血液樣本蛋白質(zhì)組分析方法的比較研究

王智博 王道平 苗蘭 李瑛 潘映紅 劉建勛

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3. 北京市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的補(bǔ)充，可用于基因組所表達(dá)蛋白的定性定量［1］，在發(fā)現(xiàn)疾病潛在蛋白分子標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)以及探究蛋白作用機(jī)制等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)組學(xué)常以細(xì)胞、組織和血液為研究材料，其中血液樣本因其微創(chuàng)易得且更能反應(yīng)生物體的綜合狀態(tài)，目前廣泛用于相關(guān)研究中［2-4］。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)流程主要由樣本制備、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析等環(huán)節(jié)構(gòu)成。在這些研究環(huán)節(jié)中，屬于樣本制備范疇的預(yù)處理和酶切技術(shù)可顯著影響蛋白鑒定率和數(shù)據(jù)重復(fù)性等后續(xù)質(zhì)譜分析結(jié)果［5］。盡管當(dāng)前應(yīng)用廣泛的超濾法樣本制備技術(shù)簡化了溶液內(nèi)酶切的濃縮和除鹽步驟，能減少樣本損失，獲得較高純度肽段［6］，血液樣本的預(yù)處理和酶切技術(shù)仍需進(jìn)一步完善。

血液樣品的復(fù)雜構(gòu)成特別是高豐度蛋白是影響蛋白質(zhì)組學(xué)分析效果的主要因素［7］。研究表明基于抗體的親和色譜吸附可有效去除血樣中的高豐度蛋白［8］?；诓煌难芯磕康模簶悠房煞殖裳搴脱獫{，其中血清在制備過程中已去除大部分纖維蛋白原，常用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析［9］。酶切技術(shù)在血液樣本制備中的重要性也不容忽視。酶切前通常進(jìn)行蛋白質(zhì)變性處理，其中熱變性較化學(xué)變性與質(zhì)譜兼容性高，操作簡便且不引入外來干擾物，可作為化學(xué)變性的替代方法［10］。Schniers等和Betancourt等［11-12］還報(bào)道在低濃度尿素溶液進(jìn)行胰蛋白酶酶切時(shí)，可獲得較好的重復(fù)性和深度的蛋白組覆蓋。此外，多數(shù)胰蛋白酶切在37℃條件下進(jìn)行，但Budnik等［13］報(bào)道在45℃條件下也可獲得較好的酶切效率。有關(guān)酶切技術(shù)的優(yōu)化有大量報(bào)道，這些改進(jìn)技術(shù)值得制備血液樣本時(shí)參考。

質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)。Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)是現(xiàn)階蛋白質(zhì)組分析的主流技術(shù)之一，其獲得碎片離子信息的方式常包括數(shù)據(jù)依賴性采集（data dependent acquisition，DDA）、非數(shù)據(jù)依賴性 采集（data independent acquisition，DIA）和平行反應(yīng)監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）3種模式［14］。DDA即經(jīng)典的鳥槍法，是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的首選方法［15］，該模式選擇一級(jí)質(zhì)譜上峰強(qiáng)度相對(duì)高的母離子進(jìn)行碎裂，但母離子單同位素峰不一定是最高峰，低強(qiáng)度峰和共洗脫峰也較難鑒別。DIA解決了離子選擇隨機(jī)性的問題，不依賴預(yù)設(shè)參數(shù)，通過固定窗口或可變窗口進(jìn)行高低離子交替采集，理論上重復(fù)性更高，相比DDA在質(zhì)譜重復(fù)上潛力顯著，但數(shù)據(jù)解析難度大［16］。Venable等［17］將DIA應(yīng)用于酵母全細(xì)胞裂解物分析中，相比DDA-MS直接掃描定量獲得了更高的信噪比、靈敏度、選擇性和動(dòng)態(tài)范圍。近年來DIA譜圖軟件解析軟件不斷更新，極大提升了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)定量的準(zhǔn)確度［18］。不同于DIA技術(shù)，PRM聚焦于目標(biāo)肽段產(chǎn)物離子的監(jiān)測［19］。PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有較高的精確度和重復(fù)性，但需要預(yù)先設(shè)定待檢測前體離子，且檢測數(shù)量有限［20］，因此常應(yīng)用于特定蛋白驗(yàn)證。Silva等［21］使用混合消化高密度脂蛋白（HDL）中的標(biāo)記多肽進(jìn)行DIA和PRM分析，發(fā)現(xiàn)兩種模式均可獲得較好的蛋白定量線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度。

現(xiàn)有的血樣制備分析方案較多，但發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的進(jìn)度仍舊緩慢［2］。血液樣本包含重要的生物信息，其蛋白質(zhì)組分析的意義重大。通過血樣蛋白質(zhì)組分析方法的比較研究，有望建立蛋白鑒定覆蓋率較高和重復(fù)性較好的血液樣本制備和分析方法，為進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)研究創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用6周齡SPF級(jí)SD大鼠1只，體質(zhì)量180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0001。取血前飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（33±2）℃，相對(duì)濕度45%-65%。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018XLC003-2）。

1.1.2 試劑 水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)30037517）；色譜用水購自中國杭州娃哈哈有限公司；尿素（urea）購自美國昂飛公司（Affymetrix）；胰蛋白酶（trypsin）購自普洛麥格 公 司（Promega）；甲 酸（formic acid，F(xiàn)A）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙腈（ACN）購自美國賽默飛世爾公司（Thermo Fisher）；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）購自GE公司；碳酸氫銨（ammonium bicarbonate）購自Amresco公司。

1.1.3 儀器與耗材 Easy nLC 1000 納升級(jí)液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；預(yù)柱（富集柱，目錄號(hào)HS-Trap-C-5U-5CM）和分析柱（直噴毛細(xì)色譜柱，目錄號(hào)HS-Anal-C-5U-15CM）購自北京樂潤峰科技有限公司（Beijing Happy Science Scientific Co.Ltd）；CS5000型動(dòng)物體重秤（上海奧豪斯儀器有限公司）；ICE-CL31R型低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo Fisher公司）；ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit（美國Merck公司，目錄號(hào)122642）。

1.2 方法

研究流程見圖1，采用基于超濾膜的過濾輔助法制備樣品。使用維恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進(jìn)行定性結(jié)果重復(fù)性分析。主成分分析和數(shù)據(jù)可視化使用R軟件包ggplot2_3.3.0和ggfortify_0.4.9。其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件為Excel。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental flow

常規(guī)酶切方法、色譜質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置和數(shù)據(jù)庫搜索方法參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行［5］并稍作修改。流動(dòng)相，A為純水，B為CAN，均含0.1% FA（V/V）。流速設(shè)定420 nL/min，梯度洗脫設(shè)定：0.4 mL/min，3%-6% 3 min，6%-22% 78min，22%-100% 1 min，100% 8min。質(zhì)譜分析在Q Exactive Plus質(zhì)譜儀上完成。DDA采集模式的一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000，掃描范圍300-1 800 m/z，自動(dòng)增益（automated guided cart，AGC）值3e6，注入時(shí)間（IT）50 ms。二級(jí)質(zhì)譜的分辨率17 500，AGC值1e5，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能（normalized collision energy，NCE）27.0。毛 細(xì)管溫度275℃，電噴霧離子源1900V，二級(jí)采集標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)度前20的母離子進(jìn)行Orbitrap檢測。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)分別采用Proteome Discoverer 2.1（Thermo Fisher） 和 MaxQuant 1.3.0.5（https://www.coxdocs.org/）對(duì)原始數(shù)據(jù)的RAW文件定性和定量，搜索引擎SEQUEST HT。用UniProt Rattus norvegicus 蛋白數(shù)據(jù)庫（更新時(shí)間2020.11.1）進(jìn)行檢索。設(shè)定參數(shù)如下，高置信度，肽段長度設(shè)定6-144，最大漏切位點(diǎn)為2，前體離子質(zhì)量容差±10 μmol/L，碎片離子質(zhì)量容差±0.02 Da，固定修飾設(shè)定半胱氨酸碘乙酰胺化（carbamidomethy/+57.021 Da），可變修飾選擇甲硫氨酸氧化（oxidation/+ 15.995 Da）和N-乙?；ˋcetyl/+42.011 Da），蛋白和多肽定性假陽性率FDR為1%。每個(gè)樣本的3次質(zhì)譜重復(fù)合并檢索，得到蛋白定性數(shù)據(jù)以Excel格式導(dǎo)出。

1.2.1 血樣預(yù)處理 血清采集：采集全血于試管中，4℃靜置30 min待凝固后離心（1 500×g，10 min），取上清置于EP管中，-80℃保存。血漿采集：采集全血于醫(yī)用血常規(guī)管（EDTA抗凝）中，4℃離心（1 500×g，10 min），取最上層置于EP管中，-80℃保存。血清去除高豐度蛋白處理：-80℃保存的血清解凍后，參考ProteoExtract Albumin/ IgG Removal Kit說明書去除高豐度蛋白。

3種預(yù)處理的大鼠血液樣本按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白組樣品制備和質(zhì)譜檢測，步驟如下：樣本的初始體積均為50 μL，濃縮后置于超濾管采用8 mol/L尿素洗滌3次，終濃度10 mmol/L DTT還原（37℃，30 min），8 mol/L尿素洗滌3次，終濃度20 mmol/L IAA烷基化（37℃，30 min），8 mol/L尿素洗滌3次，采用50 mmol/L NH4HCO3置換尿素后加入2 μg Trypsin進(jìn)行酶切（37℃，16 h），離心（14 000 r/min，10 min）取下層液用于質(zhì)譜分析。利用數(shù)據(jù)處理軟件比較血漿、血清和去除高豐度蛋白血清的蛋白鑒定數(shù)、肽段數(shù)、譜圖匹配數(shù)和蛋白定量重復(fù)性。

1.2.2 胰蛋白酶切（protein digestion） 取50 μL樣本用于酶切處理，還原烷基化步驟同上，8 mol/L尿素和50 mmol/L NH4HCO3洗滌，最終得到約20 μL樣品用于酶切。

1.2.2.1 常規(guī)酶切（conventional digestion，CD） 采用常規(guī)方法進(jìn)行還原、烷基化和洗滌，加入2 μg Trypsin，37℃恒溫水浴16 h，加入0.1%（V/V）甲酸水溶液終止酶切，更換接收管，離心（12 000 r/min，20 min），離心液用于質(zhì)譜分析。

1.2.2.2 45℃孵育（45℃ digestion，45D） 按常規(guī)酶切方法處理樣品，孵育溫度設(shè)為45℃。

1.2.2.3 熱輔助酶切（heat assisted digestion，HD）樣品還原前加入50 mmol/L NH4HCO3定容到1 mL，在密閉的微型離心管中加熱（95℃，10 min），轉(zhuǎn)移到冰水浴中降溫終止變性過程，濃縮，余下步驟同CD法。

1.2.2.4 二次熱輔助酶切（repeated heat assisted digestion，RHD） 樣本還原前加入50 mmol/L NH4HCO3定容到1 mL，在密閉的微型離心管中加熱（95℃，10 min），降至室溫后濃縮，加入1 μg酶，37℃孵育3 h，二次加熱樣品（95℃，10 min），降溫后再加入1 μg酶，37℃孵育13 h。

1.2.2.5 尿素輔助酶切（urea assisted digestion，UD） 采用常規(guī)方法進(jìn)行還原、烷基化和洗滌，酶切前加入終濃度為1 mol/L的尿素，余下步驟同CD法。

1.2.2.6 變溫酶切（variable temperature digestion，VD） 采用常規(guī)方法進(jìn)行還原、烷基化和洗滌，酶切前將樣品管置于80℃水浴鍋，待水溫降至60℃后加入含2 μg Trypsin的酶液，隨后轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋孵育16 h。

1.2.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

1.2.3.1 數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA） DDA條件設(shè)定及數(shù)據(jù)處理主要參考文獻(xiàn)方法設(shè)定［5］，其余參數(shù)設(shè)置見前述。

1.2.3.2 非數(shù)據(jù)依賴性采集（DIA） 肽段液相分析方法同上，質(zhì)譜設(shè)定為DIA采集模式，一級(jí)質(zhì)譜設(shè)定為Full MS，二級(jí)質(zhì)譜掃描設(shè)定60個(gè)固定掃描窗口，分辨率、掃描范圍、AGC值、注入時(shí)間等參數(shù)同DDA。將DIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入到PEAKS studio 8.5進(jìn)行定性和定量，數(shù)據(jù)采集模式設(shè)定為DIA，首先使用DDA采集模式的raw文件構(gòu)建DIA檢索的蛋白譜圖庫，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭序列（de novo sequencing） 分析，肽段長度、離子質(zhì)量偏差、假陽性率、固定修飾和可變修飾等參數(shù)同DDA，每個(gè)樣本的3次質(zhì)譜重復(fù)合并檢索，得到蛋白定性數(shù)據(jù)以Excel格式導(dǎo)出。

1.2.3.3 平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM） 肽段液相分析方法同DDA，質(zhì)譜設(shè)定為PRM采集模式，在設(shè)置菜單中選擇離子對(duì)設(shè)置，將母離子和子離子質(zhì)量分析儀設(shè)置為Orbitrap，分析時(shí)間90 min，正離子檢測，MS1 分辨率為70 000（200 m/z），MS/MS 分辨率為17 500（200 m/z），AGC、NCE、IT等參數(shù)同DDA。將PRM定量的21個(gè)靶蛋白導(dǎo)入Skyline軟件（https://skyline.ms/）中，選擇肽段設(shè)置，添加背景蛋白組數(shù)據(jù)庫文件，根據(jù)譜庫中的離子信號(hào)選擇蛋白質(zhì)定量的多肽，從Skyline導(dǎo)出包含保留時(shí)間的相關(guān)肽列表，并手動(dòng)檢查靶蛋白的每個(gè)肽的定量結(jié)果。

1.2.4 血清蛋白組分析流程優(yōu)化 根據(jù)上述血樣蛋白質(zhì)組分析方法的比較研究結(jié)果，采用優(yōu)化的前處理、酶切和數(shù)據(jù)采集方法構(gòu)建適宜的血樣蛋白組分析流程。

2 結(jié)果

2.1 血樣前處理方法比較

每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中血漿樣本平均檢測到321組蛋白，重復(fù)鑒定的蛋白占比66.2%；保留高豐度蛋白血清平均檢測到346組蛋白，重復(fù)鑒定的蛋白占比64.4%，相較于血漿增加了16組蛋白鑒定數(shù)；去除高豐度蛋白血清平均檢測到377組蛋白，重復(fù)鑒定的蛋白占比69.4%，相較于保留高豐度蛋白血清增加31組蛋白鑒定數(shù)（圖2-A）。進(jìn)一步的蛋白定性分析結(jié)果顯示，去除和保留高豐度蛋白血清樣品的蛋白鑒定數(shù)和二級(jí)譜圖數(shù)無顯著性差異，但去除高豐度蛋白樣品的肽段和譜圖匹配數(shù)（peptide spectrum matches，PSMs）均高于保留高豐度蛋白樣品（圖2-B）。3種血液樣本定量數(shù)據(jù)的主成分分析顯示，3種血樣的組間分離度明顯較高，但每種血樣的3個(gè)重復(fù)樣本彼此相近，如圖2-C所示。

圖2 三種預(yù)處理方法制備血樣的質(zhì)譜結(jié)果比較Fig. 2 Comparison of mass spectrometry results of blood samples prepared by 3 pre-processing methods

2.2 酶切方法比較

對(duì)不同酶切樣本質(zhì)譜鑒定的蛋白數(shù)、肽段數(shù)、譜圖匹配數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如圖3-A所示，45D組所得蛋白鑒定覆蓋率低于CD組；HD組鑒定到的蛋白數(shù)、肽段數(shù)和譜圖匹配數(shù)較其他組高，其中肽段數(shù)和譜圖匹配數(shù)相比CD組有顯著性差異，低標(biāo)準(zhǔn)差表明HD組重復(fù)性更高；RHD組蛋白鑒定數(shù)較CD組低，但識(shí)別的肽段數(shù)高于CD組；UD組顯示蛋白數(shù)、肽段數(shù)和譜圖匹配數(shù)相對(duì)CD組低。而VD法所得蛋白和肽段鑒定率較CD組高，無顯著性差異；另外，VD組各項(xiàng)指標(biāo)顯示出較高的標(biāo)準(zhǔn)差。分析每組樣品的3次重復(fù)制樣，45D組重復(fù)率為69.7%，高于其他5組圖；HD組3次重復(fù)鑒定到的共有蛋白數(shù)最多，為288個(gè)（圖3-C）。比較各組樣品的遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)，VD組酶切位點(diǎn)遺漏率為51.22%，較其他組最低，而RHD組和UD組具有相對(duì)較高的漏切率（圖3-B）。另外，分別統(tǒng)計(jì)了蛋白序列覆蓋度在20%-35%、35%-50%和＞50%的區(qū)間分布（圖3-D），發(fā)現(xiàn)在20%-35%和＞50%的區(qū)間，VD組和HD組相比其他4組具有更高的蛋白序列覆蓋度，其中HD組具有更低的標(biāo)準(zhǔn)差，表明HD組蛋白被酶解的更充分；而在區(qū)間35%-50%中，UD組和RHD組有最高的肽段分布。對(duì)定量結(jié)果的主成分分析顯示，組間交叉明顯，其中45D組在主成分1（PC1）的分析中差異最小，RHD組次之；HD組在主成分2（PC2）的分析中差異最小，VD組次之（圖3-E）。

圖3 血清蛋白不同酶切方法質(zhì)譜結(jié)果比較Fig. 3 Comparison of mass spectrometry results of serum proteins with different enzymatic digestion methods

2.3 DDA和DIA數(shù)據(jù)采集模式結(jié)果分析

血清樣品再DDA模式下單次質(zhì)譜分別鑒定到338、346、359個(gè)蛋白；DIA模式下以DDA的raw文件為背景庫單次質(zhì)譜分別鑒定到371、368、369個(gè)蛋白，單次質(zhì)譜DIA模式更佳（圖4-A）。將3次質(zhì)譜重復(fù)蛋白定性結(jié)果合并后剔除重復(fù)值，發(fā)現(xiàn)DDA和DIA模式分別有422和420個(gè)蛋白鑒定數(shù)，但DIA具有更小的標(biāo)準(zhǔn)差，且鑒定到的共有蛋白數(shù)占總蛋白的比例分別為68.2%和75.9%（圖4-C）。因?yàn)橘|(zhì)譜分析中普遍存在蛋白數(shù)據(jù)缺失的狀況，缺失率可作為反映數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性和重復(fù)性的指標(biāo)之一，因此根據(jù)樣本中蛋白的檢出度，分別統(tǒng)計(jì)了DDA和DIA的3次質(zhì)譜重復(fù)蛋白定性數(shù)據(jù)的缺失值。在DDA模式下，定性數(shù)據(jù)缺失率分別為26.41%、26.66%、25.12%；在DIA模式下，缺失率分別為11.45%、12.17%、11.93%圖（4-B）。進(jìn)一步篩選3次質(zhì)譜重復(fù)鑒定到的肽段信息，發(fā)現(xiàn)DDA和DIA分別鑒定到共有肽段數(shù)為3450和1569，肽段CV值的均數(shù)分別為34.65%和22.12%，CV值低于20%的肽段數(shù)分別占比29.68%和67.81%圖（4-D）。

圖4 DDA和DIA數(shù)據(jù)指標(biāo)比較Fig. 4 Comparison of DDA and DIA data indices

2.4 DIA和PRM數(shù)據(jù)采集模式結(jié)果比較

選取不同豐度梯度的蛋白比較DIA和PRM在蛋白組中的定量分析能力，通過各特異肽段峰面積計(jì)算3次質(zhì)譜重復(fù)的CV值。如表1所示，兩種檢測方法中CV值低于20%的比例分別為42.85%和47.16%，通常篩選特異肽段信息完成蛋白定量，因此多數(shù)情況下PRM相對(duì)DIA定量更有優(yōu)勢，在一些蛋白的定量中DIA也展示出良好的定量重復(fù)性。

表1 DIA蛋白和對(duì)應(yīng)肽段PRM 3次重復(fù)定量CV值分析Table 1 Quantitative analysis on the coefficient of variation of protein from DIA and corresponding peptides from PRM in 3 repeats

2.5 血樣蛋白質(zhì)組學(xué)流程優(yōu)化

血清去除高豐度蛋白，經(jīng)熱輔助結(jié)合變溫酶切法酶切，最后采用DDA數(shù)據(jù)采集模式分析，3次重復(fù)試驗(yàn)分別定性到490、490、504個(gè)蛋白，鑒定總蛋白數(shù)590個(gè)，共有蛋白占比69.8%（圖5-A）；定量CV值低于20%的蛋白占比71.10%（圖5-B）。

圖5 基于優(yōu)化流程分析的血樣蛋白組定性和定量結(jié)果Fig.5 Qualitative and quantitative results of blood sample proteome based on optimized workflow

3 討論

3.1 樣本前處理結(jié)果比較

血樣蛋白質(zhì)組學(xué)研究首要環(huán)節(jié)是樣本的前處理。定性結(jié)果顯示血漿蛋白鑒定數(shù)最少，保留高豐度蛋白的血清重復(fù)性最低，去除高豐度蛋白的血清蛋白鑒定數(shù)和重復(fù)性最高，提示血清去除高豐度蛋白可提高蛋白鑒定覆蓋率和可靠性。在相同的色譜質(zhì)譜條件和數(shù)據(jù)分析模式下，盡管兩種血清樣品的蛋白鑒定數(shù)和二級(jí)譜圖數(shù)差異不顯著，但去除高豐度蛋白后肽段數(shù)和譜圖匹配顯著數(shù)增加，證實(shí)血清去除高豐度蛋白更適合蛋白質(zhì)組學(xué)研究。定量結(jié)果主成分分析顯示血漿和去除高豐度蛋白的血清組內(nèi)重復(fù)性較好，其中去除高豐度蛋白的血清3次重復(fù)具有最高的聚合度，表明去除高豐度蛋白處理在血清樣本制備中具有一定的合理性，血清去除高豐度蛋白可獲得更高的蛋白鑒定數(shù)和重復(fù)率。綜合比較大鼠血樣前處理樣品的質(zhì)譜鑒定結(jié)果，基于研究效率考慮，后續(xù)酶切和數(shù)據(jù)采集方法比較可采用保留高豐度蛋白血清為樣本，但構(gòu)建優(yōu)化的血液樣本蛋白質(zhì)組分析流程時(shí)宜采用去除高豐度蛋白血清。

3.2 酶切方法比較

酶切是樣本制備的重要環(huán)節(jié)，某些蛋白由于存在二硫鍵和特定空間構(gòu)象，需要通過化學(xué)物質(zhì)或者加熱處理暴露酶切位點(diǎn)，酶切溫度、緩沖液構(gòu)成等條件同樣影響酶切效率。本研究比較了常規(guī)酶切（CD）、45℃孵育（45D）、熱輔助酶切（HD）、二次熱輔助酶切（RHD）、尿素輔助酶切（UD）和變溫酶切（VD）六種方法，發(fā)現(xiàn)酶切效率存在差異。HD法鑒定到的蛋白數(shù)、肽段數(shù)和譜圖匹配數(shù)較其他組高，與前人熱變性后肽段鑒定數(shù)增加的結(jié)果保持一致［10］，表明胰蛋白酶酶切前高溫變性更適用于血清樣本蛋白質(zhì)組分析。胰蛋白酶活性受溫度影響較大，多數(shù)文獻(xiàn)在37℃下酶切，但也有45℃的報(bào)道［13］。45D法相對(duì)CD法在蛋白數(shù)、肽段數(shù)和譜圖匹配數(shù)上較低，說明胰蛋白酶在37℃孵育比45℃酶切效果更佳。RHD相比CD法蛋白數(shù)低但肽段數(shù)高，原因可能是酶切不完全，從而降低蛋白鑒定率。此外，UD法相對(duì)CD法蛋白檢出率低。通常蛋白酶切存在一到多個(gè)位點(diǎn)的遺漏酶切，過高的酶切位點(diǎn)遺漏率會(huì)降低蛋白定量的精密度和準(zhǔn)確度［22］。VD法酶切位點(diǎn)遺漏率最低，表明酶切更充分，但標(biāo)準(zhǔn)差較高，推測原因?yàn)樵诳赡褪艿姆秶鷥?nèi)瞬間加入酶液，在溫度變化的窗口區(qū)間酶活性激發(fā)所致，但實(shí)際操作中溫度難以精確控制，從而導(dǎo)致VD法3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差。此外，HD和VD法在在20%-35%和＞50%的區(qū)間內(nèi)也顯示出更高的蛋白序列覆蓋度，表明兩種方法得到的血清蛋白質(zhì)組定性結(jié)果更可信和準(zhǔn)確。6種酶切方法蛋白定性重復(fù)性差異不明顯，其中45D法定性重復(fù)率略高，但HD法可獲得更高的共有蛋白數(shù)，雖然HD法和VD法的定性重復(fù)性不突出，考慮到蛋白鑒定數(shù)、漏切位點(diǎn)和蛋白序列覆蓋度，這兩種方法更適用于血清蛋白質(zhì)

組分析。除了上述基于定性數(shù)據(jù)的分析外，定量結(jié)果的主成分分析顯示45D和RHD組在PC1（71.78%）的分析中差異較小，而HD和VD組在PC2（14.14%）的分析中差異較小，表明CD法和UD法的定量重復(fù)性相對(duì)較低，45D和RHD更適合血清蛋白質(zhì)組定量分析。綜合6種酶切方法定性定量結(jié)果分析，熱輔助酶切配合變溫酶切更適用血液樣本蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

3.3 DDA與DIA比較

3次質(zhì)譜重復(fù)蛋白鑒定數(shù)的平均值顯示DIA具有更高的蛋白鑒定數(shù)，表明DIA在單次進(jìn)樣中更有優(yōu)勢。在蛋白定性數(shù)據(jù)中，DIA也展示出更好的重復(fù)性，合并后剔除重復(fù)值顯示DDA和DIA蛋白鑒定數(shù)差異不明顯，表明在多次進(jìn)樣的情況下，兩種方法的蛋白定性能力相差不明顯。缺失值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示DIA比DDA平均每組數(shù)據(jù)完整度高出14.21%，提示DIA具有更高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，多數(shù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明相同結(jié)果［23］。另外，若設(shè)定0-15為可信區(qū)間，DIA在蛋白定量上顯示出更低的變異系數(shù)。因此DIA更適用于篩選血樣中的差異表達(dá)蛋白，同時(shí)，標(biāo)記結(jié)合靶向定量因其更高的準(zhǔn)確度、靈敏度和重現(xiàn)性已廣泛應(yīng)用于蛋白翻譯后修飾、蛋白互作等領(lǐng)域［24-25］。研究中DIA仍需參考DDA建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，因此DDA在通量和便捷度上優(yōu)勢明顯。綜上可得，DIA重復(fù)性好且單次質(zhì)譜鑒定蛋白數(shù)高但DDA操作更簡便。

3.4 DIA與PRM比較

DIA和PRM是基于Orbitrap質(zhì)譜的常用靶向定量方法，選取的21組蛋白或相應(yīng)肽段CV值顯示，多數(shù)特異肽段在PRM定量的CV值低于DIA中對(duì)應(yīng)蛋白定量的CV值，提示PRM具有更高的穩(wěn)定性，但在實(shí)際研究中監(jiān)測離子數(shù)目有限，更適用于候選生物標(biāo)志物的驗(yàn)證，DIA和PRM均可用于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析但PRM結(jié)果穩(wěn)定性相對(duì)較高。

3.5 流程優(yōu)化

去除血樣高豐度蛋白有多種方法，評(píng)估各種試劑盒去除高豐度蛋白效率的研究也較多［26-27］，本研究采用ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit去除血清高豐度蛋白，可獲得更高的蛋白鑒定數(shù)和重復(fù)率。常規(guī)酶切方法使用廣泛，但也有很多文獻(xiàn)報(bào)道優(yōu)化的酶切方法，如Lys-C/Trypsin順序酶切［28］、微波和紅外輔助酶切［29］等。本研究發(fā)現(xiàn)熱輔助酶切配合變溫輔助酶切可獲得更好的質(zhì)譜結(jié)果，更適用于血樣蛋白組研究。在數(shù)據(jù)采集模式上，DDA和DIA各有優(yōu)勢，DIA因其較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性，單次質(zhì)譜鑒定蛋白數(shù)高，而DDA無需預(yù)先建立譜圖庫，可直接通過蛋白序列庫搜索從而完成蛋白的定性定量。PRM定量在多數(shù)情況下具有較高的穩(wěn)定性，但單次進(jìn)行靶向分析的蛋白數(shù)目有限，可用于對(duì)目標(biāo)蛋白的相對(duì)和絕對(duì)定量。

綜上所述，進(jìn)行血樣蛋白質(zhì)組分析時(shí)，宜去除高豐度蛋白，采用熱輔助酶切結(jié)合變溫酶切法和DDA數(shù)據(jù)采集模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，定量結(jié)果還可用PRM技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證（圖6）。

圖6 血樣蛋白質(zhì)組樣品制備和分析流程Fig. 6 Sample preparation and analysis workflow for blood proteome

4 結(jié)論

比較血樣蛋白質(zhì)組分析方法發(fā)現(xiàn)，血清樣本去除高豐度蛋白后，經(jīng)熱輔助結(jié)合變溫酶切法酶切，采用DDA數(shù)據(jù)采集模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，可獲得較高的蛋白鑒定覆蓋率和重復(fù)性較好的定性定量結(jié)果，利用PRM技術(shù)還可對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。基于血液樣本蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的比較研究，建立了優(yōu)化的制備和分析流程，為進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)研究創(chuàng)造條件。