DON生物合成的亞細(xì)胞定位和精準(zhǔn)外排研究進(jìn)展

劉馨，方欣，汪爽，王立雯，武德亮，LEE Yin Won，MOHAMED Sherif Ramzy，徐劍宏*，史建榮*

1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，南京210014；

2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；

3.埃及國(guó)家研究中心食品毒理與污染物研究所，埃及 吉薩12411

禾谷鐮刀菌復(fù)合種（Fusarium graminearumspecies complex，F(xiàn)GSC）侵染小麥、玉米等多種谷物，引起糧食減產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。除了減產(chǎn)外，F(xiàn)GSC可以產(chǎn)生多種鐮刀菌毒素，嚴(yán)重威脅糧食食用和飼用安全。我國(guó)小麥及其制品中污染較為嚴(yán)重的鐮刀菌毒素種類包括單端孢霉烯B族毒素脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）及其乙?；苌铮?-acetyldeoxynivalenol,3-ADON和15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）。DON會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成，可引起急性中毒癥狀，包括嘔吐、頭暈和動(dòng)物消瘦、厭食等癥狀，DON還具有免疫毒性、細(xì)胞毒性、致畸性和致癌性[1-2]。為有效控制DON污染對(duì)糧食安全和人畜健康的危害，目前全球37個(gè)國(guó)家或地區(qū)針對(duì)食品或谷物中DON含量設(shè)立了限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017中規(guī)定谷物及其制品中DON限量標(biāo)準(zhǔn)為1 000 μg·kg-1。

為了更好地適應(yīng)環(huán)境，產(chǎn)毒真菌通過產(chǎn)生并分泌包括毒素在內(nèi)的多種次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而影響植物細(xì)胞或其他微生物的重要蛋白生理功能，造成植物或細(xì)胞毒害，成功侵染寄主植物。DON在鐮刀菌侵染小麥等寄主的過程中發(fā)揮重要作用，是一類關(guān)鍵致病因子[3-4]。DON對(duì)擬南芥具有植物毒性（phytotoxicity），會(huì)引發(fā)植物細(xì)胞死亡，抑制抗氧化酶活性相關(guān)基因表達(dá)[5]。相對(duì)應(yīng)地，包括DON在內(nèi)的這些有毒次生代謝產(chǎn)物也會(huì)對(duì)產(chǎn)毒真菌本身具有一定的毒性。因此，產(chǎn)毒真菌需將這些次生代謝物質(zhì)精準(zhǔn)運(yùn)輸至作用部位，通過將有毒次生代謝物質(zhì)的合成局限在某個(gè)亞細(xì)胞器中,或通過細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)及時(shí)將其泵出細(xì)胞外來隔離潛在的毒害，實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)[6]。

本文將綜述現(xiàn)階段產(chǎn)毒鐮刀菌如何避免DON對(duì)菌體細(xì)胞造成的毒性傷害機(jī)制，包括其合成的亞細(xì)胞定位、解毒基因和運(yùn)輸機(jī)制的研究進(jìn)展，有助于有針對(duì)性地破解其解毒機(jī)制，設(shè)計(jì)研發(fā)高效靶向控毒技術(shù)，對(duì)于鐮刀菌毒素的持續(xù)防控和糧食安全、人民生命健康保障具有重要意義。

1 禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中DON生物合成的亞細(xì)胞定位

隨著禾谷鐮刀菌基因組序列的公布和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中DON生物合成途徑較為明確。DON化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)來源于法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的骨架結(jié)構(gòu)[7]。FPP是一種初級(jí)代謝產(chǎn)物中間體，從初始底物乙酰輔酶A到FPP的合成途徑稱為類異戊二烯（isoprenoid）合成途徑。參與FPP到DON合成的TRI基因簇共包含分布在不同染色體上的15個(gè)合成酶編碼基因、1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和途徑特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。這些TRI基因包括位于2號(hào)染色體上的25 kb核心合成基因簇（TRI5基因簇）、1號(hào)染色體上的TRI1-TRI16基因和3號(hào)染色體上的單個(gè)TRI101基因[8-12]，其中TRI6和TRI10是途徑特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

最近，禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中DON生物合成的亞細(xì)胞定位研究有了新的發(fā)現(xiàn)[13-16]。當(dāng)處于離體DON合成誘導(dǎo)條件，或在侵染寄主植物的過程中，菌體產(chǎn)毒基因TRI的表達(dá)水平顯著誘導(dǎo)上調(diào)。在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)液（trichothecene biosynthesis induced,TBI）中鐮刀菌的菌絲形態(tài)發(fā)生改變，菌絲頂端腫脹，形成一種類球形和卵圓形的小泡結(jié)構(gòu)。Tri蛋白定位在一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)泡重組形成的有序平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（organized smooth ER，OSER）上，Menke等將這種特殊的細(xì)胞小囊泡結(jié)構(gòu)（specific cellular vesicles）命名為DON產(chǎn)毒小體（DON-toxisome），并對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了進(jìn)一步的研究[14,17-18]。將分別位于DON生物合成途徑前端和后端的兩個(gè)細(xì)胞色素P-450加氧酶Tri4p與Tri1p分別融合綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）或紅色熒光蛋白（red fluorescent protein,RFP），發(fā)現(xiàn)融合蛋白的熒光信號(hào)與上述3～4 μm大小的囊泡結(jié)構(gòu)共定位。據(jù)此推測(cè)，DON生物合成的酶促反應(yīng)及中間產(chǎn)物定位于DON產(chǎn)毒小體內(nèi)。Isoprenoid合成途徑相關(guān)酶的編碼基因的表達(dá)受到TRI基因簇途徑特異轉(zhuǎn)錄因子TRI6的調(diào)控。羥甲基戊二酸CoA還原酶（Hmr1）是Isoprenoid合成途徑中的關(guān)鍵酶，模式真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的Hmr1p定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外周和核周[19]。禾谷鐮刀菌（F.graminearum）的Hmr1p::GFP在非DON誘導(dǎo)培養(yǎng)條件（基本培養(yǎng)基minimal medium,MM）中培養(yǎng)時(shí)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，綠色熒光信號(hào)微弱，出現(xiàn)在類似產(chǎn)毒小體大小的囊泡結(jié)構(gòu)外周；當(dāng)載有Hmr1p::GFP融合蛋白的菌株置于TBI誘導(dǎo)條件培養(yǎng)24～36 h后，綠色熒光信號(hào)定位到球形和卵圓形小泡結(jié)構(gòu)（產(chǎn)毒小體），并與Tri4p::RFP的紅色熒光共定位[17]。因此，Menke等提出了禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中DON生物的產(chǎn)毒小體來源于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重塑，TRI基因簇定位于該重塑的產(chǎn)毒小體，且證實(shí)參與初生代謝Isoprenoid途徑相關(guān)基因也定位于上述結(jié)構(gòu)[17]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)借助何種外力或能量來源以及如何重塑形成產(chǎn)毒小體的分子機(jī)制目前尚不清楚。

最近浙江大學(xué)馬忠華課題組在解析新藥劑氰烯菌酯作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌F.graminearum藥靶蛋白Ⅰ型分子馬達(dá)肌球蛋白（FgmyosinⅠ）在DON生物合成和產(chǎn)毒小體形成中起重要作用[20]。FgmyosinⅠ功能缺失后，DON產(chǎn)生量顯著降低。真核細(xì)胞中Ⅰ型分子馬達(dá)肌球蛋白MyosinⅠ參與維持細(xì)胞膜動(dòng)態(tài)和結(jié)構(gòu)，在多個(gè)細(xì)胞過程參與細(xì)胞膜與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的鏈接[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中，F(xiàn)gmyosinⅠ通過與核糖體相關(guān)蛋白（ribosome-associated protein）FgAsc1互 作 調(diào) 控DON合成基因TRI1表達(dá)。FgmyosinⅠ參與DON產(chǎn)毒小體形成，但并不參與其他幾種次生代謝產(chǎn)物的生物合成[15]。進(jìn)一步將FgmyosinⅠ與RFP報(bào)告基因構(gòu)建融合蛋白明確其細(xì)胞定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，在非DON產(chǎn)生誘導(dǎo)條件（MM和PDB,potato dextrose broth）下，F(xiàn)gmyosin I-RFP融合紅色熒光信號(hào)彌散分布在菌絲頂端的細(xì)胞質(zhì)中；在產(chǎn)DON誘導(dǎo)條件（TBI）下培養(yǎng)時(shí)，紅色熒光信號(hào)聚集在頂端球形結(jié)構(gòu)中。

為明確FgmyosinⅠ是否定位于產(chǎn)毒小體上，構(gòu)建了1株表達(dá)了FgmyosinⅠ::RFP和Tri1::GFP的融合蛋白菌株，上述菌株在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)下紅色熒光與綠色熒光信號(hào)共定位；免疫共沉淀（Co-IP）和雙熒光互補(bǔ)試驗(yàn)(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)進(jìn)一步證實(shí)了Fgmyosin I和Tri1的細(xì)胞共定位。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gmyosin I與肌動(dòng)蛋白Actin互作，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成過程中起重要作用。利用肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑latrunculin A處理禾谷鐮刀菌菌絲時(shí)發(fā)現(xiàn)，即便在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，菌體也不能產(chǎn)生典型的產(chǎn)毒小體結(jié)構(gòu)，Tri1::GFP熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈彌散狀，DON的合成量顯著降低。隨后，Tang等[16]以Ⅰ型肌球蛋白FgmyosinⅠ或Tri1為誘餌，利用親和性捕獲-質(zhì)譜測(cè)定法分析法證實(shí)肌動(dòng)蛋白的蓋帽蛋白（Actin capping proteins，CAPs）在產(chǎn)毒誘導(dǎo)條件下能與上述蛋白互作，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的產(chǎn)毒小體組分FgCapA和FgCapB。FgCapA和FgCapB形成異質(zhì)二聚體，并與FgMoyI或Tri1互作；FgCapA和FgCapB缺失后產(chǎn)毒小體形成受阻、DON的生物合成量顯著下降，突變體在麥穗上的致病力減弱[16]。

綜上所述，禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的DON生物合成發(fā)生在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)或侵染寄主狀態(tài)下形成的菌絲頂端腫脹囊泡結(jié)構(gòu)，稱為產(chǎn)毒小體，定位于OSER，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組形成。目前已驗(yàn)證包括Tri合成基因、提供DON合成底物的FPP前序Isoprenoid途徑中的Hmr1以及Ⅰ型肌球蛋白FgmyosinⅠ及其互作蛋白蓋帽蛋白CAP和肌動(dòng)蛋白Actin等為產(chǎn)毒小體的重要組分，參與產(chǎn)毒小體的形成，F(xiàn)gMyoⅠ-actin細(xì)胞骨架系統(tǒng)為產(chǎn)毒小體的形成提供機(jī)械能量。

2 Tri12p介導(dǎo)的DON外排解毒機(jī)制

通常情況下，真菌次生代謝產(chǎn)物合成基因成簇中包含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其是跨膜的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（major facilitator superfamily transporters，MFS）[22-23]。禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中DON生物合成TRI基因簇中的TRI12基因編碼一個(gè)含有14個(gè)跨膜功能域的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Tri12p是一類DHA2家族藥劑/質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與多藥抗性和氨基酸吸收相關(guān)[24]。

擬枝孢鐮刀菌（F.sporotrichioides）和禾谷鐮刀菌中缺失TRI12引起單端孢霉烯（trichothecene）合成量顯著下降[25]，TRI12基因缺失突變體在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)受到抑制，表明Tri12與菌體自身的解毒相關(guān)。將擬枝孢鐮刀菌(F.sporotrichioides)的Tri12和編碼trichothecene 15-O-acetyltransferase的Tri3進(jìn)行酵母異源表達(dá)后，如在培養(yǎng)條件中添加Tri3底物15-decalonectrin，與單獨(dú)轉(zhuǎn)化Tri3酵母相比，Tri12和Tri3雙轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)液中能檢測(cè)到濃度更高的乙?；a(chǎn)物calonectrin，進(jìn)一步驗(yàn)證了Tri12作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在DON合成中的跨膜外排功能[26-27]。禾谷鐮刀菌中Tri12p定位在液泡質(zhì)小體和小于1 μm的移動(dòng)小囊泡上，在細(xì)胞中上述小囊泡并非無序排列，而是交替排列在球狀的產(chǎn)毒小體周邊，Tri12p定位的小囊泡在液泡與產(chǎn)毒小體之間來回移動(dòng)。隨后，酸化的Tri12p定位所在的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)如移動(dòng)小囊泡和液泡內(nèi)開始合成DON。禾谷鐮刀菌受誘導(dǎo)產(chǎn)毒后，培養(yǎng)液會(huì)急劇酸化，推測(cè)pH的改變可為Tri12p跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)DON提供便利[28]。

綜上所述，禾谷鐮刀菌中DON的合成與外排可能涉及不同的亞細(xì)胞定位，DON的生物合成發(fā)生在由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重組形成的球狀產(chǎn)毒小體（toxisome）中，通過將產(chǎn)毒過程局限在亞細(xì)胞器中從而避免菌體受到DON及其合成中間產(chǎn)物的毒害，而Tri12p定位的移動(dòng)小囊泡在環(huán)境酸堿值改變的協(xié)助下，將合成的DON分子儲(chǔ)存在液泡或質(zhì)膜內(nèi)，或通過胞吐作用（exocytosis）將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[23]。

3 Tri101p介導(dǎo)的DON乙酰化解毒機(jī)制

除了Tri12p外，乙酰轉(zhuǎn)移酶Tri101p通過催化異單端孢黃醇C3位置的羥基乙酰化，生成乙酰異單端孢黃醇（isotrichodermin），一定程度上降低了DON對(duì)菌體的毒性[29]。Kimura等[30]將禾谷鐮刀菌的FgTRI101基因在釀酒酵母（S.cerevisiae）中異源表達(dá)，重組酵母細(xì)胞對(duì)單端孢霉烯族類T-2毒素的抗性增強(qiáng)，且FgTRI101基因在T-2毒素處理后誘導(dǎo)表達(dá)。此外，異源表達(dá)了F.sporotrichioides的TRI101基因的釀酒酵母細(xì)胞對(duì)另一種單端孢霉烯毒素二乙酰氧辛烯醇（diacetoxyscirpenol，DAS）更耐受[31]。將TRI101基因轉(zhuǎn)至植物中，DAS和DON對(duì)轉(zhuǎn)TRI101基因的煙草、水稻和小麥的植物毒性降低，且轉(zhuǎn)基因植株的抗病性也顯著提升[26,32-33]。然而，將F.sporotrichioides的TRI101基因敲除后，不會(huì)像TRI12基因缺失突變體一樣，在產(chǎn)毒誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下表現(xiàn)生長(zhǎng)缺陷[27]。

4 其他DON解毒/外排機(jī)制

除了Tri12p介導(dǎo)的外排和Tri101p介導(dǎo)的乙?；舛緳C(jī)制外，Wang等[26]最近報(bào)道禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中還存在其他形式的解毒途徑。將TRI12和TRI101基因雙缺失后，DON處理未對(duì)突變體的菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用，預(yù)示著其他解毒形式的存在。隨后通過比較DON處理和環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，一類蛋白質(zhì)合成抑制劑）處理后的禾谷鐮刀菌(F.graminearum)轉(zhuǎn)錄組差異發(fā)現(xiàn)，包括Tri12在內(nèi)的15個(gè)編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及參與γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）代謝基因在DON處理組特異上調(diào)，推測(cè)其可能參與DON的外排，在菌體對(duì)DON的自我保護(hù)過程中起作用。

5 展望

典型真菌次生代謝合成基因簇（biosynthesis gene clusters,BGCs）通常不僅包括骨架基因在內(nèi)的合成基因和調(diào)控基因來合成目標(biāo)SMs(secondary metabolites)，往往還配備用于自我保護(hù)的外排或解毒機(jī)制，免受具有不同生物活性的SMs或其中間產(chǎn)物的毒害。絲狀真菌對(duì)特定SMs的自我保護(hù)機(jī)制主要包括將合成局限在某個(gè)亞細(xì)胞器內(nèi)和精準(zhǔn)外排等。未來，隨著更多產(chǎn)毒真菌SMs自我保護(hù)機(jī)制的解析揭示和對(duì)比研究，將為有針對(duì)性地破解產(chǎn)毒真菌的解毒機(jī)制，設(shè)計(jì)研發(fā)高效靶向控毒技術(shù)提供理論依據(jù)和分子靶標(biāo)，對(duì)于真菌毒素的持續(xù)防控和保障糧食安全和人民生命健康具有重要意義。