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵候選基因；通過代謝組尋找目標化合物的差異累積，將候選基因與表型進行關(guān)聯(lián)；通過基因組對候選基因進行定位，結(jié)合序列的多態(tài)性全面對目標基因進行描述；通過酶表征數(shù)據(jù)，對酶基因的性質(zhì)進行確認。通過多組學聯(lián)合的方法，達到高效、快速挖掘、鑒定天然產(chǎn)物生物合成途徑催化酶基因的目的。

3 酶催化特征研究

在挖掘到一系列參與天然產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵候選酶基因后，接下來需要對酶的功能進行研究。首先對目標酶分離、純化或通過分子生物學的手段進行異源表達、純化；然后對酶的理化性質(zhì)進行分析；接下來對酶進行功能表征，檢測是否在適當?shù)臈l件下催化底物生成相應(yīng)的產(chǎn)物；最后開展酶催化的動力學性質(zhì)研究，多角度描述酶的催化特征。

3.1 酶的異源表達

在藥用植物關(guān)鍵酶的研究中，常見的異源表達宿主有大腸桿菌、酵母和煙草，其它不太常用的表達系統(tǒng)還包括一些真菌、昆蟲及哺乳動物細胞。

大腸桿菌作為原核生物，具有繁殖速度快、實驗操作簡單、培養(yǎng)成本較低和遺傳背景清晰等優(yōu)點，常常作為酶蛋白異源表達的首選宿主。但是原核表達系統(tǒng)也存在一些局限，如分泌表達能力弱、二硫鍵形成困難導致蛋白折疊錯誤、無翻譯后修飾等缺點，限制了其在復(fù)雜酶的表達中的應(yīng)用。而真核生物表達系統(tǒng)則主要是以酵母為主體，常用酵母宿主有釀酒酵母和畢赤酵母。相比于原核表達宿主，酵母系統(tǒng)具有外源基因整合穩(wěn)定、易于調(diào)控表達、重組蛋白以胞內(nèi)積累或胞外分泌的形式表達、存在翻譯后修飾、發(fā)酵密度極高等優(yōu)勢。煙草作為近些年來興起的植物表達宿主，通過農(nóng)桿菌介導的瞬時表達體系，使外源基因無需整合在煙草基因組中就可以進行表達，不受基因位置效應(yīng)以及沉默的影響。基于煙草的瞬時表達系統(tǒng)，即可以作為酶體外功能快速驗證的平臺，又可以作為酶體內(nèi)功能研究的輔助，具有快速、高效的特點。

Fu等［20］利用大腸桿菌為宿主，表達出了紫錐菊（Echinacea purpurea）中菊苣酸合成的BAHD家族?；D(zhuǎn)移酶，EpHTT、EpHQT和EpHCT；同時利用釀酒酵母表達出SCPL家族?；D(zhuǎn)移酶，EpCAS。根據(jù)體外酶促反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EpHTT催化咖啡酰輔酶A和酒石酸反應(yīng)生成咖啡酰酒石酸，EpHQT催化咖啡酰輔酶A及奎寧酸反應(yīng)生成綠原酸，兩個產(chǎn)物再進一步被EpCAS催化，生成菊苣酸和奎寧酸，該研究完整解析了紫錐菊中菊苣酸的生物合成途徑，并對關(guān)鍵催化酶進行了確認。Tu等［21］通過釀酒酵母表達出雷公藤（Tripterygium wilfordii）中P450單加氧酶，TwCYP728B70并發(fā)現(xiàn)該單加氧酶可以催化三步氧化反應(yīng)生成雷公藤甲素中間體脫氫樅酸，為雷公藤甲素生物合成途徑的解析奠定了基礎(chǔ)。Fei等［22］通過底物拓品和苯乳酸共注射的方式，在煙草中瞬時表達從顛茄（Atropa belladonna）中篩選到的苯乳酸UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶AbUGT1和海螺堿合成酶AbLS，確認了AbUGT1和AbLS的功能，AbUGT1催化苯乳酸和UDP-葡萄糖生成苯乳酰葡萄糖，進一步和托品在AbLS的催化下酯化縮合生成海螺堿。

3.2 酶理化性質(zhì)研究

由于絕大部分的酶是蛋白質(zhì)，所以酶理化性質(zhì)研究本質(zhì)是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)研究。根據(jù)化學組成的差異分為單純蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白質(zhì)中的非蛋白部分稱為酶的輔助因子，包括有機化合物（糖類、脂質(zhì)等）和金屬離子。

酶理化性質(zhì)研究主要研究包括分子量、等電點以及輔助因子的確定。酶的分子量一般通過其氨基酸序列便可預(yù)測，通過SDS-PAGE電泳進行驗證，分子量大小的單位以道爾頓（Da）表示。等電點的含義是，使蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等的兼性離子時，酶溶液的pH。該數(shù)值同樣可以根據(jù)氨基酸序列進行預(yù)測，通過等電聚焦電泳技術(shù)進行測定。輔助因子可通過化學顯色法、酶處理學或借助質(zhì)譜、核磁等儀器檢測來確定。

Ma等［23］從鹽膚木（Rhus chinensis）中篩選到了苯丙氨酸解氨酶基因，通過大腸桿菌進行異源表達，獲得了PcPAL重組蛋白。通過SDS-PAGE電泳，驗證了表達出蛋白的大小約為77 kDa。接下來對PcPAL的穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃、最適反應(yīng)pH為9.0，本研究首次從漆樹科植物中克隆了PAL基因并對該酶的基本理化性質(zhì)進行了探究。Su等［24］從羅漢果（Siraitia grosvenorii）中克隆出了由417個氨基酸構(gòu)成的鯊烯合酶SgSQS，其可以催化法尼基焦磷酸生成鯊烯。通過大腸桿菌為宿主表達出SgSQS，通過實驗發(fā)現(xiàn)蛋白大小為47 kD，等電點為7.3。隨后又對該酶的最適反應(yīng)溫度和pH進行研究，結(jié)構(gòu)表明在37℃ 以及 pH 7.5的條件下，鯊烯合酶的活性最高。

3.3 酶對底物選擇性研究

酶對底物的選擇性研究是判斷酶專一性或雜泛性的重要依據(jù)。當酶只催化一種物質(zhì)或某一類特定物質(zhì)發(fā)生一定反應(yīng)時顯示出專一性。反之酶催化雜泛性則表現(xiàn)為具有底物的寬泛性與反應(yīng)的多樣性。

Wang等［25］在傳統(tǒng)中藥黃芩中發(fā)現(xiàn)了一個黃酮3號位氧糖基化酶Sb3GT1（UGT78B4）。該酶可以接受5種不同的糖供體，包括：二磷酸尿苷葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。同時Sb3GT1也可以催化17種黃酮醇類化合物，轉(zhuǎn)換率達到98%以上，并催化形成5個全新的黃酮苷類化合物，表明該酶具有較強的雜泛性。Gao等［26］從桑樹（Morusalba）愈傷組織中鑒定出兩個FAD依賴的單加氧酶MaMO以及MaDA。MaDA能高效、選擇性地催化分子間［4+2］環(huán)加成反應(yīng)（Diels-Alder反應(yīng)）生成環(huán)己烯結(jié)構(gòu)單元，且對二烯體及親二烯體具有較寬的底物雜泛性；MaMO則可以催化異戊烯基氧化形成二烯體，兩者共同完成桑中活性成分chalcomoracin的生物合成。

3.4 酶催化的動力學性質(zhì)研究

酶催化的動力學性質(zhì)研究通常在酶催化反應(yīng)的最適條件下進行。通過考察不同pH、溫度和金屬離子濃度對酶反應(yīng)速率的影響確定最適反應(yīng)條件。

Wu等［27］從馬尿泡（Przewalskia tangutica）中分離純化了兩個托品酮還原酶基因PtTRI 和 PtTRII，并于最適pH測定了兩個托品酮還原酶的動力學參數(shù)，根據(jù)Kcat、Km、Kcat/Km的比較，發(fā)現(xiàn)相對于PtTRI，托品酮是PtTRII的最適底物，且根據(jù)其它物種托品酮還原酶的報道，PtTRI對托品酮表現(xiàn)出更高的親和力。Yu等［28］通過茉莉酸甲酯誘導紅景天（Rhodiola sachalinensis）細胞培養(yǎng)體系，挖掘了紅景天苷生物合成途徑中的兩個葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶RsUGT72B14 和RsUGT74R1。根據(jù)Kcat/Km比較兩個酶對于底物對羥苯基乙醇催化效率，發(fā)現(xiàn)RsUGT72B14的催化效率是RsUGT74R1的6倍。結(jié)合不同器官中兩個葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的表達量，明確了RsUGT72B14在紅景天苷的生成發(fā)揮重要的作用。Xiang等［29］從川西獐牙菜（Swertia mussotii）中篩選并鑒定了兩個環(huán)烯醚萜合成酶SmIS1和SmIS2，其中SmIS1的大小約為88 kD，SmIS2的大小約為46 kD。以8-oxogeranial為底物，NADPH為輔因子，測定SmIS1和SmIS2的動力學參數(shù)，結(jié)果表明，相比于SmIS1，SmIS2對底物有著較低的親和力，卻對NADPH有著較高的親和力。并且與長春花（Catharanthus roseus）和油橄欖（Olea europaea）中的環(huán)烯醚萜合成酶相比，SmIS1的催化效率降低。

4 體內(nèi)酶功能研究

通過體外實驗明確了天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶的催化功能后，需要對目標基因在生物體內(nèi)的功能進行研究。常用的酶體內(nèi)功能研究策略是通過基因的敲除或抑制，使目標酶基因在體內(nèi)的表達量降低，以及通過基因的過表達操作增加目標酶基因在體內(nèi)的表達量。通過酶表達量的變化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄、代謝、表型等方面的數(shù)據(jù)，研究酶在藥用植物體內(nèi)的功能。但是，由于遺傳轉(zhuǎn)化體系的限制，部分無法獲得目標酶基因穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因物種，則可以通過瞬時表達技術(shù)或者將基因在其它相近物種中進行表達，根據(jù)表型的變化，驗證酶的體內(nèi)功能。

4.1 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的酶基因敲除研究

CRISPR/Cas9技術(shù)是指在gRNA的引導下靶向基因組特定區(qū)域，并指導Cas9蛋白切割基因雙鏈，形成移碼突變或片段敲除的方法，該技術(shù)可以使基因永久性的表達沉默。

Zhou等［30］利 用CRISPR/Cas9技 術(shù) 敲 除 了丹參中酚酸生物合成的關(guān)鍵酶—迷迭香酸合成酶SmRAS，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸和丹酚酸的含量顯著降低，證明了SmRAS在丹酚酸途徑中的發(fā)揮重要的作用；而Li等［31］則利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了丹參酮生物合成途徑中丹參二萜合酶—SmCPS1，發(fā)現(xiàn)在純合敲除株系丹參酮IIA、隱丹參酮的積累幾乎消失，證明了SmCPS1在丹參酮生源途徑中的作用。通過基因編輯技術(shù)，Dinkins等［32］敲除紅車軸草（Trifolium pratense）中的異黃酮合酶TpIFS1，獲得了單鏈突變的雜合突變植株，后利用雜交獲得TpIFS1敲除的純合突變株系。對突變的純合株系進行研究發(fā)現(xiàn)，其異黃酮芒柄花黃素、鷹嘴豆素A還有金雀異黃酮的積累顯著下降。對黃酮生物合成途徑基因的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)TpIFS1敲除后，其上游基因泵丙氨酸裂解酶、查爾酮合酶的表達量顯著提高，而下游基因的表達量沒有顯著變化。

4.2 基于基因沉默技術(shù)的酶基因抑制研究

基因沉默的方法主要有RNA干擾（RNA inference，RNAi）和病毒誘導的基因沉默（Virus Induced Gene Silencing，VIGS）兩種方法。RNAi指利用同源性的RNA雙鏈（dsRNA）誘導與之互補的同源目標序列mRNA降解，阻斷體內(nèi)靶基因的表達，使植物出現(xiàn)目標基因缺失的表型，該技術(shù)一般用于轉(zhuǎn)基因體系成熟的物種研究。VIGS是指攜帶目標基因片段的病毒侵染植物后，可誘導植物內(nèi)源基因沉默、引起表型變化，該方法一般用于未建立轉(zhuǎn)基因體系的物種研究。

Zhao等［33］利用RNAi技術(shù)抑制人參（Panax ginseng）中β-香樹酯醇合成酶，獲得了轉(zhuǎn)基因毛狀根，發(fā)現(xiàn)β-AS的表達量降低后，β-香樹脂醇以及齊墩果烷型的人參皂甙R0的含量顯著降低，而總?cè)藚⒃碥疹惢衔锏暮棵黠@提高，表明β-AS在人參皂苷的合成中具有重要的催化作用。同樣是在人參中，Lu等［34］也從人參和西洋參（Panax quinquefolius）中鑒定到了兩個高度同源的糖基轉(zhuǎn)移酶，Pq3-O-UGT2 and PgUGT94Q2，兩個糖基轉(zhuǎn)移酶分別可以將UDP葡萄糖上的葡萄糖部分轉(zhuǎn)移到人參皂苷Rh2和F2來產(chǎn)生人參皂苷Rg3和Rd。通過轉(zhuǎn)基因毛狀根轉(zhuǎn)化體系，獲得人參和西洋參中兩個糖基轉(zhuǎn)移酶抑制的RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根，分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因分別抑制后，人參皂苷Rd、原人參二醇和總?cè)藚⒍嫉姆e累均出現(xiàn)了下降，此外原人參二醇合酶和元人參三醇合酶的表達量也顯著提高，表明兩個糖基轉(zhuǎn)移酶分別在人參和西洋參人參皂苷的合成中具有關(guān)鍵調(diào)控作用。Sarma等［35］利用VIGS技術(shù)沉默長春花中牻牛兒基焦磷酸合酶CrGGPP，研究其功能，發(fā)現(xiàn)CrGGPP的表達量降低后，單萜吲哚生物堿類相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及合成途徑相關(guān)的基因表達量明顯降低，同時單萜吲哚生物堿類的含量也隨之下降。而通過對CrGGPP-VIGS葉片進行化學互補實驗可以恢復(fù)CrGGPP抑制后的表型，證明了CrGGPP在長春花單萜吲哚生物堿類物質(zhì)的合成中具有重要作用。

4.3 酶基因過表達研究

基因過表達研究主要有兩種，一種是將目標基因克隆到攜帶有強啟動子和抗性篩選標記等元件的載體上，然后轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，這樣宿主細胞會獲得較高量的目標mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平。另一種則是病毒介導的過表達系統(tǒng)（virus mediated gene overexpression，VMGO）瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)。該技術(shù)亦可以將外源基因在植物體內(nèi)大量表達。通過分析目標基因過表達后轉(zhuǎn)基因植物的表型，便可以研究該基因的功能。

Yuan等［36］對黃花蒿（Artemisia annua）中青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因—青蒿醛△11（13）雙鍵還原酶AaDBR2進行過表達操作，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因黃花蒿植株青蒿素和其前體二氫青蒿酸的含量顯著提高，該研究為獲得高產(chǎn)青蒿素的黃花蒿代謝工程策略奠定了基礎(chǔ)。Chung等［37］從鬼針草（Bidens pilosa）挖掘到了油酸脫氫酶BpOD和脂肪酸乙炔酶BpFAA，通過病毒介導的瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)，在鬼針草葉片中分別過表達這兩個基因，都可以提升聚炔類化合物的含量，表明兩種酶均可以催化長鏈脂肪酸前體脫飽和，在天然活性產(chǎn)物聚乙炔的合成中作用顯著。為了研究銀杏（Ginkgo biloba）中黃酮類成分的生物合成途徑，Wu等［38］通過轉(zhuǎn)錄組測序，從黃酮中發(fā)現(xiàn)了一個類黃酮3'，5'-羥化酶GbF3'，5' H1。由于銀杏缺少成熟的轉(zhuǎn)基因材料的體系，為了研究該基因的功能，將GbF3'，5' H1于楊樹（Populus）中進行過表達后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株黃酮類成分櫻桃甙、表兒茶素、沒食子兒茶素的含量顯著高于野生型植株，表明GbF3'，5' H1在銀杏黃酮類成分的生物合成中發(fā)揮作用。

5 酶結(jié)構(gòu)解析與定向改造

確認了催化酶在藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中的功能后，為了探究酶發(fā)揮催化功能的機理或進一步對酶催化功能進行定向改造，首先需要對酶蛋白晶體進行結(jié)構(gòu)解析，闡明底物選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，解釋酶催化底物的反應(yīng)機制。而后對發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵氨基酸位點進行理性設(shè)計，獲得一系列底物特異性或催化效率發(fā)生改變的突變體，對突變體的功能進行解析，最終獲得特定功能的酶，實現(xiàn)酶功能的定向改造。

C-糖苷在自然界中分布局限、結(jié)構(gòu)多樣性不足，同時化學法C-糖基化面臨選擇性差，因此藥用植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中C-糖基轉(zhuǎn)移酶研究成為近些年來的熱點問題。第一個被解析晶體結(jié)構(gòu)的C-糖基轉(zhuǎn)移酶來自于金蓮花（Trollius chinensis），He等［39］發(fā)現(xiàn)了催化黃酮C-8位糖基化的碳糖基轉(zhuǎn)移酶TcCGT1，研究表明該酶可以催化合成牡荊苷等36種碳苷類化合物。又初步闡明了TcCGT1催化C-、O-糖基化的分子機制，并通過定點突變實現(xiàn)了由C-糖基化向O-糖基化的功能轉(zhuǎn)變。Zhang等［40］從光果甘草（Glycyrrhiza glabra）鑒定出一條雙C-糖基轉(zhuǎn)移酶GgCGT（UGT708B4）。該雙C-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠高效催化含有弗洛丙酮結(jié)構(gòu)單元的化合物發(fā)生連續(xù)兩步的C-糖基化反應(yīng)，生成相應(yīng)的雙碳苷產(chǎn)物。為了闡明該酶的催化機制，解析了GgCGT分別與二磷酸尿苷葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖等底物結(jié)合后所形成復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于葡萄糖，半乳糖的結(jié)合位置的偏轉(zhuǎn)導致糖基部分與周圍氨基酸形成氫鍵作用的強弱發(fā)生變化，影響酶與糖供體的結(jié)合作用強弱，決定了糖基供體的偏好性的順序。Xie等［41］通過轉(zhuǎn)錄組學等方法從蘆薈（Aloe barbadensis）中發(fā)掘了一個C-糖基轉(zhuǎn)移酶（AbCGT），該酶可以高效催化多種不含?；姆枷丬赵牡孜镞M行C-糖基化。以GgCGT為模板，通過同源建模的方法構(gòu)建AbCGT的三維立體結(jié)構(gòu)，利用分子對接預(yù)測了該酶與底物2-羥基柚皮素的反應(yīng)口袋，發(fā)現(xiàn)183位的纈氨酸為酶關(guān)鍵活性位點催化殘基。通過定點將該位點突變天冬氨酸、谷氨酸或者脯氨酸后，AbCGT催化的底物選擇性有明顯提升。

6 合成生物學研究

由于多數(shù)藥用植物天然產(chǎn)物在原植物中積累較低，且獲得受到植物生長狀態(tài)、采收時間、提取方法、遺傳操作困難等諸多因素的限制。因此，天然產(chǎn)物合成生物學則是基于工程化的原理，通過設(shè)計改造自然界已存在的微生物或植物，或者于這些生物體內(nèi)，重新構(gòu)建一套完整系統(tǒng)，高效快速的生產(chǎn)藥用植物活性成分。實現(xiàn)這一策略首先需要推測目標天然產(chǎn)物的生物合成途徑，其次明確每一步催化反應(yīng)所需要的關(guān)鍵酶及輔因子，再將生物合成途徑整合于底盤細胞內(nèi)，最終對整個代謝網(wǎng)絡(luò)進行優(yōu)化調(diào)控。目前，藥用植物天然產(chǎn)物合成生物學常用的底盤有大腸桿菌、酵母及本氏煙草等，下文將針對不同底盤構(gòu)建細胞工廠進行藥用天然產(chǎn)物的合成進行簡要綜述。

Li等［42］通過來源于7個物種的11個基因整合進大腸桿菌，構(gòu)建了能夠?qū)⒈奖彼峄蚶野彼醿煞N不同的前體，定向合成黃芩素或野黃芩素的菌株。后針對丙二酰輔酶A這一重要前體的供應(yīng)進行了優(yōu)化，搖瓶水平黃芩素和野黃芩素的產(chǎn)量分別達到了23.6 mg/L 和106.5 mg/L。Yao等［43］在丹參素生物合成途徑未被解析的情況下，利用大腸桿菌內(nèi)源的羥基化酶和植物乳桿菌中的D-乳酸脫氫酶，在大腸桿菌中構(gòu)建了丹參素生物合成途徑。再采取模塊化策略優(yōu)化，加強底物的供給；對底盤細胞編輯，敲除競爭基因，篩選出高產(chǎn)丹參素的人工大腸桿菌，丹參素產(chǎn)量達7.14 g/L。

斯坦福大學的Christina課題組利用酵母實現(xiàn)了多種藥用植物活性天然產(chǎn)物的生物合成，其中最具代表性的工作便是2015年于釀酒酵母中合成蒂巴因和氫可酮，以及2020年在面包酵母中合成托品烷生物堿。Galanie等將來自酵母本身、植物、細菌以及嚙齒動物的21種酶，在不影響酵母正常生長的情況下，整合進釀酒酵母中，通過輔因子循環(huán)利用、嵌合蛋白的蛋白質(zhì)折疊等方法，獲得了嗎啡類藥物的關(guān)鍵前體—蒂巴因。之后又整合了另外兩種催化酶，使得產(chǎn)生蒂巴因的酵母進一步生成了氫可酮［12］。Prashanth通過5個生物合成功能模塊的設(shè)計，從糖和氨基酸出發(fā)，在面包酵母中實現(xiàn)了莨菪堿和東莨菪堿的合成［44］。

依托泊苷作為拓撲異構(gòu)酶 II 抑制劑，廣泛應(yīng)用于肺癌、睪丸癌、淋巴瘤和其它惡性腫瘤的化療。目前，依托泊苷主要從桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum）中分離鬼臼毒素，并以此為前體合成依托泊苷。但對桃兒七過度的砍伐導致其現(xiàn)已瀕臨滅絕。目前常用的替代方法是通過植物組織培養(yǎng)方法合成（-）-鬼臼毒素，并以此為前體合成依托泊苷，但該方法不便于進行規(guī)?；a(chǎn)。2015年Elizabeth課題組的Lau. W通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組的分析，解析了依托泊苷糖苷配基完整的生物合成途徑，并報道了其前體脫氧鬼臼毒素在煙草中的重構(gòu)，達到11.4±3.8 μg/g干重的產(chǎn)量，為煙草作為天然產(chǎn)物的生物合成底盤研究奠定了基礎(chǔ)，表明煙草的瞬時表達可以用于獲得毫克級的植物源小分子并生物合成其類似物［45］。2019年，同課題組的Schultz. BJ等利用煙草為底盤，實現(xiàn)了脫氧鬼臼毒素的異源合成。通過在煙草中表達 8 個松柏醇和 8 個依托泊苷苷元的酶基因之后，脫氧鬼臼毒素在煙草中的積累量達到了 4.3 mg/g。該研究表明可以在煙草植物底盤細胞中表達難培養(yǎng)的藥用植物中較長的生物合成途徑，并達到毫克級產(chǎn)量［46］。

7 總結(jié)與展望

隨著藥用植物天然產(chǎn)物的市場需求的不斷增加，藥用植物的資源供求矛盾也越來越明顯，而通過生物技術(shù)手段是解決這一矛盾的有效方法。對藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成化學原理和酶學機制進行探究的最終目的，便是為藥用植物資源的可持續(xù)利用和發(fā)展提供一條全新而高效的途徑。

在生物信息學飛速發(fā)展的今天，通過基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、表型組學等組學技術(shù)聯(lián)合分析，對藥用植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑及關(guān)鍵催化酶進行挖掘和解析，利用結(jié)構(gòu)生物學對獲得的酶進行改造，再應(yīng)用合成生物學的方法，將生物合成途徑和關(guān)鍵酶整合到底盤中，從而異源高效生產(chǎn)各種目標天然產(chǎn)物。這一系列的研究方法，已經(jīng)成為藥物植物天然產(chǎn)物的生物合成研究的通用策略。

然而這一策略在應(yīng)用時也會遇到一些問題。比如在研究一些關(guān)鍵催化酶的體內(nèi)功能時，由于許多藥用植物缺乏穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，只能借助模式植物瞬時轉(zhuǎn)化等手段進行替代，所以仍需要在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究中加以突破。此外，植物的基因組中編碼了數(shù)目眾多且功能各異的催化酶，并且常以家族基因的形式存在，這些酶有的可以催化多種化合物的產(chǎn)生，有的只能催化單一天然產(chǎn)物的生成，還有的需要和其它酶或者輔因子共同作用才能發(fā)揮其催化效應(yīng)。這是由于在高等植物在進化的過程中，酶的進化形成了復(fù)雜而精巧的結(jié)構(gòu)，導致其催化功能多樣性，進而出現(xiàn)了物種的多樣性和代謝產(chǎn)物的多樣性。利用這一策略，不僅可以去探索未知天然產(chǎn)物的生物合成途徑及關(guān)鍵催化酶的功能，對于已知的途徑，仍可能會有全新的發(fā)現(xiàn)和認知。這一策略為更好的挖掘天然產(chǎn)物生物合成途徑提供了基礎(chǔ)，也將為合成生物學的研究提供豐富的元件，進而推動藥用植物天然產(chǎn)物提取、合成、臨床應(yīng)用等各領(lǐng)域的進步。